袁 磊， 林 芳， 張 麗， 王一欣， 王 豆

(陜西省食品藥品檢驗(yàn)所， 陜西 西安 710065)

HPLC法同時(shí)檢測食品中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉及安賽蜜

袁 磊， 林 芳， 張 麗， 王一欣， 王 豆

(陜西省食品藥品檢驗(yàn)所， 陜西 西安 710065)

建立高效液相色譜法同時(shí)檢測食品中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉與安賽蜜的方法。樣品經(jīng)水提取、亞鐵氰化鉀與乙酸鋅沉淀蛋白、氨水調(diào)pH值后離心處理，經(jīng)Agilent ZORBAX SB-Aq色譜柱分離，甲醇與0.02 mol/L乙酸銨溶液為流動(dòng)相梯度洗脫，流速為0.7 mL/min，采用二極管陣列檢測器檢測，波長230 nm，光譜掃描范圍為200～400 nm，采用保留時(shí)間與光譜進(jìn)行雙重定性。在14 min內(nèi)苯甲酸、山梨酸、糖精鈉與安賽蜜就能夠達(dá)到較好的分離，在1～100 μg/mL呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)大于0.999 8，檢出限0.5～1 mg/kg,不同類別產(chǎn)品加標(biāo)回收率在88.5%～98.4%之間，精密度<5%。結(jié)果表明，該方法適用范圍廣、靈敏度高、準(zhǔn)確性好，適用于各種食品中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉與安賽蜜的檢測。

苯甲酸； 山梨酸； 糖精鈉； 安賽蜜； 高效液相色譜法

苯甲酸、山梨酸與糖精鈉、安賽蜜是國際通用、高性價(jià)比的防腐劑與甜味劑，被廣泛應(yīng)用于食品中[1]。在食品生產(chǎn)中添加苯甲酸(鈉)、山梨酸(鉀)，能夠起到防腐、延長食品保質(zhì)期的作用；糖精鈉、安賽蜜作為合成的甜味劑，是普通甜味劑甜味的500倍與130倍[2]，逐漸替代了傳統(tǒng)的甜味劑而被應(yīng)用在食品生產(chǎn)中。過多的食用防腐劑與甜味劑會(huì)對人體產(chǎn)生嚴(yán)重危害[3-6]，因此國家標(biāo)準(zhǔn)對防腐劑與甜味劑的使用范圍與限量做了嚴(yán)格規(guī)定[7]，然而，這幾種添加劑仍存在濫用現(xiàn)象，有生產(chǎn)者將低于限量標(biāo)準(zhǔn)的幾種防腐劑與甜味劑混合使用以逃避監(jiān)管。目前檢測苯甲酸、山梨酸與糖精鈉的方法有液相色譜法[8-9]、氣相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法[10-12]，測定安賽蜜的方法有液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法[13]、液相色譜- 蒸發(fā)光散射法[14]、離子色譜法[15]。國家標(biāo)準(zhǔn)方法有GB/T 23495—2009《食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定 高效液相色譜法》、GB/T 5009.29—2003《食品中山梨酸、苯甲酸的測定》、GB/T 5009.140—2003《飲料中乙酰磺胺酸鉀的測定》。這些檢測方法覆蓋的食品種類少、前處理方法較復(fù)雜，檢測耗時(shí)長，不能同時(shí)測定多種甜味劑與防腐劑，而且只有飲料中安賽蜜的檢測方法，無疑給日常的檢測工作增加了難度與強(qiáng)度；因此，有必要建立一種同時(shí)檢測多種防腐劑與甜味劑，并適用于多種食品類別的檢測方法。

研究建立了一種同時(shí)測定苯甲酸、山梨酸、糖精鈉與安賽蜜的方法，該方法利用高效液相色譜系統(tǒng)- 梯度洗脫的方式，分離速率快、靈敏度高、適用于各種復(fù)雜基質(zhì)樣品的檢測，優(yōu)化了色譜條件，縮短了檢測時(shí)間，抗干擾能力更強(qiáng)，方法的適用范圍更廣，同時(shí)二極管陣列檢測器還可以對防腐劑與甜味劑進(jìn)行光譜定性，使檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、安賽蜜標(biāo)準(zhǔn)品，純度均為99.9%，均購于Supelco公司;甲醇(色譜級)，Macron公司;乙酸銨(色譜級)，Duksan公司；其他試劑均為分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；樣品為市售預(yù)包裝食品。

1.2 儀器與設(shè)備

U3000型高效液相色譜儀(帶二極管陣列檢測器)，美國Thermo公司；UV- 2600型紫外分光光度計(jì)，日本島津公司；PB- 10型酸度計(jì)，METTLER TOLEDO公司；LYNX4000型離心機(jī)，美國Thermo公司；HH- 1型水浴鍋，北京科偉公司；KQ- 500DE型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

苯甲酸、山梨酸儲(chǔ)備液配制：精密稱取苯甲酸、山梨酸適量，用碳酸氫鈉溶液(20 g/L)溶解，用水定容，配置成1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

糖精鈉、安賽蜜儲(chǔ)備液配制：精密稱取糖精鈉、安賽蜜適量，用水溶解定容，配置成1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.3.2色譜和光譜條件

Agilent ZORBAX SB-Aq型色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)，流速0.7 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，檢測波長230 nm，流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為0.02 mol/L乙酸銨溶液，梯度洗脫，洗脫時(shí)間17 min;光譜掃描范圍200～400 nm。

1.3.3樣品處理

1.3.3.1 固體樣品

樣品稱量前需搗碎混合均勻。

一般固體樣品、保健食品、醬腌菜：稱取5 g左右樣品于具塞三角瓶中，加一定量的水，超聲提取30 min,分別加入2 mL亞鐵氰化鉀溶液(106 g/L)與乙酸鋅溶液(220 g/L)，混勻，全部移至容量瓶中用水定容，混勻，靜置5 min后取部分上清液于離心管中，5 000 r/min離心5 min,上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，供分析用[16-17]；醬腌菜需將離心上清液用水至少1倍稀釋后經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，供分析用[18]。

蜜餞、水果干制品：稱取5 g左右的樣品于具塞三角瓶中，精密加入一定體積的水，超聲震蕩提取15 min，分別加入2.5 mL亞鐵氰化鉀溶液(106 g/L)與乙酸鋅溶液(220 g/L)，混勻，以加入液體總體積為其定容體積，取部分溶液于離心管中，5 000 r/min離心5 min，上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，供分析用[17-18]。

乳制品：稱取2 g左右的樣品于具塞三角瓶中，加10 mL的水使樣品溶解，加入25 mL氫氧化鈉溶液(0.1 mol/L)，混合后于70 ℃左右水浴鍋中放置15 min,期間震搖1～2次，冷卻后用硫酸溶液(0.5 mol/L)調(diào)pH值至近中性，分別加入2 mL亞鐵氰化鉀溶液(106 g/L)和乙酸鋅溶液(220 g/L)，混勻，全部轉(zhuǎn)移至容量瓶中用水定容，混勻，靜置5 min后取部分上清液于離心管中，5 000 r/min離心5 min,經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，供分析用[19-21]。

1.3.3.2 半固體樣品

含有膠基半固體樣品：稱取2 g左右的樣品于具塞三角瓶中，加一定量的水，于70 ℃左右超聲提取15 min,期間震搖1～2次，完全溶解后用氨水(體積比為1∶1)調(diào)pH值至近中性，分別加入2 mL亞鐵氰化鉀溶液(106 g/L)和乙酸鋅溶液(220 g/L)，混勻，轉(zhuǎn)移至容量瓶中用水定容，混勻，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，供分析用[22]。

油脂、奶油類樣品：前處理方法同乳制品。

1.3.3.3 液體樣品

稱取10 g左右的樣品于具塞三角瓶中(如含有乙醇需水浴除去)，加一定量的水，用氨水(體積比為1∶1)調(diào)pH值至近中性，轉(zhuǎn)移至容量瓶中用水定容，混勻，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，供分析用[23]；碳酸飲料、茶飲料、液體調(diào)味品需將濾液用水至少1倍稀釋后，供分析用[24-26]。

2 結(jié)果與分析

2.1 波長的選擇

將1.3.1配制的4種儲(chǔ)備液用水稀釋至50μg/mL,于紫外分光光度計(jì)下進(jìn)行波長掃描，掃描范圍為200～400 nm。苯甲酸最大吸收波長為230～260 nm,山梨酸最大吸收波長為220～240 nm,糖精鈉最大吸收波長為190～240 nm，安賽蜜的最大吸收波長為190～240 nm,見圖1。綜合掃描結(jié)果，波長230 nm能夠使4種物質(zhì)的響應(yīng)值達(dá)到最大，因此選定波長為230 nm。

圖1 苯甲酸、山梨酸、糖精鈉與安賽蜜最大紫外吸收波長掃描圖Fig.1 Maximum UV absorption wavelength scan of benzoic acid, sorbic acid, saccharin sodium, and acesulfame

2.2 流動(dòng)相及流速的選擇

為擴(kuò)大方法的適用性，色譜柱選用常規(guī)反相C18柱Agilent ZORBAX SB-Aq(250 mm×4.6 mm×5 μm)。根據(jù)文獻(xiàn)，常用的流動(dòng)相體系有甲醇- 乙酸銨溶液體系、甲醇- 磷酸二氫鉀溶液體系、甲醇- 0.1%甲酸溶液體系。由實(shí)驗(yàn)得，使用甲醇- 磷酸二氫鉀溶液體系4種物質(zhì)出峰時(shí)間較慢，達(dá)30 min左右；甲醇- 0.1%甲酸溶液體系的流動(dòng)相呈酸性，又因食品中加入的通常是苯甲酸鈉、山梨酸鉀，這些物質(zhì)在酸性條件下可轉(zhuǎn)化為苯甲酸、山梨酸，致使溶解度減弱，影響檢測，因此采用甲醇- 乙酸銨溶液體系。

用0.02 mol/L乙酸銨作流動(dòng)相，設(shè)定流速為1.0 mL/min,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)山梨酸與糖精鈉無法分離。將甲醇與0.02 mol/L乙酸銨按體積比10∶90配成流動(dòng)相，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)山梨酸與糖精鈉能夠分離，但苯甲酸與安賽蜜無法達(dá)到基線分離；因此采用梯度洗脫的方法分離。經(jīng)實(shí)驗(yàn)，利用洗脫方法能夠使4個(gè)組分完全分離，梯度洗脫條件見表1。用1.0 mL/min流速洗脫時(shí)，由于苯甲酸出峰較快，溶劑峰對其有干擾；流速調(diào)整到0.7 mL/min時(shí)延長了苯甲酸的出峰時(shí)間，能夠得到好的分離效果，見圖2。

表1 梯度洗脫條件

流動(dòng)相A為色譜甲醇，流動(dòng)相B為0.02 mol/L乙酸銨溶液。

圖2 4種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.2 Chromatogram of mixed 4 kinds of standard solution

2.3 線性關(guān)系與檢出限分析

將苯甲酸、山梨酸、糖精鈉與安賽蜜4種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成1.0，5.0，10.0，20.0，50.0，100.0 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用前述色譜條件進(jìn)樣，以對應(yīng)色譜圖的峰面積為縱坐標(biāo)(Y),以質(zhì)量濃度(X, μg/mL)為橫坐標(biāo)做線性回歸。結(jié)果表明，4種物質(zhì)在1～100 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999 8，說明該方法適用于苯甲酸、山梨酸、糖精鈉與安賽蜜的定量分析。在實(shí)驗(yàn)條件下，以對應(yīng)色譜峰響應(yīng)值10倍信噪比的質(zhì)量濃度為定量限的進(jìn)樣濃度，按取樣量為5 g,定容體積為50 mL,進(jìn)樣量為10 μL，計(jì)算得方法的檢出限為0.5～1 mg/kg，與國標(biāo)方法比較，檢出低于國家標(biāo)準(zhǔn)方法(見表2)。

表2 苯甲酸、山梨酸、糖精鈉與安賽蜜的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限與國標(biāo)檢出限

名稱回歸方程相關(guān)系數(shù)(r)檢出限/(mg·kg-1)國標(biāo)檢出限/(mg·kg-1)苯甲酸Y=065510X+056711099990518山梨酸Y=145465X+013637099990512糖精鈉Y=057917X+020869099991030安賽蜜Y=076513X+006371099980540

2.4 回收率與精密度的分析

根據(jù)食品的分類與基質(zhì)的不同，選取了不含有苯甲酸、山梨酸、糖精鈉與安賽蜜的配制酒、飲料、乳制品、焙烤食品(餅干)、醬腌菜、果醬、蜜餞、肉制品為樣品，加入3個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，使用2.3.3處理方法，每個(gè)添加水平平行做5份，每個(gè)樣品重復(fù)測定2次，計(jì)算不同樣品不同添加水平平均加標(biāo)回收率與精密度，結(jié)果見表3。由表3可以看出，不同樣品的加標(biāo)回收率在88.5%～98.4%，精密度<5%，回收率與精密度都在可接受范圍內(nèi)。加標(biāo)量越大，回收率越高，精密度越好。

表3 不同樣品加標(biāo)回收率與精密度檢測結(jié)果

2.5 不同食品檢測與光譜確證分析

使用上述方法對9種食品進(jìn)行了實(shí)際檢測，結(jié)果見表4，并對檢出的樣品進(jìn)行3D光譜比較，見圖3，結(jié)果顯示在各成分的保留時(shí)間處均未有干擾，說明本方法的使用范圍廣，特異性與抗干擾能力都很強(qiáng)，部分樣品的色譜圖與光譜圖見圖4～圖8。

圖3 苯甲酸、山梨酸、糖精鈉與安賽蜜紫外吸收光譜圖Fig.3 UV absorption spectrum of benzoic acid, sorbic acid, saccharin sodium, and acesulfame

3 結(jié) 論

研究建立了高效液相色譜法同時(shí)測定食品中的苯甲酸、山梨酸、糖精鈉與安賽蜜的方法，該方法與國標(biāo)比較減少了一個(gè)檢測體系，增加了方法的適用范圍，且回收率與穩(wěn)定性較好，檢測準(zhǔn)確，能夠滿足對食品中的苯甲酸、山梨酸、糖精鈉與安賽蜜的檢測要求和實(shí)際檢測工作需要，也為進(jìn)一步的方法開發(fā)提供了重要依據(jù)。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)樣品的pH值對檢測結(jié)果影響較大，過酸或過堿的樣品會(huì)造成目標(biāo)物峰飄移，使得無法定性，因此盡可能將樣品pH值調(diào)至近中性，消除了峰飄移的問題，也可使得苯甲酸、山梨酸以鹽的形式存在，增加提取效率，使檢測更加準(zhǔn)確。

表4 不同食品中添加劑檢測結(jié)果

N.D.表示未檢出。

圖4 果醬樣品檢測結(jié)果色譜圖Fig.4 Chromatogram of jams sample test results

圖5 果醬樣品中山梨酸光譜圖Fig.5 UV absorption spectrum of sorbic acid in jam samples

圖6 配制酒樣品檢測結(jié)果色譜圖Fig.6 Chromatogram of liquor sample test results

圖7 配制酒中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉紫外光譜圖Fig.7 UV absorption spectrum of benzoic acid, sorbic acid, and saccharin sodium in liquor samples

圖8 餅干中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、安賽蜜加標(biāo)色譜Fig.8 Chromatogram of benzoic acid, sorbic acid, saccharin sodium, and acesulfame in biscuits

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(責(zé)任編輯：張逸群)

SimultaneousDeterminationofBenzoicAcid,SorbicAcid,SaccharinSodiumandAcesulfameinFoodbyHPLC

YUAN Lei, LIN Fang, ZHANG Li, WANG Yixin, WANG Dou

(ShaanxiInstituteforFoodandDrugControl，Xi’an710065,China)

In this study, a method for simultaneous determination of benzoic acid, sorbic acid, saccharin sodium and acesulfame in food by HPLC was established. The samples were extracted by water, precipitated protein by potassium ferrocyanide and zinc acetate, adjusted pH with ammonia water and centrifuged. Agilent ZORBAX SB-Aq column was applied with mobile phase consisting of methanol and 0.02 mol/L ammonium acetate solution by gradient elution with a flow rate of 0.7 mL/min. Targets were detected by diode array detector detection with detection wavelength of 230 nm and a double qualitative determination of retention time and spectra was performed. The spectral scanning range was 200～400 nm. Benzoic acid, sorbic acid, saccharin sodium, and acesulfame K could be effectively separated within 14 min. A good linear relationship was obtained in the range of 1-100 μg/mL. The linear correlation coefficient was greater than 0.999 8. The average recoveries ranged from 88.5% to 98.4% and the precision less than 5%. The detection limits ranged from 1 mg/kg to 2 mg/kg. The method has wide application range, high sensitivity, and good accuracy, and is suitable for the detection of benzoic acid, sorbic acid, saccharin sodium, and acesulfame in various foods.

benzoic acid; sorbic acid; saccharin sodium; acesulfame; HPLC

10.3969/j.issn.2095-6002.2017.04.010

2095-6002(2017)04-0072-08

袁磊，林芳，張麗，等. HPLC法同時(shí)檢測食品中苯甲酸、山梨酸、糖精鈉及安賽蜜[J]. 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào)，2017,35(4):72-79. YUAN Lei, LIN Fang, ZHANG Li, et al. Simultaneous determination of benzoic acid, sorbic acid, saccharin sodium and acesulfame in food by HPLC[J]. Journal of Food Science and Technology, 2017,35(4):72-79.

2016-12-02

陜西省食品藥品快速檢測公共服務(wù)平臺(tái)建設(shè)項(xiàng)目(2014FWPT- 01)。

袁 磊，男，本科，主要從事食品安全性檢測與快速檢測方法的研究。

TS207.3; O657.72

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