李 晨，張 婷，王志榮，許雪梅

(中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所 北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院 生物物理及結(jié)構(gòu)生物學系，北京 100005)

手足口病(hand, foot and mouth disease, HFMD)是一種由腸道病毒引起的傳染性疾病。腸道病毒71型(enterovirus 71，EV71)是其主要病原體之一。因其具有嗜神經(jīng)性，嚴重者可出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)的并發(fā)癥[1]。目前臨床上沒有針對EV71的特效藥，主要預防措施為接種疫苗。

EV71為直徑約24～30 nm正二十面體，內(nèi)含單股正鏈RNA，編碼一個多聚蛋白, 可水解為3種蛋白(protein，P)，即P1、P2和P3，P2和P3被水解為7個非結(jié)構(gòu)蛋白(2A～2C、3A～3D)，與病毒毒力相關；P1先被水解為3種病毒蛋白(viral protein，VP)，即VP0、VP3和VP1，自主組裝形成病毒空心顆粒，隨著病毒RNA的進入，VP0進一步被水解為VP2和VP4，此時病毒顆粒的形式為實心顆粒。VP1～VP3位于病毒顆粒的表面，VP4 位于衣殼的內(nèi)部[2-3]。

EV71基因亞型眾多，包括A(BrCr)、B1～B5、C1～C5，其中C4亞型是中國內(nèi)陸主要流行株[4]。研究表明：核苷酸序列的同源性，同一型內(nèi)毒株間序列同源性大于92%，不同型間毒株的同源性為78%～83%[5-6]。人群中經(jīng)常出現(xiàn)交替流行或共同流行，需對現(xiàn)有疫苗進行改進并拓寬保護范圍。針對流行株快速制備抗體對于病毒鑒定和疫苗研究至關重要。因此，本研究針對EV71 FY23(C4)的外殼蛋白合成4種表位肽制備抗血清并鑒定結(jié)合活性，旨在為EV71的疫苗研究和鑒定提供了檢測工具。

1 材料與方法

1.1 材料

MF59佐劑、非洲綠猴腎細胞Vero、EV71 FY23(C4)毒株(本實驗室保存)；CpGC274佐劑(上海生工生物工程股份有限公司合成)；SPF級4～6周雌性BALB/c小鼠(北京斯貝福生物技術(shù)有限公司)；DMEM培養(yǎng)基(北京蘭博利德商貿(mào)有限公司)；草地貪夜蛾卵巢細胞Sf9(Invitrogen公司)；昆蟲細胞全懸浮培養(yǎng)基粉末(壹生科深圳有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 表位分析與多肽設計：根據(jù)EV71 FY23(C4)外殼蛋白VP1～VP4的序列，利用B細胞表位預測軟件，即BepiPred、ABCpred、Ellipro、BCPREDS、COBEpro，從親水性、可塑性、抗原性等多方面進行預測，分析并設計4種表位肽，序列如表1。

表1 表位肽的氨基酸序列

1.2.2 多肽的合成：根據(jù)表1進行多肽合成，采用HPLC純化，純度為90%。以4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯為交聯(lián)劑，將表位肽偶聯(lián)到鑰孔蟲戚血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin, KLH)載體上，獲得VP1-KLH、VP2-KLH、VP3-KLH和VP4-KLH多肽，用PBS溶解備用。

1.2.3 小鼠的免疫：將小鼠分為4組，每組5只。初次免疫多肽的劑量為100 μg，強化免疫的劑量為50 μg；采用MF59/CpGC274佐劑皮下注射，免疫6次，間隔兩周(day 0、14、28、42、56、70)。最后一次免疫后兩周(day 91)尾靜脈采血，分離血清，56 ℃加熱30 min滅活，-20 ℃放置備用。

1.2.4 表位肽抗血清的鑒定：酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)：分別取EV71病毒和EV71 病毒樣顆粒(virus-like particle, VLP)溶液用PBS調(diào)整至200 mg/L，加入終濃度為0.01 mol/L DTT和1 mol/L NaOH，76 ℃處理10 min，使其變性。取EV71病毒及變性病毒、EV71 VLP及變性VLP、Vero細胞裂解上清、Sf9細胞裂解上清溶液，分別包被96孔板，100 ng/孔，4 ℃包被過夜。經(jīng)洗滌、封閉，加入2倍系列稀釋的多肽抗血清，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h。加入HRP標記的羊抗小鼠IgG(1∶5 000)，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h。加入OPD底物顯色液，100 μL/孔，37 ℃避光顯色5 min，加入2 mol/L H2SO4終止液，50 μL/孔，測定A490 nm處吸光度值。陽性判定依據(jù)是待測血清與抗原反應孔的A490值大于等于陰性血清與抗原反應孔的A490值的2.1倍。Western blot檢測：將空桿狀病毒表達樣品、Sf9細胞裂解上清、EV71病毒、EV71 VLP進行12%SDS-PAGE后，將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，用含5%脫脂奶粉的PBST封閉2 h，加入不同稀釋度的多肽抗血清，4 ℃孵育過夜，洗膜5次，加入HRP標記的羊抗小鼠IgG(1∶5 000)，室溫孵育2 h，ECL顯色。

2 結(jié)果

2.1 血清抗體效價的測定

4種表位肽抗血清的效價均為1∶102 400(圖1)。

圖1 血清抗體的效價

2.2 表位肽抗血清與EV71病毒及變性病毒的結(jié)合能力

以EV71病毒和變性病毒為包被抗原，4種抗血清均可與之有效結(jié)合。VP2抗血清與變性病毒的結(jié)合能力比與病毒的結(jié)合能力高(圖2B)，VP1抗血清和VP3抗血清與兩種抗原的結(jié)合能力相差不大(圖2A,C)。VP4的抗血清在較低稀釋度下與兩種抗原的結(jié)合能力存在一定差異，但是差異并不大(圖2D)。

圖2 4種表位肽抗血清與EV71病毒及變性病毒的結(jié)合能力

2.3 表位肽抗血清與EV71 VLP及變性VLP的結(jié)合能力

以Sf9細胞表達的EV71 VLP和變性VLP為包被抗原，4種抗血清均可與VLP及變性VLP結(jié)合。其中，VP2抗血清與變性VLP的結(jié)合能力最高(圖3B)。VP3和VP4抗血清與兩種抗原的結(jié)合能力相當(圖3C, D)。VP1抗血清在較低稀釋度下與變性VLP結(jié)合能力較好(圖3A)。

圖3 4種表位肽抗血清與EV71 VLP和變性VLP的結(jié)合能力

2.4 表位肽抗血清與EV71 外殼蛋白分子的結(jié)合能力分析

以EV71 VLP和病毒作為蛋白樣品，用4種抗血清進行雜交，VP1抗血清可與外殼蛋白中的VP1結(jié)合(圖4A)；VP2抗血清與EV71 VLP中的VP0結(jié)合，與EV71病毒的空心顆粒的VP0及實心顆粒的VP2結(jié)合(圖4B)；VP3抗血清沒有結(jié)合活性(圖4C)；VP4抗血清與P1蛋白有一定結(jié)合活性(圖4D)。

A.primary antibody: anti-VP1, 1∶1 000; B.primary antibody: anti-VP2, 1∶1 000; C.primary antibody: anti-VP3, 1∶2 000; D.primary antibody: anti-VP4, 1∶2 000

3 討論

VP1和VP2抗血清在ELISA和Western blot實驗中均有結(jié)合活性。VP1和VP2抗血清與變性病毒和變性VLP的結(jié)合能力較好，因為在天然病毒顆粒中，兩種抗血清對應的表位位置相對隱蔽。病毒變性后蛋白之間的結(jié)構(gòu)被破壞，表位充分暴露，結(jié)合能力提高。研究發(fā)現(xiàn)[7]EV71病毒顆粒5倍對稱軸周圍存在一個凹陷區(qū)，稱為“峽谷”，是EV71與人清道夫受體B類成員2(scavenger receptor class B member 2，SCARB2)結(jié)合的重要結(jié)構(gòu)。VP1 GH loop和VP2 EF loop是“峽谷”區(qū)域的重要表位[8-9]。本研究合成的VP1和VP2表位肽分別對應VP1 GH loop和VP2 EF loop，實驗結(jié)果進一步驗證了這兩段表位在天然病毒顆粒中暴露不充分。

VP1和VP2抗血清特異性好，結(jié)合能力強。VP2抗血清可協(xié)助鑒別病毒的空心顆粒和實心顆粒。VP1(aa.204-223) 和VP2(aa.133-163)表位為線性表位。有報道[10]針對臺灣株EV71 TW/2086/98(C)設計合成多肽，發(fā)現(xiàn)VP1-43(VP1aa.206-225) 和VP2-28(VP2aa.136-150)為中和線性表位。本研究同其他研究結(jié)果的一致性可說明同一基因型不同毒株之間相對應的序列具有一定保守性。VP2抗血清與EV71 VLP和病毒的結(jié)合能力相當，說明其對應的表位比較穩(wěn)定， 不容易受樣品類類型的干擾。研究[10-11]表明VP2不會被甲醛破壞并可長期保存，可利用其作為EV71疫苗的效能替代檢測標記物。

VP3和VP4抗血清在ELISA實驗中有結(jié)合活性，但是在Western blot中沒有結(jié)合活性?？赡苁且驗楸砦惶禺愋圆粡?，免疫小鼠后產(chǎn)生別的特異性抗體相對較少，導致ELISA實驗非特異性結(jié)合增加。VP3表位肽是由VP3的139-148位氨基酸和173-191位氨基酸串聯(lián)合成。研究證明VP3(aa.176-190) 是一段構(gòu)象中和表位[12]。VP3抗血清與變性蛋白結(jié)合能力差，可說明VP3表位具有構(gòu)象依賴性。由于VP4的分子量小，抗體對其捕獲能力較弱，與VP4蛋白無雜交帶。但是VP4抗血清與P1蛋白有一定的結(jié)合活性，可能是因為在變性的P1蛋白中VP4的構(gòu)象利于其與抗血清結(jié)合。VP4抗血清對不同形式的蛋白鑒別能力差異大，不適合作為檢測抗體。

綜上所述，本研究制備的VP1和VP2抗血清為ELISA和Western blot方法提供實驗材料。對于不同的流行株，采取軟件預測的方式合成多條表位肽，評估其應用價值，為毒株鑒定和疫苗研究提供檢測方法。