李嘉晉，劉 軍，何松于，諶浩云

(綿陽市人民醫(yī)院 1.急救部； 2.重癥醫(yī)學(xué)科， 四川 綿陽 621000)

膿毒癥(sepsis)是因感染引起的全身性炎性反應(yīng)。有文獻證實，多數(shù)膿毒癥患者會出現(xiàn)急性肺損傷(acute lung injury,ALI)，且其發(fā)病率最高[1]。miR-27a是在2001年首次被發(fā)現(xiàn)的，其在多種炎性狀態(tài)下表達上調(diào)，廣泛參與機體抗炎免疫反應(yīng)，但其膿毒癥多導(dǎo)致的急性肺損傷的作用機制目前還尚不明確[2-3]。過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator activated receptor，PPARs)屬于配體依賴型核轉(zhuǎn)錄因子，PPAR-γ是PPARs家族的一種亞型，且PPAR-γ是近些年研究的熱點[4-5]。過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferator activated receptor γ，PPAR-γ)可作用于多個靶基因調(diào)節(jié)細胞的分化、增殖及凋亡等，有抗炎、抗腫瘤等多種生物學(xué)作用[6]。本文探究下調(diào)miR-27a對膿毒癥大鼠肺損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：SPF級雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量(200±20)g[重慶醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，動物許可證號：SYXK(渝)2017-0023]。

1.1.2 試劑：轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM3000(Invitrogen公司)；miR-27a inhibitor試劑(上海吉瑪基因有限公司)；TNF-α、IL-6的ELISA試劑盒(武漢艾美捷科技有限公司)；小鼠抗PPAR-γ多克隆抗體(Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物的分組及處理：將大鼠分為4組，假手術(shù)組：尾靜脈注射10 μL 0.9%氯化鈉溶液7 d(sham組)，膿毒癥大鼠模型組：尾靜脈注射10 μL 0.9%氯化鈉溶液7 d，用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)制備膿毒癥大鼠肺損傷模型(sepsis組)：空質(zhì)粒組：膿毒癥大鼠模型尾靜脈注射10 μL miR-27a NC質(zhì)粒7 d(NC組)，質(zhì)粒組：尾靜脈注射10 μL miR-27a inhibitor質(zhì)粒7 d(miR-27a組)，每組10只。制模前禁食12 h。

1.2.2 標本的采集：消毒大鼠皮膚后開腹，將腹主動脈完全分離，采取并收集5 mL腹主動脈血于離心管中，12 000 r/min離心10 min分離血清，-20 ℃環(huán)境中保存待用。消毒皮膚后開腹，取出大鼠肺組織并置于消毒的凍存管中，保存于-80 ℃冰箱中待用。

1.2.3 ELISA檢測炎性因子及氧化應(yīng)激因子含量：ELISA檢測各組大鼠血清中TNF-α、IL-6含量，以及丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性。步驟均按照試劑盒說明嚴格操作。

1.2.4 檢測肺水腫程度：取各組大鼠右肺組織，吸干肺組織表面的水分和血液，稱濕重(W)，將組織置于70 ℃烘烤箱內(nèi)烘干72 h至恒重，稱取烘干后的重量，即為干重(D)，計算各組大鼠肺組織濕質(zhì)量/干質(zhì)量比值(W/D)。

1.2.5 HE染色觀察肺組織病理學(xué)變化：取各組大鼠肺組織，石蠟包埋，切成10 μm的薄片，脫蠟后酒精復(fù)水，蘇木精染色并封片，于顯微鏡下觀察。

1.2.6 免疫組化檢測肺組織中PPAR-γ表達：將肺組織切片中加入抗原修復(fù)液，98 ℃環(huán)境中修復(fù)15 min，清洗并封閉組織，加入PPAR-γ蛋白一抗，4 ℃環(huán)境孵育過夜。加入生物素標記的二抗，37 ℃環(huán)境中孵育30 min，于組織在內(nèi)滴加DAB溶液，蘇木素復(fù)染后脫水，懸掛晾干后封片，觀察組織中PPAR-γ表達。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡檢測肺組織中miR-27a、PPAR-γ蛋白表達：取各組大鼠肺組織并裂解，研磨組織制成均漿，離心，收集上清液并測定總蛋白質(zhì)含量。取30 μg蛋白質(zhì)上樣煮沸、電泳、PVDF膜轉(zhuǎn)印。封閉組織后加入一抗和二抗，充分混勻后孵育5 min，GABA一抗稀釋液加入到組織中，充分混勻后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，成像、顯色，測定蛋白質(zhì)吸光度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清中炎性因子含量及氧化應(yīng)激水平比較

和sham組相比，sepsis組大鼠血清中TNF-α、IL-6含量均顯著增加(P<0.05)；miR-27a組血清中TNF-α、IL-6含量較sepsis組顯著降低(P<0.05)；和sham組相比，sepsis組大鼠血清中MDA含量顯著升高，SOD活性顯著降低(P<0.05)；miR-27a組血清中MDA含量低于sepsis組，SOD活性明顯升高(P<0.05)(表1)。

表1 各組大鼠血清中TNF-α、IL-6含量及MDA、SOD活性比較

2.2 各組大鼠肺組織濕/干(W/D)值比較

Sepsis組肺組織濕/干重比值較sham組增加顯著(P<0.05)，miR-27a組大鼠肺組織濕/干重比值較sepsis組減少(P<0.05)(圖1)。

*<0.05 compared with the sham group；△P<0.05 Compared with the sepsis group

2.3 各組大鼠肺組織病理學(xué)變化比較

Sepsis組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)嚴重破壞，病變呈彌漫性改變，肺泡膨脹不全、肺泡融合或塌陷，肺泡間隔較厚，肺間質(zhì)大量炎性細胞浸潤或出血；miR-27a組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)得到明顯改善(圖2)。

圖2 各組大鼠肺組織HE染色

2.4 免疫組化比較肺組織中PPAR-γ表達

Sepsis組肺組織內(nèi)PPAR-γ表達陽性的血管內(nèi)皮細胞、肺泡上皮細胞和巨噬細胞明顯少于sham組(P<0.05)；miR-27a組大鼠肺組織中PPAR-γ表達陽性的血管內(nèi)皮細胞、肺泡上皮細胞和巨噬細胞較sepsis組明顯增加(P<0.05)(圖3)。

圖3 各組大鼠肺組織中PPAR-γ表達的免疫組化染色

2.5 蛋白質(zhì)印跡比較肺組織中miR-27a、PPAR-γ蛋白表達

Sepsis組和NC組大鼠肺組織中miR-27a表達高于sham組，而PPAR-γ蛋白表達低于sham組(P<0.05)；miR-27a組大鼠肺組織中miR-27a表達較sepsis組明顯減少，而PPAR-γ蛋白表達增多(P<0.05)(圖4)。

*P<0.05 compared with the sham group；△P<0.05 compared with the sepsis group

3 討論

膿毒癥可導(dǎo)致機體各個臟器機能衰退，以急性肺損傷最常見。急性肺損傷是一種急性、彌漫性肺部炎性反應(yīng)，增加肺血管的通透性和肺質(zhì)量，減少參與正常通氣的肺組織。近年來研究顯示，miR-27a在多種炎性狀態(tài)下表達上調(diào)，可見miR-27a廣泛參與調(diào)節(jié)機體抗炎免疫反應(yīng)[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-27a在膿毒癥大鼠中的表達高于正常對照組，進一步在小鼠肺上皮細胞中敲除miR-27a，發(fā)現(xiàn)敲除miR-27a的小鼠肺上皮細胞的炎性因子TNF-α、IL-6的表達水平顯著下調(diào)，減輕了炎性反應(yīng)[8]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，敲除miR-27a后膿毒癥大鼠肺組織中miR-27a得到抑制，且大鼠降低大鼠肺濕/干重比值，和上述結(jié)果一致。

TNF-α、IL-6是瀑布樣炎性反應(yīng)最早期的細胞因子，對病情的嚴重程度進行有效反應(yīng)。膿毒癥炎性反應(yīng)發(fā)生時，會增加細胞內(nèi)活性氧(ROS)的產(chǎn)生，攻擊生物膜中的多價不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致最終產(chǎn)物MDA的形成，機體會通過MDA來反應(yīng)ROS攻擊損傷的嚴重程度。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)膿毒癥模型大鼠出現(xiàn)了強烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)。有研究證實，miR-27a上調(diào)能誘導(dǎo)糖尿病腎病內(nèi)置網(wǎng)應(yīng)激和相應(yīng)的足細胞損傷，其機制為刺激炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激及營養(yǎng)缺乏等，敲除miR-27a表達能抑制糖尿病腎病大鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)，本研究結(jié)果和上述研究結(jié)果一致[9-10]。

PPAR-γ是依賴配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，屬于核激素受體超家族，在1990年被首次發(fā)現(xiàn)。PPAR-γ有4個亞型，不同組織中PPAR-γ亞型具有不同的生物學(xué)作用，參與體內(nèi)糖穩(wěn)定、脂肪代謝、細胞分化與凋亡并且具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，PPAR-γ主要存在于脂肪組織，表達于多種細胞中，進一步的研究表明，PPAR-γ在肺泡上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞和巨噬細胞中發(fā)揮著抗炎作用，具有防治急性肺損傷作用。研究發(fā)現(xiàn)，過氧化物酶體增殖物激活受體-γ激動劑能夠改善膿毒癥導(dǎo)致的內(nèi)皮損傷，其機制可能與其穩(wěn)定血管內(nèi)皮細胞，改善嚴重炎癥反應(yīng)和凝血功能紊亂有關(guān)[11]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥大鼠模型肺組織中PPAR-γ蛋白表達均顯著降低，miR-27a干預(yù)后大鼠肺組織中PPAR-γ蛋白表達得到明顯的提高,和上述研究結(jié)果一致。

綜上所述，下調(diào)miR-27a表達可通過降低炎性反應(yīng)，改善氧化應(yīng)激指標，抑制PPAR-γ表達來減輕膿毒癥大鼠肺損傷。