董 輝，王婷婷，馬曉紅，馬盛宗，丁永慧

(寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 1.醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院； 2.臨床醫(yī)學(xué)院； 3.婦科，寧夏 銀川 750004)

卵巢癌(ovarian cancer，OC)是嚴重威脅女性健康的常見惡性腫瘤之一，由于缺乏有效的篩查手段，導(dǎo)致5年生存率低于50%[1]。2018年全球癌統(tǒng)計數(shù)據(jù)報告顯示全球女性腫瘤中OC的發(fā)病率和病死率排在第7位，分別為7.0/10萬和3.8/10萬[2]。中國OC的發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌位居第3位，而病死率卻排在婦科腫瘤的第1位[3]。OC根據(jù)組織發(fā)生來源不同，可以分上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)，生殖細胞腫瘤，性索間質(zhì)-支持細胞腫瘤，轉(zhuǎn)移性腫瘤，其中EOC約占卵巢惡性腫瘤的90%以上[4]。由于卵巢組織體積小，且位于盆腔深部，患病后往往癥狀隱匿，缺乏早期篩查和診斷的方法，且卵巢表面無腹膜覆蓋，早期即容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，即使采取非常積極的治療手段，OC的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率仍然很高，預(yù)后極差。OC發(fā)生及轉(zhuǎn)移的分子機制一直是腫瘤生物學(xué)家研究的熱點和難點。近年來的研究表明，長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)以RNA的形式在多種層面上調(diào)控了基因的表達水平，參與調(diào)節(jié)機體生理、病理過程[5]。本文通過對OC組織樣本進行差異lncRNAs的表達分析，篩選關(guān)鍵lncRNA，以期為OC中l(wèi)ncRNA的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

Trizol? Reagent(Invitrogen公司)；RNeasy Mini Kit(74104)(Qiagen 公司)；Baseline-ZEROTMDNase(EPICENTRE公司)；Quick Amp Labeling Kit、SYBR? Green real-time quantitative PCR Master Mix(Agilent公司)；Thermo Scientific Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas公司)；卵巢癌組織芯片(HOvaC154Su01)、多器官組織芯片(HOrgC-120PG04)(上海芯超生物科技有限公司)；LncRNA鋅指E-box結(jié)合同源異型盒2反義RNA 1(zinc finger E-box binding homeobox 2 antisense RNA 1，ZEB2-AS1)BaseScope 探針(Advanced Cell Diagnostics公司)；BaseScopeTM二代紅色試劑盒(Advanced Cell Diagnostics公司)。

1.2 方法

1.2.1 臨床樣本的收集： 收集寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院2018年1月至2019年6月在婦科住院的卵巢癌患者標本36份，以及正常卵巢組織22份。正常組織作為對照組(normal)，癌組織作為實驗組(test)，其中各取3份組織送上海康成生物工程有限公司進行芯片檢測。本研究得到寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院倫理委員會的支持(2019-177)?；颊呔嬷⒑炇鹆酥橥鈺?。納入標準：原發(fā)上皮性卵巢癌，未經(jīng)過放射和化學(xué)治療，術(shù)中切除的標本經(jīng)過病理科免疫組化確診。正常卵巢組織來源于因子宮良性疾病行子宮雙附件切除的患者。

1.2.2 LncRNA表達譜芯片分析：組織破碎采用組織破碎儀進行研磨，Trizol法提取總RNA，NanoDrop ND-2000進行質(zhì)量檢測，合格的總RNA標本采用Baseline-ZEROTMDNase進行DNA消化，RNeasy Mini Kit 進行RNA純化回收，使用Arraystar RNA Flash Labeling Kit對樣本進行標記，標志物采用Cyanine-3-CTP，再次以RNeasy Mini Kit進行RNA純化回收，NanoDrop ND-2000完成質(zhì)量檢測，使用Agilent SureHyb進行雜交實驗，芯片采用Arraystar人類lncRNA芯片(v4.0)，芯片經(jīng)過洗滌后，使用以Agilent DNA Microarray Scanner完成掃描。

Arraystar人類lncRNA芯片(v4.0)能夠檢測40 173條lncRNAs和20 730條源自UniProt(Universal Protein Resource)的蛋白質(zhì)編碼轉(zhuǎn)錄本，芯片上也包括了陽性探針(看家基因)和陰性探針，以進行雜交質(zhì)控監(jiān)測。

1.2.3 Real-time PCR 驗證分析：以Fold Change≥5作為刪選條件，進一步精確至10個lncRNA的差異表達，以熒光定量分析其在收集的36份癌與22份正常組織中的表達情況，組織破碎采用組織破碎儀進行研磨，Trizol法提取總RNA，NanoDrop ND-2000進行質(zhì)量檢測，以Thermo Scientific Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit合成第一鏈cDNA，以SYBR? Green real-time quantitative PCR Master Mix試劑盒說明書完成熒光定量上機檢測，機器采用ViiA 7 real-time PCR System。引物見表1，以β-actin作為內(nèi)參，各樣品的目的基因和內(nèi)參基因分別進行real-time PCR反應(yīng)。根據(jù)PCR產(chǎn)物繪制梯度稀釋標準曲線，各樣品目的基因和內(nèi)參基因的濃度結(jié)果直接由機器生成，每個樣品的目的基因濃度除以其管家基因的濃度，即為此樣品此基因的校正后的相對含量。

表1 LncRNA real-time PCR檢測引物

1.2.4 原位雜交：因檢測發(fā)現(xiàn)的lncRNA ZEB2-AS1在癌組織中表達最高，因此，以此lncRNA作為研究對象，采用RNA雜交檢測其在組織標本中的表達。組織芯片選用多器官組織芯片(HOrgC120PG04)，ZEB2-AS1探針為BaseScopeTM系統(tǒng)，偶聯(lián)可見紅光，以BaseScopeTM二代紅色試劑盒說明書完成石蠟切片的雜交實驗，卵巢癌及其他癌組織標本的石蠟切片采用組織芯片，以正置熒光顯微鏡進行拍照。

1.2.5 組織cDNA芯片表達分析：real-time PCR檢測方法見1.2.3，組織芯片選用生存期卵巢癌組織芯片(HOvaC160Su01)，合計160例卵巢腫瘤。其中，良性腫瘤2例，生存期卵巢癌158例(癌旁3例原發(fā)灶141例/轉(zhuǎn)移灶14例)，隨訪5～9年。結(jié)果分析中排除因例數(shù)太少無法統(tǒng)計的，以及臨床病理資料不全的及無實驗數(shù)據(jù)的樣本位點，即良性腫瘤2例，癌旁3例，癌轉(zhuǎn)移灶12例，非上皮來源癌原發(fā)灶3例，僅對上皮來源癌原發(fā)灶130例位點的結(jié)果進行統(tǒng)計分析。病理分型分組為Ⅰ型(低級別漿液性癌/子宮內(nèi)膜樣癌/透明細胞癌/黏液癌等)、Ⅱ型(高級別漿液性癌/肉瘤/未分化癌等)。Ⅰ型包括低級別漿液性癌、子宮內(nèi)膜樣癌、透明細胞癌及黏液癌，通常由癌前病變逐步進展而來。Ⅱ型則包括高級別漿液性癌、肉瘤和未分化癌，Ⅱ型常見于疾病進展期，惡性程度更高。以130例位點ZEB2-AS1的表達水平中位數(shù)1.575作為界限，≤1.575分為低表達組，>1.575分為抗體高表達組。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Agilent Feature Extraction軟件(v11.0.1.1)獲得芯片圖，并讀值，得到原始數(shù)據(jù)。使用Gene Spring GX v12.1軟件(Agilent Technologies)對原始數(shù)據(jù)進行Quantile標準化和隨后的數(shù)據(jù)處理。原始數(shù)據(jù)標準化后經(jīng)過篩選高質(zhì)量探針(某探針在6個樣品中至少有3個被標記為Present或Marginal)進行進一步分析。兩組樣品間具有統(tǒng)計學(xué)意義的差異表達lncRNA或差異表達mRNA通過P-value/FDR篩選，兩個組間差異表達lncRNAs或差異表達mRNAs通過Fold Change篩選。

2 結(jié)果

2.1 LncRNA與mRNA在卵巢癌中的差異表達

挑選的3對上皮性卵巢癌組織和正常卵巢組織RNA提取質(zhì)檢合格，A260/280在1.87～2.01質(zhì)檢，濃度在214.36～607.36 mg/L質(zhì)檢，在用DNA酶消化后進行了采用變性瓊脂糖凝膠電泳進行RNA完整性和gDNA污染測試，顯示無DNA污染，條帶大小均勻的分為28、18和5.8 s，無降解。

相比于對照組，實驗組共有4 982個差異表達的lncRNA，其中1 941個lncRNA表達上調(diào)，3 041個lncRNA表達下調(diào)(圖1)。

圖1 LncRNA聚類分析圖

2.2 LncRNA 熒光定量表達驗證

相比于對照組，實驗組ENST00000428814、KRT8P41、ZEB2-AS1、DUXAP8高表達，差異顯著(P<0.05)，ENST00000609183、ST13P4、GSTM2P1、CXADRP3、LINC00899、FAM153B低表達(P<0.05)(圖2)。

*P<0.05 compared with control group

2.3 ZEB2-AS1的原位雜交表達驗證

ZEB2-AS1在癌組織中高表達，用RNA雜交檢測提示ZEB2-AS1在肺癌、肝癌、結(jié)腸癌、腎癌、胃癌和OC組織標本中高表達(圖3)。

圖3 LncRNA ZEB2-AS1在多個癌組織中的表達

2.4 OC組織cDNA芯片real-time PCR結(jié)果

ZEB2-AS1的表達水平與腫瘤大小、病理分級、病理分型、T、N、M分期以及臨床分期均有相關(guān)性(P<0.05)。ZEB2-AS1高表達58例，低表達72例，與總生存期顯著相關(guān)(P<0.05)，與無病生存期顯著相關(guān)(P<0.05)，均體現(xiàn)在ZEB2-AS1高表達的生存期低(圖4)。

圖4 LncRNA ZEB2-AS1的表達與生存期的相關(guān)性

2.5 LncRNA ZEB2-AS1的生物信息學(xué)分析

LncRNA ZEB2-AS1屬于antisense lncRNAs，來源于ZEB2基因的反義序列，ZEB2-AS1的序列與ZEB2部分完全重合， 位于2號染色體， 始于145 277 180位點，終止于145 278 465位點，全長430 bp。芯片數(shù)據(jù)中差異antisense lncRNAs與相應(yīng)mRNAs聯(lián)合分析表明，ZEB2-AS1同ZEB2基因的表達趨勢一致，均高表達。lncLocator預(yù)測發(fā)現(xiàn)ZEB2-AS1定位于細胞質(zhì)，miRcode 預(yù)測發(fā)現(xiàn)ZEB2-AS1具有13個microRNA(miRNA)結(jié)合位點，包括miR-142-3p、146a、145、204等。

3 討論

LncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本長度大于200 bp，但因其缺乏完整的開放閱讀框架而不具編碼蛋白質(zhì)的序列，具有致癌或抑癌的功能[6]。本文通過微陣列芯片篩選發(fā)現(xiàn)4 982個lncRNA在OC中有表達差異。進一步擴大OC標本，以real-time PCR驗證差異最高的10個lncRNA，發(fā)現(xiàn)ZEB2-AS1表達差異最為顯著。OC患者ZEB2-AS1表達水平的研究僅有一篇報道，結(jié)果顯示 ZEB2-AS1在癌組織中的表達水平明顯升高[7]，這與本文的結(jié)果一致。

ZEB2-AS1的失調(diào)可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生和發(fā)展，可以作為人類癌的診斷標記或治療靶標[8]。研究顯示在結(jié)直腸癌中ZEB2-AS1表達上調(diào)，ZEB2-AS1的高表達與總生存率低有關(guān)[9]。人肺癌中ZEB2-AS1的轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，ZEB2-AS1通過促進其增殖或抑制細胞凋亡對肺癌進展的影響[10]。肝癌組織中ZEB2-AS1高表達，與原發(fā)腫瘤的大小，肝內(nèi)轉(zhuǎn)移和腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移階段顯著相關(guān)[11]。本文以多器官組織芯片進行ZEB2-AS1的原位雜交，結(jié)果顯示其在包括卵巢、肝、胃等多個癌組織中過表達，這與相關(guān)研究結(jié)果一致。通過對OC中ZEB2-AS1的表達和臨床病理資料及生存等相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，與腫瘤大小、病理分級、病理分型、腫瘤大小(T)、淋巴結(jié)受累情況(N)、遠處轉(zhuǎn)移(M)以及臨床分期均有相關(guān)性，均體現(xiàn)在ZEB2-AS1高表達的患者總生存期和無病生存期低。文獻證實，ZEB2-AS1在OC組織中的表達與臨床病理特征及預(yù)后密切相關(guān)[7]，這與本文的結(jié)果一致。

LncRNA 可通過內(nèi)源競爭RNA(competing endogenous RNAs，ceRNAs)機制、結(jié)合生物大分子等調(diào)節(jié)基因表達，在腫瘤細胞內(nèi)發(fā)揮調(diào)控作用[12]。報道顯示ZEB2-AS1過表達對胃癌細胞增殖和侵襲的影響是通過miR-143-5p /HIF-1α介導(dǎo)的[13]。胰腺癌中ZEB2-AS1負調(diào)控miR-204的表達，靶向HMGB1基因介導(dǎo)促癌作用[14]。ZEB2-AS1吸附miR-27bb介導(dǎo)膀胱癌細胞的增殖和侵襲作用[15]。ZEB2-AS1與EZH2結(jié)合可增強骨肉瘤細胞的增殖和侵襲能力，并抑制細胞凋亡[16]。這均與ceRNA調(diào)控機制、與生物大分子相互作用方面息息相關(guān)。本文數(shù)據(jù)顯示 ZEB2-AS1與相應(yīng)的鄰近基因ZEB2之間表達相關(guān)，ZEB2作為致癌基因具有推動上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)發(fā)生的作用，那么 ZEB2-AS1與ZEB2之間是否有相互關(guān)系，是否通過miRNA形成ceRNA機制，或者二者結(jié)合發(fā)揮調(diào)控作用？均需要進一步的實驗驗證。

盡管ZEB2-AS1在多個腫瘤中被鑒定為致癌lncRNA，但其在OC中的作用機制未見報道?？傊疚陌l(fā)現(xiàn)ZEB2-AS1在OC中的異常表達，提示其具有重要的研究價值，可能具有作為治療靶點或診斷預(yù)后標志物的潛能。