江羅佳，許海波

(九江市第一人民醫(yī)院 1.腎內(nèi)科； 2.肝病科，江西 九江 332000)

細(xì)胞內(nèi)的線粒體在質(zhì)量或數(shù)量上都時(shí)刻發(fā)生著動態(tài)變化。當(dāng)機(jī)體遭受應(yīng)激損傷時(shí)，會產(chǎn)生大量結(jié)構(gòu)或功能缺陷的線粒體[1]。線粒體自噬，是一種高度保守的細(xì)胞活動，它能及時(shí)清除受損的線粒體，對控制線粒體質(zhì)量、改善線粒體功能、維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[2]。據(jù)報(bào)道，線粒體自噬在臟器遭受缺血/再灌注(ischemic-reperfusion，I/R)損傷早期就開始啟動。當(dāng)抑制線粒體自噬時(shí)，會嚴(yán)重加劇I/R誘導(dǎo)的臟器病理損傷[3]。

白藜蘆醇(resveratrol，Res)是一種具有多種生物學(xué)活性的多酚類化合物，是天然的自由基清除劑及抗炎劑[4]。研究表明，Res能通過抑制間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化及炎性反應(yīng)通路治療腎損傷[5]，Res能抑制氧化應(yīng)激引起的足細(xì)胞凋亡[6]等。此外， Res能夠通過抑制線粒體自噬的相關(guān)通路來緩解動物模型中的肌營養(yǎng)不良癥、年齡衰老、動脈血管硬化，腦損傷等[7-9]。結(jié)合上述，Res的腎臟保護(hù)作用可能與促進(jìn)線粒體自噬，維持線粒體動力學(xué)穩(wěn)態(tài)相關(guān)，本該研究通過Res的藥效學(xué)試驗(yàn)，檢測線粒體功能的指標(biāo)，以及對線粒體自噬的觀察，探討Res對體外低氧/復(fù)氧(hypoxia-reoxygenation，H/R)損傷后小鼠腎小管上皮細(xì)胞系TCMK1中氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡的影響，為線粒體自噬在I/R誘導(dǎo)急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)的機(jī)制上提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠腎小管上皮細(xì)胞系TCMK1(ATCC細(xì)胞庫)；最低基本(MEM)培養(yǎng)基(高糖型)、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8)和線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential, MMP)檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)(Hyclone公司)；Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡試劑盒和二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)蛋白檢測試劑盒(北京四正柏生物科技有限公司)；視神經(jīng)萎縮癥蛋白(optic atrophy, OPA)抗體、動力相關(guān)蛋白(dynamin-related protein, Drp)抗體和cleaved caspase-3抗體(CST中國公司); Bax抗體和Bcl2抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；活性氧(reactive oxygen species, ROS)和鈣離子(Ca2+)含量檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)；線粒體外膜轉(zhuǎn)位酶20(TOMM20)抗體和自噬溶酶體相關(guān)膜蛋白2(autophagy-lysosome-associated membrane proteins 2, LAMP2)抗體(杭州華安生物技術(shù)有限公司)；線粒體自噬抑制劑1 (mitochondrial division inhibitor 1, Mdivi-1(Sigma-Aldrich公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分組與處理：TCMK1細(xì)胞在10% FBS的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育。將對數(shù)增殖期的細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于6孔板中，分為對照組、H/R組和H/R+不同劑量(0、5、10、20、50、100和500 μmol/L)Res預(yù)處理組(預(yù)處理細(xì)胞2 h)，或H/R+Res+Mdivi-1干預(yù)組(10 mmol/L預(yù)處理細(xì)胞2 h)。對照組細(xì)胞在正常環(huán)境培養(yǎng)，H/R組細(xì)胞在H/R條件(5%胎牛血清+低氧12 h+復(fù)氧24 h)刺激培養(yǎng)(其中低氧條件為1% O2+5% CO2+95% N2；復(fù)氧條件為 76% N2+5% CO2+21% O2)。

1.2.2 CCK-8 法檢測細(xì)胞活力：將TCMK1細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種于96孔板中，孵育培養(yǎng)24 h，分組干預(yù)完成后加10 μL CCK-8溶液，37 ℃培養(yǎng)箱孵育1h，利用酶標(biāo)儀檢測450 nm處測吸光度(A)值。細(xì)胞活力計(jì)算公式：細(xì)胞活力*(%)=[A(加藥)-A(空白)]/[A(未加藥)-A(空白)]。

1.2.3 ROS含量的檢測：利用試劑盒DCFH-DA熒光探針法檢測TCMK1細(xì)胞內(nèi)ROS含量。細(xì)胞經(jīng)過分組處理后，收集各組細(xì)胞至流式管中，PBS輕柔洗滌2遍，根據(jù)說明書加入10 μmol/L的DCFH-DA探針并置于37℃培養(yǎng)箱避光孵育，孵育30 min結(jié)束后基礎(chǔ)培養(yǎng)基輕柔洗滌3次，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞ROS熒光。

1.2.4 細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量的檢測：利用試劑盒熒光染料Fluo-3/AM熒光探針法檢測TCMK1細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量。細(xì)胞經(jīng)過分組處理后，PBS輕柔漂洗2遍，加入Fluo-3/AM工作液并于37 ℃孵育箱避光孵育30 min，結(jié)束后PBS輕柔洗滌3次，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.5 MMP的檢測：利用JC-1線粒體膜電位試劑盒檢測TCMK1細(xì)胞內(nèi)MMP下降程度。細(xì)胞經(jīng)過分組處理后，收集各組細(xì)胞至流式管中，根據(jù)說明書加入JC-1熒光探針并置于37 ℃培養(yǎng)箱避光30 min，PBS輕柔洗滌2次，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)MMP變化。

1.2.6 細(xì)胞免疫熒光雙染檢測細(xì)胞內(nèi)線粒體自噬：取對數(shù)增殖期的TCMK1細(xì)胞1×105個(gè)/孔接種于6孔板中的細(xì)胞爬片上，培養(yǎng)24 h后細(xì)胞分組并處理，PBS輕柔漂洗3次，4%的多聚甲醛固定爬片20 min，PBS輕柔漂洗3次，0.5% Triton X-100室溫通透20 min，PBS輕柔漂洗3次，在玻片上滴加5% BSA，37 ℃封閉30 min，PBS輕柔漂洗3次，加入1∶200稀釋LAMP2和1∶1 000 TOMM20一抗，4 ℃保濕盒內(nèi)避光孵育過夜，PBS輕柔漂洗3次，綠色DyLight488熒光標(biāo)記的山羊抗兔二抗以1∶100稀釋，37 ℃避光孵育30 min，DAPI復(fù)染10 min，全自動顯微鏡進(jìn)行觀察拍照。

1.2.7 Western blot檢測OPA和DRP蛋白的表達(dá)：取對數(shù)增殖期的TCMK1細(xì)胞1×105個(gè)/孔接種于6孔板中的細(xì)胞爬片上，培養(yǎng)24 h后細(xì)胞分組并處理，加RIPA試劑(含cocktail酶抑制劑)提取TCMK1細(xì)胞的蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒對蛋白濃度測定，再按各組蛋白相同的上樣量行SDS-PAGE。電泳后，將分離蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，并于5%脫脂奶粉溶液中封閉1 h。然后分別置于含有OPA(1∶1 000)、DRP(1∶1 000)、cleaved caspase-3(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)和Bcl2(1∶1 000)抗體稀釋液中，在4 ℃層析柜中低速搖床上孵育過夜。次日將條帶置于TBST中洗脫一抗3次，置于山羊抗兔(1∶2 000)抗體稀釋液中，室溫下二抗孵育1 h，再將條帶置于TBST中洗脫二抗3次，滴加新鮮顯影液曝光顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Res安全濃度的篩查

與對照組相比，Res在5～20 μmol/L時(shí)，細(xì)胞活力無顯著下降；但隨著濃度的持續(xù)增加(50～500 μmol/L)，細(xì)胞活力顯著下降(P<0.01)(表1)。因此本研究選擇5、10、20 μmol/L這3個(gè)濃度作為Res的低、中、高3個(gè)濃度組。

2.2 Res對H/R損傷后TCMK1細(xì)胞存活率的影響

與H/R組相比，給予Res(5、10、20 μmol/L)預(yù)處理后，細(xì)胞存活率均升高，以10 μmol/L Res+H/R組中細(xì)胞存活率升高至98.24%最顯著(P<0.05)。因此，選取10 μmol/L Res作為最佳作用濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)(表2)。

表2 Res對H/R損傷后TCMK1細(xì)胞存活率的影響

2.3 Res對H/R損傷后TCMK1細(xì)胞鈣離子及ROS的影響

對照組細(xì)胞內(nèi)Ca2+(綠色熒光)含量較少，而H/R組細(xì)胞數(shù)目減少且Ca2+(綠色熒光)含量顯著增多(P<0.05)，H/R+Res組細(xì)胞數(shù)目增多且Ca2+(綠色熒光)含量顯著減少(P<0.05)(圖1A,B)。與對照組相比，H/R組細(xì)胞內(nèi)ROS熒光強(qiáng)度顯著增多(P<0.05)；與H/R組相比，H/R+Res組細(xì)胞內(nèi)ROS熒光強(qiáng)度顯著降低(P<0.05)(圖1C,D)。

A,B.fluorescence microscopy to detect intracellular calcium fluorescence; C,D.flow cytometry to detect percentage of reactive oxygen species positive cells; *P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with H/R group

2.4 Res對H/R損傷后TCMK1細(xì)胞MMP的影響

對照組細(xì)胞內(nèi)MMP無降低，表現(xiàn)為紅色熒光較弱；與對照組相比，在H/R組MMP顯著降低，紅色熒光增多(P<0.05)；而與H/R組相比，給予(H/R+Res)預(yù)處理組，下降的MMP有所恢復(fù)，紅色熒光減少(P<0.05)(圖2)。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with H/R group

2.5 Res對H/R損傷后TCMK1細(xì)胞動力學(xué)蛋白表達(dá)的影響

與對照組相比，H/R組OPA蛋白表達(dá)下降，而DRP蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與H/R組相比，給予Res干預(yù)后，OPA蛋白表達(dá)顯著升高，而DRP蛋白顯著下降(P<0.05)(圖3)。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with H/R group

2.6 免疫共定位觀察各組線粒體自噬情況

觀察TOMM20(紅色)和LAMP2(綠色)的共定位情況(箭頭指示自噬線粒體)，可見H/R組和(Res+H/R)組線粒體數(shù)量較對照組組均有不同程度減少，且(Res+H/R)組共定位的線粒體數(shù)量較H/R組明顯增多(圖4)。

圖4 免疫共定位觀察各組線粒體自噬情況

2.7 Mdivi-1對H/R損傷后TCMK1細(xì)胞凋亡的影響

與對照組相比，H/R組cleaved caspase-3、Bax蛋白表達(dá)顯著升高，Bcl2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與H/R組相比，給予Res干預(yù)后，cleaved caspase-3、Bax蛋白表達(dá)顯著下降，Bcl2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與(H/R+Res)組相比，在其基礎(chǔ)上給予Mdivi-1干預(yù)后能夠顯著增加cleaved caspase-3、Bax蛋白表達(dá)，顯著降低Bcl2蛋白表達(dá)(P<0.05)(圖5A～E)。

*P<0.05 compared with control; #P<0.05 compared with H/R group；△P<0.05 compared with H/R+Res group

3 討論

機(jī)體在遭受休克、手術(shù)時(shí)不可避免會發(fā)生腎臟I/R損傷，導(dǎo)致急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)發(fā)生。迄今，國內(nèi)外尚無預(yù)防和治療缺血性AKI的有效藥物。由于腎臟細(xì)胞屬于非再生細(xì)胞，發(fā)生AKI后整體預(yù)后較差。因此，探索新型有效的預(yù)防和治療AKI的藥物是學(xué)術(shù)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

目前，腎臟I/R損傷的分子機(jī)制尚不完全清楚，皮髓質(zhì)交界處近端腎小管上皮細(xì)胞對缺血低氧敏感，是缺血性AKI的主要靶細(xì)胞[10]。線粒體能夠提供細(xì)胞生命活動的主要能量，是決定缺血后腎小管細(xì)胞生存和死亡的關(guān)鍵靶區(qū)[11]。當(dāng)腎臟發(fā)生I/R損傷時(shí)，出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)能量耗竭，ROS產(chǎn)生，鈣離子超負(fù)荷等，誘導(dǎo)線粒體功能障礙。而受損的線粒體亦會成為加重I/R損傷的繼發(fā)性因素[12]。本研究證實(shí)，Res能夠減輕H/R造成的鈣離子超負(fù)荷、ROS聚集以及MMP的降低，表明Res的腎小管保護(hù)功能與改善線粒體功能密切相關(guān)。

線粒體的質(zhì)量控制，如線粒體融合、線粒體分裂與線粒體自噬，既能保護(hù)線粒體免受應(yīng)激損害，又能選擇性清除功能或結(jié)構(gòu)障礙的線粒體[13]。近年，線粒體自噬在腎臟病中的研究受到很多關(guān)注。線粒體自噬對調(diào)控線粒體動力學(xué)平衡，促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞的修復(fù)極為重要[14]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給予H/R刺激干預(yù)后線粒體融合蛋白OPA表達(dá)減少，而分裂蛋白DRP表達(dá)增多，表明H/R會誘導(dǎo)TCMK1細(xì)胞線粒體動力學(xué)失衡，而給予Res預(yù)處理后能夠逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象，提示Res能夠調(diào)控線粒體動力學(xué)穩(wěn)態(tài)來維持線粒體形態(tài)正常。Mdivi-1是細(xì)胞自噬抑制劑1，其作用主要是抑制細(xì)胞或亞器官(如線粒體)自噬的行為[15]。深入研究發(fā)現(xiàn)，Res促進(jìn)線粒體和LAMP2蛋白的共定位發(fā)生，提示Res能夠促進(jìn)線粒體自噬發(fā)生，而給予Mdivi-1會加重TCMK1細(xì)胞中凋亡執(zhí)行蛋白表達(dá)，表明Res能通過調(diào)控線粒體自噬對調(diào)控線粒體動力學(xué)平衡，促進(jìn)TCMK1細(xì)胞的修復(fù)，與既往文獻(xiàn)報(bào)道相符合[16]。

綜上所述，Res對H/R誘導(dǎo)TCMK1細(xì)胞損傷的保護(hù)作用可能與激活線粒體自噬途徑，清除結(jié)構(gòu)或功能缺陷的線粒體，改善線粒體質(zhì)量密切相關(guān)。本研究為Res在I/R誘導(dǎo)的AKI方面提供一定的理論依據(jù)。但是，有關(guān)Res在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)劑量和效果的驗(yàn)證，仍需要進(jìn)一步的深入研究。