袁 軍，韓 虎，董 巍，王瑞倉(cāng)，郝洪嶺*，張學(xué)軍

(河北省人民醫(yī)院 1.血液科；2.急診科，河北 石家莊 050055；3.石家莊市第三醫(yī)院 心內(nèi)科，河北 石家莊 050000；4.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院 血液內(nèi)科，河北 石家莊 050055)

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma)是非霍奇金淋巴瘤常見(jiàn)的類(lèi)型，病發(fā)率約占35%左右，具有高度侵襲、轉(zhuǎn)移特性，目前臨床治療方案對(duì)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者難以治愈[1]。中藥土槿皮是松科金錢(qián)松屬植物金錢(qián)松[Pseudolarixamabilis(J. Nelson)Rehd]的根皮或近根處莖皮，化學(xué)成分含量豐富，土槿皮乙酸(pseudolaric acid B，PAB)是從土槿皮內(nèi)提出的新型二萜類(lèi)酸，已在肺癌、肝癌等取得了一定的研究基礎(chǔ)[2-3]。研究表明，PAB可能通過(guò)下調(diào)PAX2抑制宮頸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移并誘導(dǎo)凋亡[4]，但是對(duì)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤研究尚不清楚。miR-4282是非編碼RNA的一種轉(zhuǎn)錄因子，具有抑制在癌中作用[5]，如在miR-4282在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織和細(xì)胞中表達(dá)降低，其過(guò)表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移，促進(jìn)凋亡[6]，但是關(guān)于miR-4282對(duì)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的研究作用還不清楚。關(guān)于PAB和miR-4282調(diào)控作用尚不可知，鑒于此，本研究以人彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系SU-DHL-4為研究對(duì)象，探討PAB是否通過(guò)調(diào)控miR-4282的表達(dá)影響人彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的增殖和凋亡。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑

人彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系SU-DHL-4(中科院上海細(xì)胞研究中心)；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基(杭州四季青生物科技有限公司)；miR-NC、miR-4282、anti-miR-NC、anti-miR-4282、引物(上海吉瑪公司制藥技術(shù)有限公司)；PAB(純度≥98%,Sigma-Aldrich公司)；Lipofectamine 2000試劑盒(上海恪敏生物科技有限公司)；Ki-67抗體、cleaved caspase-3抗體、cleaved caspase-9抗體、GAPDH抗體和辣根酶標(biāo)記的二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；Trizol試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒(賽默飛世爾科技公司)；凋亡試劑盒、CCK-8試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分組：將SU-DHL-4細(xì)胞用10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基內(nèi)，在體積分?jǐn)?shù)為5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育。取對(duì)數(shù)期SU-DHL-4細(xì)胞接種6孔板，細(xì)胞匯合度為70%，用PAB濃度5、10、20 μmol/L培養(yǎng)細(xì)胞，記為PAB-L組、PAB-M組、PAB-H組，其中未經(jīng)PAB處理作為對(duì)照組；按照Lipofectamine 2000試劑盒說(shuō)明書(shū)將miR-NC、miR-4282轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，記為miR-NC組、miR-4282組；將anti-miR-NC、anti-miR-4282轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，用20 μmol/L PAB培養(yǎng)細(xì)胞，記為(PAB+anti-miR-NC)組、(PAB+anti-miR-4282)組。

1.2.2 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率：取細(xì)胞重懸接種96孔板中，按照上述方式處理細(xì)胞，培養(yǎng)48 h時(shí)每孔中加入10 μL CCK-8試劑，4 h后，用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測(cè)SU-DHL-4細(xì)胞的吸光度值，并計(jì)算細(xì)胞抑制率。

1.2.3 流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率：培養(yǎng)細(xì)胞24 h時(shí)，使用PBS洗滌細(xì)胞，將細(xì)胞調(diào)整為1×105個(gè)細(xì)胞，重懸后依次加入annexin-V- FITC和PI各5 μL，避光環(huán)境下孵育15 min，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組SU-DHL-4細(xì)胞凋亡情況。

1.2.4 Western blot檢測(cè)Ki-67、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9蛋白表達(dá)：采用RIPA裂解液提取各組SU-DHL-4細(xì)胞總蛋白，并使用BCA試劑盒測(cè)定純度，然后通過(guò)SDS-PAGE分離等量的蛋白樣品，轉(zhuǎn)膜上后利用脫脂奶粉對(duì)膜封閉1.5 h，添加cleaved caspase-3、Ki-67、cleaved caspase-9、GAPDH一抗，4 ℃冰箱過(guò)夜孵育，加入辣根酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1.5h，滴加ECL顯色，曝光。應(yīng)用Quantity One分析蛋白條帶吸光度值，以GAPDH作為內(nèi)參。

1.2.5 RT-qPCR檢測(cè)miR-4282表達(dá)：1 mL Trizol提取細(xì)胞總RNA，檢測(cè)RNA濃度和純度，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板，配置Premix Taq 12.5 μL，2.0 μL cDNA，上、下游引物各0.5 μL，雙蒸水9.5 μL，進(jìn)行擴(kuò)增。使用2-△△Ct法計(jì)算miR-4282相對(duì)表達(dá)量，用U6作為內(nèi)參基因。miR-4282上游引物: 5′-ATGTG GCAGATCCCACAGGAGTTT-3′，下游引物: 5′-ACT GGGTTTGACTTCGTAGCCCTT-3′；U6上游引物： 5′-CCTGGCACCCAGCACAAT-3′，下游引物: 5′-TGC CGTAGGTGTCCCTTTG-3′。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 PBA對(duì)SU-DHL-4細(xì)胞增殖及蛋白Ki-67表達(dá)的影響

PAB-L組、PAB-M組、PAB-H組SU-DHL-4細(xì)胞抑制率顯著高于對(duì)照組，蛋白Ki-67表達(dá)顯著低于對(duì)照組(P<0.05)(圖1，表1)。

表1 PBA對(duì)SU-DHL-4細(xì)胞抑制率及蛋白Ki-67表達(dá)的影響

圖1 Ki-67蛋白表達(dá)

2.2 PBA對(duì)SU-DHL-4細(xì)胞凋亡及蛋白leaved caspase-3、cleaved caspase-9表達(dá)的影響

PAB-L組、PAB-M組、PAB-H組與對(duì)照組相比，凋亡率、蛋白cleaved caspase-3、cleaved caspase-9表達(dá)顯著升高(P<0.05)(表2,圖2)。

A.apoptosis-related protein expression; B.flow cytogram of apoptosis

表2 PBA對(duì)SU-DHL-4細(xì)胞凋亡率及蛋白cleaved caspase-3、cleaved caspase-9表達(dá)的影響

2.3 PBA對(duì)SU-DHL-4細(xì)胞miR-4282表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，PAB-L組、PAB-M組、PAB-H組miR-4282相對(duì)表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)(表3)。

表3 PBA對(duì)SU-DHL-4細(xì)胞miR-4282表達(dá)的影響

2.4 miR-4282過(guò)表達(dá)對(duì)SU-DHL-4細(xì)胞增殖和凋亡的影響

與miR-NC組相比，miR-4282組miR-4282相對(duì)表達(dá)量顯著增加(P<0.05)，細(xì)胞抑制率、凋亡率顯著增加(P<0.05)，Ki-67蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，蛋白cleaved caspase-3、cleaved caspase-9表達(dá)明顯升高(P<0.05)(圖3，表4)。

A.expression of proliferation and apoptosis-related proteins; B.flow cytometry of apoptosis

表4 miR-4282過(guò)表達(dá)對(duì)SU-DHL-4細(xì)胞增殖和凋亡的影響

2.5 抑制miR-4282表達(dá)減輕了PBA(20 μmol/L)對(duì)SU-DHL-4細(xì)胞增殖和凋亡的影響

與PAB+anti-miR-NC組相比，PAB+anti-miR-4282組miR-4282相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞抑制率、凋亡率顯著降低(P<0.05)，Ki-67蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)，蛋白cleaved caspase-3、cleaved caspase-9表達(dá)明顯下降(P<0.05)(圖4，表5)。

A.expression of proliferation and apoptosis-related proteins; B.flow cytometry of apoptosis

表5 抑制miR-4282表達(dá)減輕了PBA對(duì)SU-DHL-4細(xì)胞增殖和凋亡的作用

3 討論

研究顯示，PAB對(duì)癌細(xì)胞有增殖抑制和凋亡促進(jìn)的作用[7]。PAB可促進(jìn)人腎癌細(xì)胞A498凋亡[8]。在胰腺癌研究中PAB呈劑量依賴(lài)抑制胰腺癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡[9]。還有研究發(fā)現(xiàn)，PAB促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡[10]。以上說(shuō)明PAB具有良好的抗腫瘤作用，但對(duì)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤研究不清楚。因此，本研究使用不同濃度PAB處理人彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系SU-DHL-4。結(jié)果顯示，細(xì)胞抑制率、凋亡率呈劑量依賴(lài)性增加，Ki-67蛋白表達(dá)降低，cleaved caspase-3、cleaved caspase-9蛋白增加,提示PAB可抑制SU-DHL-4細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡。

微RNA(microRNA,miRNA)廣泛存在真核細(xì)胞中，在不同組織或細(xì)胞內(nèi)差異表達(dá)，起著促癌或抑癌的作用，且參與細(xì)胞發(fā)育、增殖、凋亡等過(guò)程[11-12]。miR-4282是一種抑癌基因，在乳腺癌組織和細(xì)胞中下調(diào)表達(dá)，具有抑制細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移并誘導(dǎo)凋亡的作用[13]。在胰腺癌研究中發(fā)現(xiàn)，miR-4282在胰腺癌組織和細(xì)胞中低表達(dá)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，過(guò)表達(dá)miR-4282可抑制胰腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲[14]。在結(jié)直腸癌研究中發(fā)現(xiàn)，miR-4282表達(dá)降低，過(guò)表達(dá)miR-4282能有效抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移[15]。提示miR-4282在腫瘤中起著抑制作用，但是關(guān)于miR-4282在人彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中的研究尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，PAB處理SU-DHL-4細(xì)胞后，miR-4282表達(dá)增加，過(guò)表達(dá)miR-4282抑制SU-DHL-4細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抑制miR-4282表達(dá)可減弱PAB對(duì)SU-DHL-4細(xì)胞增殖和凋亡的作用，提示PAB通過(guò)調(diào)控miR-4282影響人彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤發(fā)生。

綜上所述，PAB可能通過(guò)調(diào)控miR-4282促進(jìn)人彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系凋亡，抑制其增殖。本實(shí)驗(yàn)研究還存在不足之處，如對(duì)于miR-4282可能相關(guān)的靶基因及體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)還需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)探究。