張丹，鄭開(kāi)顏，王乾，侯芳潔，由會(huì)玲，高艷芝，王倩穎，鄭玉光*

(1.河北中醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，河北 石家莊 050200；2.河北中醫(yī)學(xué)院 實(shí)驗(yàn)中心，河北 石家莊 050200)

·中藥農(nóng)業(yè)·

國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口西洋參不同器官的品質(zhì)差異研究△

張丹1，鄭開(kāi)顏1，王乾1，侯芳潔1，由會(huì)玲1，高艷芝2，王倩穎1，鄭玉光1*

(1.河北中醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，河北 石家莊 050200；2.河北中醫(yī)學(xué)院 實(shí)驗(yàn)中心，河北 石家莊 050200)

目的：分析國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口西洋參不同器官的品質(zhì)差異。方法：采用高效液相色譜法(HPLC)同時(shí)測(cè)定遼寧產(chǎn)和加拿大產(chǎn)西洋參不同器官7個(gè)人參皂苷類成分(人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、 Rb3、Rd)的含量。色譜條件：色譜柱為Shimadzu inertsil ODS-2 C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈(A)-水(B)溶液，梯度洗脫0～60 min，22%～35% A。結(jié)果：西洋參莖葉中人參皂苷Rb3的含量較其他器官高，而遼寧產(chǎn)和加拿大產(chǎn)西洋參不同器官人參皂苷含量不具有顯著差異；7個(gè)人參皂苷類成分均達(dá)到基線分離，各成分均有較寬的線性范圍和良好的線性關(guān)系(r>0.999)；回收率在95.98%～103.76%。結(jié)論：以人參皂苷含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)來(lái)看，國(guó)產(chǎn)西洋參與加拿大產(chǎn)西洋參的不同器官的品質(zhì)不具有顯著差異，且西洋參不同器官人參皂苷含量也不具有顯著差異。該研究結(jié)果為西洋參不同器官的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供了依據(jù)。

西洋參；不同器官；高效液相色譜法(HPLC)；質(zhì)量評(píng)價(jià)

西洋參原產(chǎn)于美國(guó)北部和加拿大南部，作為藥食兩用產(chǎn)品已在我國(guó)有300余年的應(yīng)用歷史，為了改變長(zhǎng)期依靠進(jìn)口的歷史，我國(guó)于20世紀(jì)70年代開(kāi)始引種，目前已形成吉林、遼寧、山東和北京等主產(chǎn)區(qū)[1-4]?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》中，西洋參藥材為五加科植物西洋參PanaxquinquefoliusL.的干燥根，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、清熱生津的功效，主要用于氣虛陰虧、虛熱煩倦、咳喘痰血、內(nèi)熱消渴、口燥咽干等[5]。傳統(tǒng)意義上西洋參需要去蘆使用，而市場(chǎng)上在去蘆的基礎(chǔ)上又去須、去支根使用，其莖葉亦不入藥[6]。化學(xué)成分研究表明，西洋參主要活性成分為人參皂苷類，此外還含有多糖、多炔、多肽等類成分?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，西洋參具有多種活性，主要體現(xiàn)為抗腫瘤、降血壓、降血脂、抗疲勞等[7-11]。

近年來(lái)，針對(duì)西洋參化學(xué)成分、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等方面的研究報(bào)道較多[12-17]。在對(duì)西洋參各器官人參皂苷類差異的研究發(fā)現(xiàn)，其各器官(莖葉、主根、蘆頭、須根、支根等)人參皂苷類成分均相似，但莖葉以及須根中人參皂苷類成分的含量較高。由于目前各學(xué)者研究多基于國(guó)產(chǎn)西洋參或進(jìn)口西洋參的不同器官的研究，而未對(duì)兩者進(jìn)行對(duì)比研究[18-23]，因此，本研究基于此，闡明國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口西洋參的不同器官品質(zhì)差異，為西洋參的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用以及西洋參的國(guó)產(chǎn)化奠定理論基礎(chǔ)。本研究建立了一種基于HPLC-UV檢測(cè)西洋參不同器官人參皂苷的方法，分別對(duì)遼寧產(chǎn)和加拿大產(chǎn)西洋參莖葉、蘆頭、主根、須根、參節(jié)中人參皂苷的含量進(jìn)行研究，并通過(guò)相似度分析軟件進(jìn)行比較以及化學(xué)計(jì)量法進(jìn)行分析，在此基礎(chǔ)上對(duì)西洋參各器官進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，為西洋參的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

遼寧產(chǎn)和加拿大產(chǎn)西洋參藥材購(gòu)自安國(guó)藥材市場(chǎng)，經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)教研室鄭玉光教授鑒定為西洋參PanaxquinquefoliusL.的莖葉、蘆頭、主根、須根、參節(jié)。樣品信息見(jiàn)表1。

人參皂苷Rg1(批號(hào)：14052305)、Re(批號(hào)：14042905)、Rb1(批號(hào)：14102302)、Rc(批號(hào)：14102805)、Rb2(批號(hào)：14102804)、Rb3(批號(hào)：14050407)和Rd(批號(hào)：14122605)對(duì)照品購(gòu)自成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司，純度>98.0%；乙腈(色譜純，美國(guó)Fisher公司)，水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Shimadzu LC-20 AT 高效液相色譜儀；Shimadzu inertsil ODS-2高效液相色譜柱 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；Mettler-Toledo XS205 DU型電子分析天平。

表1 西洋參樣品詳細(xì)信息

注：短支指長(zhǎng)度1～5 cm；軟支指低溫烘干12～15 d。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Shimadzu Inertsil ODS-2 C18(250 mm ×4.6mm，5 μm)；流動(dòng)相乙腈 (A)-水(B) 溶液梯度洗脫，按程序洗脫(0～25 min，22%～26% A；25～30 min，26%～35% A；30～60 min，35%～35% A)；流速：1 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；理論塔板數(shù)按人參皂苷Rb1計(jì)算應(yīng)不低于5000。對(duì)照品及樣品(L1)圖譜見(jiàn)圖1。

注：A.對(duì)照品；B.樣品(L1)；1.人參皂苷Rg1；2.人參皂苷Re；3.人參皂苷Rb1；4.人參皂苷Rc；5.人參皂苷Rb2；6.人參皂苷Rb3；7.人參皂苷Rd。圖1 西洋參藥材(J3)的HPLC圖譜

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱定人參皂苷對(duì)照品適量，以甲醇為溶劑配制成對(duì)照品混合溶液，人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd的質(zhì)量濃度分別為0.238、0.524、1.450、0.172、0.106、0.102、0.200 mg·mL-1。

2.3 供試品溶液的制備

取西洋參樣品粉末(過(guò)三號(hào)篩)約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水飽和的正丁醇50 mL，稱定重量，置水浴中加熱回流提取1.5 h，放冷，再稱定重量，用水飽和正丁醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液25 mL，置蒸發(fā)皿中，蒸干，殘?jiān)蛹状歼m量使溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得[5]。

3 結(jié)果與分析

3.1 含量測(cè)定

3.1.1 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品混合溶液0.5、1、2、4、8、16、20、30、50、80 μL，分別注入HPLC中，按照2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積。結(jié)果以峰面積為縱坐標(biāo)，以各單體皂苷的量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程和線性范圍，結(jié)果見(jiàn)表2，各成分在各自質(zhì)量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 7種人參皂苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍

3.1.2 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL，在2.1項(xiàng)色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，以峰面積為指標(biāo)計(jì)算7個(gè)成分的RSD(n=6)，考察精密度。人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd的RSD分別為1.5%、1.4%、2.1%、1.8%、2.3%、1.6%、2.1%，說(shuō)明儀器精密度良好。

3.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一西洋參(L1)供試品溶液，分別在供試品溶液制備后第0、2、6、12、18、24 h進(jìn)樣，以3號(hào)峰為參照峰，各特征峰保留時(shí)間的RSD<3.0%，相對(duì)峰面積的RSD<3.0%，表明供試品溶液在制備后24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.1.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批西洋參( L1) 粉末約1 g，平行6份，精密稱定，按2.3項(xiàng)下方法處理，2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄特征圖譜，以3號(hào)峰為參照峰，各特征峰保留時(shí)間的RSD<3.0%，相對(duì)峰面積的RSD<3.0%，表明該方法的重復(fù)性良好。

3.1.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量(L1)的西洋參藥材樣品約1 g，平行6份，精密稱定，分別加入對(duì)照品適量，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算7個(gè)成分的加樣回收率。人參皂苷Rg1、Re、 Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd的平均回收率為97.24%、99.67%、101.35%、103.76%、95.98%、98.78%、97.89%，RSD分別為2.3%、1.9%、1.2%、1.5%、2.4%、1.9%、2.1%。

3.1.6 樣品的含量測(cè)定 按照2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別測(cè)定樣品中人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 西洋參不同器官7種人參皂苷成分的含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3.2 相似度分析

遼寧產(chǎn)和加拿大產(chǎn)西洋參樣品的色譜圖見(jiàn)圖2，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004 A版”軟件對(duì)西洋參不同器官色譜圖進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，確定共有峰23個(gè)，生成對(duì)照色譜圖譜見(jiàn)圖3。西洋參不同器官HPLC色圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜比對(duì)，結(jié)果表明西洋參不同器官人參皂苷類成分具有較好的相似度，遼寧產(chǎn)和加拿大產(chǎn)西洋參間亦不存在顯著差異。結(jié)果見(jiàn)表4。

注：S1～S6.L1～L6；S7～S11.J1～J5。圖2 西洋參不同器官HPLC色譜圖

圖3 西洋參不同器官對(duì)照色譜圖

編號(hào)相似度xRSD(%)L1097609182355L20986L30993L40976L50959L60267J10986J20986J30995J40984J50992

3.3 結(jié)合化學(xué)計(jì)量法的不同商品規(guī)格西洋參藥材質(zhì)量對(duì)比分析

為了驗(yàn)證已建立的西洋參的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，同時(shí)進(jìn)一步說(shuō)明西洋參不同器官的內(nèi)在品質(zhì)差異，本研究運(yùn)用多種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，確保結(jié)果可靠準(zhǔn)確。

3.3.1 系統(tǒng)聚類分析 運(yùn)用SPSS 22.0軟件對(duì)本實(shí)驗(yàn)西洋參不同器官的HPLC圖譜進(jìn)行聚類分析。其中將7個(gè)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、質(zhì)量分?jǐn)?shù)之和以及相似度作為原變量，所有數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化處理，聚類方法采用組間連接法及平方歐式距離法，結(jié)果見(jiàn)圖4。

由系統(tǒng)分類樹(shù)狀圖(圖4)可以看出，在距離<15時(shí)被分為兩類，其中遼寧產(chǎn)莖葉(L6)單獨(dú)一類，可見(jiàn)西洋參莖葉、根、蘆頭等不同器官人參皂苷類成分具有一定的差異，主要表現(xiàn)為所含人參皂苷類成分種類無(wú)差異，而含量上差異較大，與相似度分析結(jié)果相一致。遼寧產(chǎn)和加拿大產(chǎn)西洋參各器官基本可歸為一類，說(shuō)明國(guó)產(chǎn)西洋參和進(jìn)口西洋參之間的品質(zhì)不具有顯著差異。

圖4 西洋參藥材聚類分析樹(shù)狀圖

3.3.2 主成分分析 在聚類分析的基礎(chǔ)上，對(duì)原變量進(jìn)行主成分分析。提取1個(gè)主成分Z1和Z2，累計(jì)貢獻(xiàn)率為79.114%，其中Z1貢獻(xiàn)42.093%，Z2貢獻(xiàn)37.021%，以2個(gè)主成分建立坐標(biāo)系得到的PCA投影圖見(jiàn)圖5。其主成分得分分布圖的結(jié)果與聚類分析結(jié)果相一致，樣品L6和J5單獨(dú)成類，與其他樣品差異性較大。

圖5 西洋參樣品主成分得分分布圖

4 結(jié)論

本研究運(yùn)用HPLC-UV法同時(shí)測(cè)定西洋參不同器官中7個(gè)人參皂苷類成分的含量，并對(duì)西洋參不同器官的HPLC圖譜進(jìn)行相似度分析，在相似度分析的基礎(chǔ)上進(jìn)行了化學(xué)計(jì)量學(xué)分析，結(jié)果表明西洋參莖葉與其他器官人參皂苷類成分的含量差異性較大。所有檢測(cè)成分在60 min內(nèi)完成分離和測(cè)定，相比2015版《中華人民共和國(guó)藥典》分析條件，縮短了分析時(shí)間，并可同時(shí)進(jìn)行成分定量[5]。

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC同時(shí)測(cè)定了遼寧產(chǎn)和加拿大產(chǎn)西洋參的莖葉、蘆頭、根、參節(jié)和參須的7個(gè)人參皂苷類成分的含量，并對(duì)西洋參藥材液相圖譜進(jìn)行聚類分析和主成分分析，結(jié)果表明遼寧產(chǎn)與加拿大產(chǎn)西洋參間品質(zhì)并無(wú)顯著差異，以人參皂苷類成分的指標(biāo)對(duì)遼寧產(chǎn)和加拿大產(chǎn)西洋參進(jìn)行區(qū)別不具有特征性，可能與本文收集的樣品批次較少有關(guān)，需要放大樣本量來(lái)驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)的結(jié)論，這是筆者接下來(lái)要探索的方向。目前市場(chǎng)銷售的西洋參藥材“個(gè)子貨”皆去蘆、去節(jié)、去須為用，從本研究中發(fā)現(xiàn)西洋參根、蘆頭、參節(jié)和參須的成分基本相似，其他器官含量甚至高于主根，單從化學(xué)成分角度分析，西洋參產(chǎn)地加工可不去蘆、節(jié)、須用，避免一定的資源浪費(fèi)。西洋參莖葉中化學(xué)成分類型和種類與根中相似，其中人參皂苷Rb3和Rd的含量較高，具有一定的開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值。

本文所采用的HPLC含量測(cè)定結(jié)合模式識(shí)別的方法可在一定程度上表征西洋參不同器官在化學(xué)成分方法的差別。但是，由于西洋參化學(xué)成分的復(fù)雜性，單純的化學(xué)成分的分析并不能很好地反映西洋參不同器官用藥的差異性，不能從根本上體現(xiàn)出西洋參不同器官臨床應(yīng)用的異同。因此，在化學(xué)評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)上，若能將藥效與物質(zhì)基礎(chǔ)結(jié)合起來(lái)，深入開(kāi)展譜效學(xué)研究，則更有利于闡明西洋參不同器官的藥用價(jià)值以及不同產(chǎn)地西洋參藥材品質(zhì)的差異。

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StudyonQualityDifferenceBetweenDomesticandImportedAmericanGinseng

ZHANGDan1，ZHENGKaiyan1，WANGQian1，HOUFangjie1，YOUHuiling1，GAOYanzhi2，WANGQianying，ZHENGYuguang1*

(1.CollegeofPharmacy，HebeiUniversityofChineseMedicine，Shijiazhuang050200，China；2.Experimentcenter，HebeiUniversityofChineseMedicine，Shijiazhuang050200，China)

Objective：To analyze the quality differences between domestic and imported American ginseng in different parts.Methods：By using the HPLC method for the simultaneous determination of 7 kinds of ginsenosides (ginsenoside Rg1，Re，Rb1，Rc，Rb2，Rb3，Rd) content of American ginseng in different parts，which from Liaoning and Canada.The chromatographic conditions were as follows：the chromatographic column Shimadzu inertsil ODS-2 column (250 mm×4.6 mm，5 μm).The mobile phase consisted of acetonitrile (A)-water (B) solution，gradient elution 0-60 min，22%-35% A.Results：The content of ginsenoside Rb3in stems and leaves of American ginseng was higher than that in other parts，and there were no significant different between American ginseng from Liaoning and Canada，seven kinds of components were reached the baseline separation，each component had a wide linear range and good linear relationship (r>0.999).Recovery rates were 95.98%-103.76%.Conclusion：The established method is accurate，sensitive and reproducible，and can be used in quality evaluation of American ginseng in different parts.

American ginseng；different parts；HPLC；quality evaluation

河北省中醫(yī)藥管理局科研計(jì)劃項(xiàng)目(2015079)；河北中醫(yī)學(xué)院博士科研基金(BSZ2015004)；河北省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201614432029)

] 鄭玉光，教授，研究方向：中藥資源學(xué)；Tel：(0311)89926316；E-mail：zyg314@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.6.019

2016-10-10)

*[