李 明，孫海玲，劉娟利，郭巍巍

(南京醫(yī)科大學(xué)康達(dá)學(xué)院附屬濱?？h人民醫(yī)院 1.檢驗科； 2.介入與血管外科， 江蘇 鹽城 224500)

深靜脈血栓(deep venous thrombosis, DVT)是血液在深靜脈非正常凝結(jié)，屬于靜脈回流障礙性疾病，多發(fā)于下肢、腸系膜、以及骨盆等[1]?；颊咭最净佳ê缶C合征，局部組織腫脹、疼痛。DVT的啟動涉及血流停滯、血液促凝成分增加、以及血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[2]，其中可溶性CD40配體(soluble CD40L, sCD40L)等炎性物質(zhì)誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷與血栓的形成密切相關(guān)[3]。白細(xì)胞介素(interleukin, IL)-35是一種新型的異二聚體抗炎因子，能有效抑制多種炎性物質(zhì)(如脂多糖、脂質(zhì)溶血磷脂酰膽堿)誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞活化[4-5]。但其對sCD40L損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響缺乏報道。本研究通過檢測DVT患者外周血IL-35和sCD40L的水平，并通過體外實驗分析IL-35對sCD40L損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護作用。

1 材料與方法

1.1 資料

1.1.1 對象：研究對象為2020年1月至2020年12月于濱?？h人民醫(yī)院診治的急性期DVT患者30例(DVT組)，診斷標(biāo)準(zhǔn)符合第3版《深靜脈血栓形成的診斷和治療指南》[6]。同時選取性別、年齡匹配的健康體檢者30名作為對照組(HC組)，兩組性別、年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究經(jīng)過濱?？h人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號2020/01)，研究對象均簽署知情同意書。

1.1.2 細(xì)胞及試劑：人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)及細(xì)胞培養(yǎng)液(湖北武漢豐暉生物技術(shù)有限公司)；IL-35、sCD40L、IL-1β、IL-18、sCD40L ELISA試劑盒、鼠抗人β-actin、羊抗兔及羊抗鼠二抗(南京翼飛雪生物技術(shù)有限公司);IL-35(Sigma-Aldrich公司)；兔抗人GSDMD-N、cleaved caspase-1等抗體(CST公司)；蛋白濃度試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本的采集：均于空腹治療前采集靜脈血5 mL，1 500 r/min，離心5 min收集血清，使用ELISA試劑盒檢測血清中IL-35、sCD40L、IL-1β、IL-18等細(xì)胞因子的水平。

1.2.2 細(xì)胞的培養(yǎng)及分組：將HUVECs接種于DMEM完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱，待其增殖至80%匯合時傳代，第2～5代用于實驗。分為對照組、sCD40L組和IL-35組。sCD40L組：加入25 μg/mL sCD40L；IL-35組：加入20 ng/mL IL-35和25 μg/mL sCD40L。

1.2.3 CCK8試劑盒檢測細(xì)胞活力：將HUVECs以2×103個/mL接種至96孔板，加入10 μL 的CCK8試劑，37 ℃培養(yǎng)2 h后，使用酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度值(A值)，波長為450 nm。

1.2.4 ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β和IL-18濃度：收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按試劑盒說明書檢測上清液中IL-1β和IL-18細(xì)胞因子的濃度。

1.2.5 Western blot檢測細(xì)胞中GSDMD-N、cleaved caspase-1蛋白表達(dá)：使用RIPA細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度。通過10% SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，上樣濃度為30 μg。使用5%脫脂牛奶封閉2 h后加入GSDMD-N、cleaved caspase-1一抗4 ℃ 孵育過夜，TBST搖床清洗3次，每次10 min，加入二抗室溫1 h后清洗3次，每次10 min，加入顯影液使用Bio-Rad凝膠成像儀顯影成像。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 兩組外周靜脈血細(xì)胞因子水平比較

與HC組比較，DVT組IL-35水平顯著降低，sCD40L、IL-1β、IL-18水平顯著升高(P<0.05)(表1)。

表1 外周血清細(xì)胞因子水平比較

2.2 DVT患者外周血IL-35和sCD40L相關(guān)性分析

DVT患者外周血IL-35和sCD40L水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.501，P<0.05)(圖1)。

圖1 DVT患者外周血IL-35與sCD40L水平相關(guān)性分析

2.3 三組HUVECs活力比較

與對照組比較，sCD40L組細(xì)胞活力降低；與sCD40L組相比，IL-35組細(xì)胞活力上升(P<0.05)(圖2)。

*P<0.05 compared with control group；#P<0.05 compared with sCD40L group

2.4 三組HUVECs培養(yǎng)上清IL-1β和IL-18水平比較

與對照組相比，sCD40L組HUVECs培養(yǎng)上清IL-1β和IL-18水平顯著升高；IL-35組與sCD40L組相比，HUVECs培養(yǎng)上清IL-1β和IL-18的水平顯著降低(P<0.05)(表2)。

表2 HUVECs培養(yǎng)上清IL-1β和IL-18水平比較

2.5 三組HUVECs中GSDMD-N、cleaved caspase-1蛋白表達(dá)比較

與對照組相比，sCD40L組GSDMD-N、cleaved caspase-1蛋白表達(dá)顯著升高；與sCD40L組相比，IL-35組顯著降低(P<0.05)(圖3)。

*P<0.05 compared with control group；#P<0.05 compared with sCD40L group

3 討論

深靜脈血栓形成機制涉及血管內(nèi)皮細(xì)胞的激活、血小板的活化以及免疫細(xì)胞的募集等[7]。免疫系統(tǒng)參與血栓形成和消除，機制是促炎/抑炎細(xì)胞因子的失衡，具有促進炎性反應(yīng)作用的細(xì)胞因子IL-6、TNF-α、C反應(yīng)蛋白表達(dá)顯著升高，具有抑制炎性反應(yīng)的細(xì)胞因子IL-10、IL-4表達(dá)顯著降低[8-9]。sCD40L是CD40L的一個可溶性的三聚體片段，由多種免疫細(xì)胞產(chǎn)生， 但主要由活化的血小板分泌，sCD40L促進血管內(nèi)皮細(xì)胞活化，具有促炎、促凝作用，導(dǎo)致血栓形成[10]。

IL-35主要是由調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells Treg)分泌的抑炎細(xì)胞因子，其主要功能是抑制Th17細(xì)胞的分化和發(fā)育，保護血管內(nèi)皮細(xì)胞。在自身免疫性疾病和炎性疾病中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[11]。本研究發(fā)現(xiàn)DVT患者外周血IL-35濃度降低，與本研究結(jié)果一致的是，惡性腫瘤、感染、系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者易形成靜脈血栓，而文獻已證明此類患者血清IL-35濃度降低[12]。

血流停滯導(dǎo)致局部低氧[13]，低氧能夠誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞NLRP3炎性小體的活化[14]，參與深靜脈血栓的形成。NLRP3炎性小體由NLRP3、ASC、caspase-1組成，激活的caspase-1裂解GSDMD成具有活性的GSDMD-N，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)膜產(chǎn)生孔隙，細(xì)胞腫脹、裂解，釋放炎性因子IL-1β、IL-18[15]。本實驗通過體外實驗證明，IL-35能顯著降低sCD40L誘導(dǎo)的HUVECs活力損傷、IL-1β和IL-18的產(chǎn)生、cleaved caspase-1和GSDMD-N蛋白表達(dá)。

綜上所述，深靜脈血栓患者外周靜脈血IL-35水平顯著降低，sCD40L水平顯著升高，兩者呈負(fù)相關(guān)。體外實驗結(jié)果表明IL-35對sCD40L誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷具有保護作用，其機制是抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞cleaved caspase-1和GSDMD-N的表達(dá)，降低血管內(nèi)皮細(xì)胞IL-1β、IL-18的釋放，從而影響血栓的形成。但深靜脈血栓患者IL-35和sCD40L變化的機制尚需要進一步研究。