丁 康，張 輝，譚妍妍，朱維娜，李芷薇，陸 蔚，李睿瑛，趙 敏，丁 洋， 李 猛， 黃士財，丁義江，張?zhí)K閩

(南京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院 1. 肛腸科、2. 檢驗科、3. 中心實驗室，江蘇 南京 210001；南京中醫(yī)藥大學 4. 藥學院，5. 第一臨床醫(yī)學院，江蘇 南京 210023)

基于蛋白芯片技術探討丁氏潰結灌腸液對結腸炎大鼠腸道組織差異蛋白表達的影響

丁 康1，張 輝2，譚妍妍1，朱維娜3，李芷薇4，陸 蔚5，李睿瑛5，趙 敏5，丁 洋5， 李 猛5， 黃士財5，丁義江1，張?zhí)K閩1

(南京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院 1. 肛腸科、2. 檢驗科、3. 中心實驗室，江蘇 南京 210001；南京中醫(yī)藥大學 4. 藥學院，5. 第一臨床醫(yī)學院，江蘇 南京 210023)

目的基于蛋白芯片技術探討丁氏潰結灌腸液對結腸炎大鼠腸道組織相關靶點的影響，闡釋丁氏潰結灌腸液改善腸道炎癥反應及腸纖維化的可能機制。方法大鼠隨機分為陽性藥組、模型組、正常組、丁氏潰結灌腸液組，5只/組。除正常組之外，其他3組均給予3.5%硫酸葡聚糖鈉(dextran sulfate sodium, DSS)喂養(yǎng)，結腸炎造模成功后，陽性藥組使用美沙拉秦灌腸，丁氏潰結灌腸液組使用丁氏潰結灌腸液灌腸，每天1次，連續(xù)4周，停藥1 d后，取大鼠結腸黏膜組織，采用GSR-CAA-67抗體蛋白芯片技術檢測各組大鼠腸道組織炎癥反應及腸纖維化相關蛋白的變化，篩選出各組差異性表達的蛋白。結果通過蛋白芯片檢測，發(fā)現共有8種有意義的差異蛋白，其中模型組和空白組對照組對比篩選出的8種蛋白包括IFN-γ、促紅細胞生成素(erythropoietin, EPO)、TIMP-2、TIM-1、 IL-6、TIMP-1、TNF-α、IL-22，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。另一方面，丁氏潰結灌腸液與美沙拉秦均對IL-6、TIMP-1有明顯的抑制作用(P<0.05)，丁氏潰結灌腸液對TNF-α、IL-22有抑制作用(P<0.05)，美沙拉秦組則沒有相同作用(P>0.05)。結論丁氏潰結灌腸液具有多靶點的作用，可能通過改善腸道炎癥反應及腸纖維化達到治療潰瘍性結腸炎的目的。

蛋白芯片；丁氏潰結灌腸液；差異蛋白；潰瘍性結腸炎；大鼠；腸纖維化

丁氏潰結灌腸液為國家級非物質文化遺產“丁氏中醫(yī)診療法”第八代傳人丁澤民教授的經典方，具有清熱利濕解毒、活血化瘀、怯腐生肌之功效，以中醫(yī)治法理論為依據，藥物組成主要包括金銀花、地榆、白及、珠黃散(乳香、珍珠粉、輕粉等)[1-2]，針對不同潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)患者、不同發(fā)病特點均可進行治療，其在全國肛腸中心運用于臨床50余年，有極好的療效。前期的研究發(fā)現，丁氏潰結灌腸液有著良好的療效[3-4]，并且揭示了其有可能治療的靶點和炎癥因子相關，具有較好的抗炎、修復黏膜和促進潰瘍愈合的作用[5]。但缺乏完善的中醫(yī)理論的科學內涵研究，從而限制了其推廣應用，進一步的研究希望通過高密度、高通量、高特異性的蛋白芯片技術在動物實驗層面，全面考察丁氏潰結灌腸液通過改善哪些差異性靶點的表達而起作用。1材料與方法

1.1實驗動物健康 SD 大鼠，20 只，SPF 級，體質量180～220 g，♀♂各半，浙江省實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK(浙)2014-0001。

1.2藥物與試劑硫酸葡聚糖鈉(dextran sulfate sodium, DSS)購自美國 MP 公司，批號：MP16011090；ELISA 試 劑 盒 購 自 Multisciences 公司，批號：237450922；GSR-CAA-67試劑盒購自RayBiotech公司，藥物為南京市中醫(yī)院院內制劑丁氏潰結灌腸液(處方包括：金銀花 120 g、地榆 120 g、白及 40 g、復方珠黃散 20 g)，蘇藥制字：Z040001781；美沙拉秦灌腸液由德國Falk公司生產60 g/4 g，批號：H20100253。

1.3方法

1.3.1造模與分組 20只SD大鼠隨機選取5只大鼠作為空白對照組，其余15只大鼠通過DSS法建立急性期潰瘍性結腸炎的大鼠模型。將DSS用蒸餾水配制成3.5%的溶液，造模組大鼠自由飲用，現喝現配，連飲7 d，空白對照組大鼠飲用純水。造模組大鼠出現腹瀉、便血、體重下降等癥狀，說明模型復制成功。造模成功后，將UC模型大鼠隨機分為3組，分別為模型組、美沙拉秦灌腸液組和潰結灌腸液組，每組5只。停飲DSS，各組飲水恢復正常，開始灌腸給藥。按非標準體重動物的校正系數表，人與大鼠換算系數為6.17，折算大鼠用藥量為6 g·kg-1灌腸，美沙拉秦灌腸液組予美沙拉秦灌腸液2.4 g·kg-1灌腸，灌腸量均10mL·kg-1。模型組大鼠給予等劑量生理鹽水灌腸，空白對照組自由喂養(yǎng)，不予灌腸處理。灌腸3 d后，除空白對照組外，其余各組復飲4% DSS 5 d，同時繼續(xù)灌腸治療，7 d后停飲DSS，恢復正常飲水，再繼續(xù)灌腸治療6 d，按照標準操作流程將大鼠處死后，取20個腸道組織樣本，采用RayBiotech試劑盒進行檢測。

1.3.2采用GSR-CAA-67蛋白芯片技術結合數據分析軟件進行數據分析

1.3.2.1芯片檢測原理及指標 見Fig 1、Tab 1。

1.3.2.2蛋白芯片實驗步驟 ① 組織裂解：按100 mg組織加入500 μL裂解液，冰上裂解；在冰上用高速分散切割機進行破碎組織，離心取上清。②芯片操作流程：每個孔中加100 μL的樣品稀釋液，添加100 μL的標準液和樣品到孔中，在搖床4℃過夜孵育。使用Thermo Scientific Wellwash Versa芯片洗板機清洗玻片。檢測抗體混合物的孵育Cy3-鏈霉親和素的孵育，采用激光掃描儀例如Inno Scan300掃描信號，采用Cy3或者綠色通道(激發(fā)頻率=532nm)。

2 結果

通過GSR-CAA-67芯片篩查共驗證B7-2、β-NGF、CINC-1、CINC-2、CINC-3、CNTF、Fractalkine、GM-CSF、ICAM-1、IFN-γ、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-13、LIX、L-Selectin、MCP-1、PDGF-AA、Prolactin R、RAGE、TCK-1、TIMP-1、TNF-α、VEGF、4-1BB、Activin A、Adiponectin、B7-1、CD48、CTACK、Decorin、Eotaxin、EphA5、Erythropoietin、FGF-BP、Flt-3L、Galectin-1、Galectin-3、Gas 1、GFR alpha-1、gp130、HGF、IL-1 R6、IL-1 rα、IL-2 Rα、IL-3、IL-7、IL-17F、IL-22、JAM-A、MIP-1α、Neuropilin-1、Neuropilin-2、Nope、Notch-1、Notch-2、P-Cadherin、Prolactin、RANTES、SCF、TIM-1、TIMP-2、TREM-1、TWEAK R共67種蛋白，其中篩選出8種在模型組與空白對照組之間差異有統(tǒng)計學意義的蛋白(Tab 2、Fig 2)。

Tab 1 Protein array indicators (according to names alphabetically)

Fig 1 Detection principle of protein array

針對8種差異蛋白進行統(tǒng)計及作圖，Fig 3顯示，模型組與空白對照組比較，有4種蛋白IFN-γ、EPO、TIMP-2和TIM-1差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而丁氏潰結灌腸液及美沙拉秦組與模型組比較沒有明顯的變化(P>0.05)，提示兩種藥物對上述靶點沒有改善作用。Fig 4結果顯示，模型組和空白組與對照組比較，有另外4種蛋白IL-6、TIMP-1、TNF-α和IL-22差異亦有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，丁氏潰結灌腸液與美沙拉秦均對IL-6、TIMP-1蛋白表達有明顯抑制作用(P<0.05)，此外，丁氏潰結灌腸液對TNF-α、IL-22蛋白表達也有明顯抑制作用(P<0.05)，美沙拉秦組則沒有類似作用(P<0.05)。3討論

丁氏潰結灌腸液是國家非物質文化遺產丁氏診療法所涉及方藥的重要組成部分，本課題組長期開展此復方的臨床研究，取得了較滿意的結果。發(fā)現治療后UC患者的膿血便、黏液便和潰瘍病變均明顯改善。與陽性藥物對比，患者在大便次數、Sourtherland DAI評分、有效率方面的差異有統(tǒng)計學意義，說明丁氏潰結灌腸液在療效上不劣于陽性藥，可為臨床提供一種副作用小、安全可靠的補充治療方法。鑒于丁氏潰結灌腸液在UC的治療上取得了明顯的療效，課題組跟蹤南京中醫(yī)院治療UC處方中發(fā)現此制劑使用量極大，近5年的年用量均在萬瓶以上，且呈逐年增加之勢，經濟效益明顯，其確切的療效深受廣大患者的認同，下一步需要對其治療機制進行科學研究。高密度、高通量、高特異性的蛋白芯片技術在生物標志物的篩查、疾病機制探究等方面應用廣泛，能避免盲目挑選細胞因子，省時省力并節(jié)省寶貴的樣品。本課題組希望通過此技術全面考察丁氏潰結灌腸液是通過改善哪些蛋白靶點的表達從而發(fā)揮作用。

Tab 2 Difference expression of proteins in rat intestinal tissues(±s)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;△P<0.05,△△P<0.01vsmodel

Fig 2 Fluorescence signal intensity picture

Fig 3 Tendency of differences in protein(IFN-γ, erythropoietin, TIM-1, TIMP-2)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

UC患者具有慢性復發(fā)和遷延難愈的特點，其慢性非特異性炎癥引發(fā)了機體對結腸壁反復的修復，細胞外基質(extracellular matrix，ECM)合成分泌增加，降解減少，在組織內過度沉積，導致原有正常結構和組織形態(tài)改變，腸道縮短，腸纖維化形成[6]。長期嚴重的組織纖維化，將導致大量的組織細胞被膠原纖維與 ECM 所替代，從而引發(fā)臟器功能下降，并引起腸腔狹窄和腸壁順從性喪失，患者腹痛、腹瀉等癥狀加重， 既然腸纖維化是 UC發(fā)病過程中常見的嚴重并發(fā)癥，其發(fā)生發(fā)展是個復雜多變的過程，針對于此的治療非常重要。UC 的治療主要應用柳氮磺胺吡啶(SASP)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)抗體和白細胞介素-10 (IL-10)等，均對于纖維化無能為力。腸纖維化的形成與ECM合成增加的病理改變、腸道肌層的過度生長密切相關，而基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)/基質金屬蛋白酶組織抑制物(tissue inhibitors of metalloproteinases, TIMPs)平衡對維持ECM的正常代謝至關重要。研究發(fā)現，MMPs可降解過多生成的ECM，TIMPs則導致ECM降解異常，因此，MMPs與TIMPs的失衡則導致腸纖維化[7]。己發(fā)現的TIMPs 酶有4種，TIMP-1 (28 ku)廣泛存在于組織和體液中，能被多種細胞因子誘導產生，在腸纖維化的發(fā)生中起著重要作用。本實驗中，DSS造模后TIMP-1表達明顯上升，MMPs活性被抑制，進一步導致腸道纖維化的發(fā)生，而中藥可能是通過抑制 TIMP-1 mRNA及蛋白表達而降低對MMPs的抑制，有利于 MMPs對ECM的降解，阻止腸纖維化的發(fā)生，從而達到治療的目的，可以彌補通過改善纖維化的過程治療UC的空白。

UC的發(fā)生與感染、環(huán)境、免疫以及遺傳等多種因素有關，但具體機制尚不清楚，有報道，免疫調節(jié)機制中炎癥細胞因子在UC的發(fā)病中可能發(fā)揮重要作用[8]。 促炎細胞因子如 TNF-α、IL-6等的過度產生和抑炎因子如 IL-22 等生成不足，IL-22又具有雙向作用，在某些環(huán)境下表現出抗炎活性，而在另一些環(huán)境中可表現為放大炎癥反應，炎癥細胞因子導致腸道內環(huán)境紊亂是促使UC發(fā)生的重要環(huán)節(jié)[9]。TNF-α 是炎癥性腸病，特別是潰瘍性結腸炎病理進

Fig 4 Tendency of differences in protein(IL-6, TIMP-1, TNF-α, IL-22)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;△P<0.05,△△P<0.01vsmodel

程中的關鍵細胞因子，通過表達黏附分子、成纖維增殖因子、凝血因子以及啟動細胞毒性、凋亡和急性期反應等過程發(fā)揮作用。IL-6是一種免疫調節(jié)細胞因子，在炎癥反應中啟動了細胞表面信號復合體(包括 IL-6、sIL-6R及共享信號受體gp130)發(fā)揮作用。亦有研究表明，中藥的提取物可減輕DSS誘導的小鼠體重下降，改變腸損傷程度，其機制與降低TNF-α、IL-6水平有關[10]。在UC發(fā)病機制及隨后的UC相關結腸腫瘤形成中，IL-6主要通過STAT3信號通路發(fā)揮重要作用[11]。IL-22/JAK-STAT通路也是UC發(fā)病機制中的重要信號通路，STAT3的磷酸化是IL-22在上皮細胞屏障表面介導效應的基本途徑。已經證實了在口服葡聚糖硫酸鈉誘導結腸炎腸上皮細胞，STAT3活化更依賴IL-22[12]。也有研究發(fā)現，IL-22/STAT3信號通路與UC及其致癌作用相關，IL-22及受體在UC及不典型增生患者結腸黏膜中表達升高，并且使STAT3磷酸化[13]。本實驗中，模型組和空白對照組相比，炎癥細胞因子IL-6、TNF-α、IL-22差異均有統(tǒng)計學意義，丁氏潰結灌腸液對IL-6、TNF-α、IL-22的異常表達均有抑制作用，表明丁氏潰結灌腸液可通過改善腸道炎癥反應起到治療UC的作用。

總之，本研究初步發(fā)現國家級非物質文化遺產丁氏潰結灌腸液可能通過改善腸道炎癥反應及腸纖維化，達到治療UC的目的，進一步的研究將對可能機制進行實驗驗證及深入探討。

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EffectofDing’sherbenemaprescriptiononintestinaltissuerelateddifferencestargetinratcolitisusingproteinarraytechnology

DING Kang1, ZHANG Hui2, TAN Yan-yan1, ZHU Wei-na3, LI Zhi-wei4, LU Wei5, LI Rui-ying5, ZHAO Min5, DING Yang5, LI Meng5, HUANG Shi-cai5, DING Yi-jiang1, ZHANG Su-min1

(1.NationalCenterofColorectalSurgery, 2.ClinicalLaboratory, 3.CentralLaboratory,theThirdAffiliatedHospitalofNanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210001,China; 4.SchoolofPharmacy,NanjingUniversityofChineseMedicine, 5.theFirstClinicalMedicalCollege,NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023,China)

AimTo investigate the effect of Ding’s herb enema prescription on intestinal tissue related target in rat colitis induced by dextran sulfate sodium(DSS), and to elucidate the mechanism of Ding’s herb enema prescription in improving the intestinal inflammation and intestinal fibrosis.MethodsRats were fed with 3.5% DSS. The rats were randomly divided into positive drug group, model group, Control group, and Ding’s herb enema prescription group. The positive drug group was treated with mesalazine enema, and Ding’s herb enema prescription group was treated with Ding’s herb enema prescription. The colon mucosa was taken once a day for 6 weeks. The changes of intestinal inflammatory response and intestinal fibrosis related proteins were detected by GSR-CAA-67 antibody protein array, and the differentially expressed proteins were screened out.ResultsEight proteins showed statistical differences, including IFN-γ, erythropoietin(EPO), TIMP-2, TIM-1, IL-6, TIMP-1, TNF-α, IL-22 (P<0.05). On the other hand, Ding’s herb enema prescription and mesalazine significantly antagonized the effect of IL-6 and TIMP-1 (P<0.05). The antagonized effect of Ding's embolization enema on TNF-α and IL-22 was also significant(P<0.05), but mesalazine had no similar effect (P>0.05).ConclusionsDing’s herb enema prescription has the effect of multiple targets, which may improve the intestinal inflammatory response and intestinal fibrosis to achieve the purpose of treatment of ulcerative colitis(UC).

protein array; Ding’s herb enema prescription; differences protein; ulcerative colitis; rat colitis induced by DSS; intestinal fibrosis

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.10.028

A

：1001-1978(2017)10-1473-06

R-332；R289.1；R322.45；R394-33；R452；R574.62；R977.6

時間：2017-9-5 9:26 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170905.0925.056.html

2017-06-10,

2017-08-26

江蘇省自然科學基金資助項目(No BK-20151082)；南京市衛(wèi)計委重點項目(No ZKX16056)；江蘇省普通高校專業(yè)學位研究生實踐創(chuàng)新計劃項目(No SJZZ16_0174)；2016年度博士后科研資助項目(No BSH201501)

丁 康(1980-)，男，博士，研究方向：炎癥性腸病臨床及基礎，E-mail：dingkang1980@163.com； 張?zhí)K閩(1956-)，男，教授，碩士生導師，研究方向：炎癥性腸病臨床及基礎，通訊作者，E-mail：51422503@qq.com； 丁義江(1946-)，男，教授，博士生導師，研究方向：國家級非物質文化遺產丁氏痔科醫(yī)術的傳承及發(fā)展，通訊作者，E-mail：49280159@qq.com