高寅潔，禹松林，尹逸叢，崔云英，張玉石，邱 玲，童安莉*

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 1.內(nèi)分泌科 國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)內(nèi)分泌重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.檢驗(yàn)科 疑難重癥及罕見(jiàn)病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3.泌尿外科，北京 100730)

醛固酮產(chǎn)生腺瘤(aldosterone producing adenoma，APA)是原發(fā)性醛固酮增多癥(primary aldoster-onism，PA)的第二大病因，主要是由于KCNJ5、ATP2B3、ATP1A1和CACNA1D等體細(xì)胞基因突變所致。以上突變均會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜電位變化，使細(xì)胞去極化，激活細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)，從而促進(jìn)醛固酮分泌。由于鈣通道激活是APA中醛固酮合成分泌增多的主要機(jī)制，因此用鈣通道阻滯劑(calcium channel blocker，CCB)能夠阻斷APA的醛固酮分泌。既往研究已證實(shí)CCB能減少人腎上腺皮質(zhì)腺癌細(xì)胞系NCI-H295R以及原代培養(yǎng)APA細(xì)胞的醛固酮分泌[1-2]，但其對(duì)于除醛固酮外其他類固醇激素的作用尚無(wú)文獻(xiàn)證實(shí)。

近幾年，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)被認(rèn)為是檢測(cè)類固醇激素譜的金標(biāo)準(zhǔn)[3]。本研究旨在以原代培養(yǎng)細(xì)胞為模型，借助LC-MS/MS方法，探究L型CCB藥物維拉帕米(verapamil)處理前后，原代APA細(xì)胞的多種類固醇激素水平的差異。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 對(duì)象：取材來(lái)自于北京協(xié)和醫(yī)院2021年3月手術(shù)的伴有低鉀血癥的APA患者的腫瘤組織。APA診斷標(biāo)準(zhǔn)參考國(guó)際內(nèi)分泌學(xué)會(huì)臨床實(shí)踐指南[4]。本研究經(jīng)北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào): JS-1595和JS-1596)，所有對(duì)象及其監(jiān)護(hù)人均簽署了知情同意書(shū)。

1.1.2 藥物/試劑：Ⅰ型膠原酶(Gibco公司)；DMEM/F12培養(yǎng)基(Hyclone公司)；標(biāo)準(zhǔn)級(jí)胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；青鏈霉素(×100)、1×PBS和紅細(xì)胞裂解液(北京索萊寶科技有限公司)；維拉帕米(verapamil)(MedChemExpress公司)；組織DNA提取試劑盒(Omega公司)；2×GoldStar Best MasterMix(康為世紀(jì)生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 資料的收集：收集患者基本情況、平均診斷年齡、高血壓病程及最高收縮壓/舒張壓、低血鉀病程及最低血鉀、腫瘤位置、腫瘤最大直徑和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果[術(shù)前立位醛固酮、血管緊張素Ⅱ及腎素活性(renin activity，PRA)，血總皮質(zhì)醇、促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropic hormone,ACTH)及24 h尿游離皮質(zhì)醇(24h-UFC)]等。

1.2.2 腫瘤組織KCNJ5熱點(diǎn)突變檢測(cè)：提取患者組織DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增及Sanger測(cè)序，用以檢測(cè)兩種常見(jiàn)的KCNJ5基因突變G151R及L168R。擴(kuò)增及測(cè)序引物如下：上游引物F：5′-CGCTTCAAC TTGCTCGTCTT-3′，下游引物R：5′-ATGAACTCCCCC TCTTTGGT-3′。擴(kuò)增產(chǎn)物送北京諾賽基因組研究中心測(cè)序，結(jié)果比對(duì)NCBI網(wǎng)站KCNJ5序列(參考?jí)A基序列NM_000890.5，參考蛋白序列NP_000881.3)。

1.2.3 原代培養(yǎng)人APA細(xì)胞的方法[5]參考已發(fā)表文獻(xiàn)。

1.2.4 CCB維拉帕米處理原代培養(yǎng)人APA細(xì)胞：原代培養(yǎng)細(xì)胞于6孔板培養(yǎng)2～4 d，實(shí)驗(yàn)組加入終濃度為10 μmol/L和50 μmol/L的維拉帕米。藥物處理48 h，收取培養(yǎng)液，于-20 ℃保存，用于LC-MS/MS檢測(cè)類固醇激素譜。

1.2.5 LC-MS/MS檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液類固醇激素譜：LC-MS/MS檢測(cè)方法參考已發(fā)表文獻(xiàn)[6]。檢測(cè)類固醇包括孕烯醇酮(pregnenolone)、孕酮(progesterone)、11-脫氧皮質(zhì)酮(11-deoxycorticosterone)、皮質(zhì)酮(corticosterone)、醛固酮(aldosterone)、17-羥-孕烯醇酮(17-OH-pregnenolone)、17α-羥-孕酮(17a-hydroxyprogesterone)、11-脫氧皮質(zhì)醇(11-deoxycortisol)、皮質(zhì)醇(cortisol)、21-脫氧皮質(zhì)醇(21-deoxycortisol)、可的松(cortisone)、脫氫表雄酮(dehydroepipiandrosterone,DHEA)、雄烯二酮(androstenedione)、睪酮(testosterone)、雙氫睪酮(dihydrotestosterone,DHT)、硫酸脫氫表雄酮(dehydroepipiandrosterone sulfate,DHEA-S)、18-氧-皮質(zhì)醇(18-oxocortisol,18-OXOF)、雌酮(estrone,E1)、雌二醇(estradiol,E2)、雌三醇(estriol,E3)、18-羥-皮質(zhì)醇(18-hydroxycortisol,18-OHF)、11β-羥-睪酮(11 beta-hydroxytestosterone,11β-OHT)和11-酮-睪酮(11-ketotestoster-one,11-KT)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 基本情況

6例APA患者手術(shù)切除組織被成功培養(yǎng)，患者的基本臨床資料見(jiàn)表1。6例患者均接受了腎上腺腫瘤切除術(shù)，術(shù)后病理提示為腎上腺皮質(zhì)腺瘤。術(shù)后6個(gè)月隨訪患者高血壓均一定程度緩解，血鉀均恢復(fù)至正常水平。

表1 原代培養(yǎng)人APA細(xì)胞取材患者的臨床資料

2.2 KCNJ5突變檢出情況

6例患者組織提取DNA并進(jìn)行KCNJ5熱點(diǎn)突變位置測(cè)序，5例患者攜帶KCNJ5熱點(diǎn)突變p.G151R，其中2例檢出突變c.451G>C, p.G151R，3例檢出突變c.451G>A, p.G151R(圖1)。

A.position indicated by the arrow is c.451G>C; B.position indicated by the arrow is c.451G>A

2.3 LC-MS/MS檢測(cè)類固醇激素譜

維拉帕米 50 μmol/L組醛固酮水平低于維拉帕米 10 μmol/L組低于對(duì)照組(P<0.01)。6例原代培養(yǎng)APA細(xì)胞維拉帕米 10 μmol/L組和維拉帕米 50 μmol/L組與對(duì)照組相比，平均醛固酮下降百分?jǐn)?shù)分別為48.2%和82.0%。

維拉帕米 10 μmol/L組的11-脫氧皮質(zhì)酮、孕烯醇酮和孕酮水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。維拉帕米 50 μmol/L組和維拉帕米10 μmol/L組的18-氧-皮質(zhì)醇和18-羥-皮質(zhì)醇水平均低于對(duì)照組(P<0.05)。

除了鹽皮質(zhì)激素外，各組間糖皮質(zhì)激素包括皮質(zhì)醇和可的松的水平也存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，維拉帕米 50 μmol/L組和維拉帕米10 μmol/L組的皮質(zhì)醇水平均低于對(duì)照組(P<0.05)；維拉帕米 10 μmol/L組的可的松和17α-羥-孕酮水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

性激素方面，維拉帕米 50 μmol/L組硫酸脫氫表雄酮水平低于維拉帕米 10 μmol/L組低于對(duì)照組(P<0.05)；維拉帕米 50 μmol/L組和維拉帕米10 μmol/L組的11-羥-睪酮水平均低于對(duì)照組(P<0.05)。各組間其余類固醇激素水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

表2 LC-MS/MS檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)液類固醇激素水平的差異

3 討論

既往研究表明，L型CCB維拉帕米可以濃度依賴方式減少血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)或KCNJ5突變型細(xì)胞的醛固酮合成，以及醛固酮合成酶CYP11B2 mRNA和蛋白的表達(dá)[7]。本課題組曾成功培養(yǎng)1例KCNJ5突變的患者增生的腎上腺組織，結(jié)果顯示維拉帕米 10 μmol/L處理可顯著抑制醛固酮的合成[8]。本研究以6例APA體外原代培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)維拉帕米藥物處理對(duì)醛固酮分泌的抑制作用明確，未來(lái)是否可以用于APA的輔助治療有待進(jìn)一步體內(nèi)研究證實(shí)。

本研究發(fā)現(xiàn)CCB藥物除了能夠減少醛固酮的分泌外，對(duì)于原代培養(yǎng)的APA細(xì)胞的其他多種類固醇激素均有顯著的抑制作用。這與既往研究結(jié)果一致，由于KCNJ5突變APA存在腎上腺球狀帶和束狀帶混合表型，腎上腺束狀帶細(xì)胞在CYP11B2的作用下將11-脫氧皮質(zhì)醇代謝為18-氧-皮質(zhì)醇和18-羥-皮質(zhì)醇[9]。然而，經(jīng)較高濃度維拉帕米處理后部分類固醇激素出現(xiàn)“反跳”，如孕烯醇酮、孕酮、11-脫氧皮質(zhì)酮和11-酮-睪酮等在維拉帕米10 μmol/L濃度下可被抑制，但在維拉帕米50 μmol/L濃度下分泌增加而高于其他兩組。研究表明，維拉帕米除了能夠抑制鈣通道，同樣也能夠抑制MDR1/P-glycoprotein蛋白(ABCB1編碼)，而該蛋白的異常表達(dá)會(huì)干擾人類固醇激素分泌和清除過(guò)程中的平衡[10]。既往文獻(xiàn)也指出ABCB1的多態(tài)位點(diǎn)能夠影響皮質(zhì)醇和醛固酮的分泌水平[11]以及腎素-血管緊張素系統(tǒng)的活性[12]。因此，猜測(cè)這種“反跳”現(xiàn)象的出現(xiàn)可能與維拉帕米的多靶點(diǎn)有關(guān)。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)原代培養(yǎng)APA細(xì)胞存在網(wǎng)狀帶激素的分泌，如雄烯二酮、睪酮、硫酸脫氫表雄酮、11-羥-睪酮和11-酮-睪酮等。且CCB藥物對(duì)原代培養(yǎng)的APA細(xì)胞的硫酸脫氫表雄酮和11-羥-睪酮同樣也有明顯的抑制作用。CCB藥物抑制APA細(xì)胞腎上腺來(lái)源的性激素分泌的原因尚不清楚，未來(lái)仍需要進(jìn)一步研究。

綜上，CCB藥物除了能夠抑制原代培養(yǎng)APA 細(xì)胞的醛固酮分泌外，對(duì)其他多種類固醇激素，如醛固酮前體物質(zhì)11-脫氧皮質(zhì)酮、皮質(zhì)醇以及代謝產(chǎn)物18-氧-皮質(zhì)醇和18-羥-皮質(zhì)醇均有顯著的抑制作用。APA患者的類固醇激素譜特征及CCB藥物在輔助治療中的作用有待體內(nèi)研究證實(shí)。