朱沖沖 彭 冰 曾祖平 韓旭陽 王 宏 王天園

(首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院北京市中醫(yī)研究所，北京，100010)

中藥研究

香鱗毛蕨95%乙醇提取物的急性毒性研究

朱沖沖 彭 冰 曾祖平 韓旭陽 王 宏 王天園

(首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院北京市中醫(yī)研究所，北京，100010)

目的：探討香鱗毛蕨95%乙醇提取物對小鼠的急性毒性。方法：采用健康昆明種小鼠，灌胃給予香鱗毛蕨95%乙醇提取物，給藥劑量范圍為10.00 g/kg～24.00 g/kg，觀察小鼠中毒癥狀并記錄死亡動物情況，采用Bliss法測定半數致死量(LD50，Median Lethal Dose)；灌胃給予香鱗毛蕨95%乙醇提取物，給藥劑量分別為32 g/kg、16 g/kg、8 g/kg，對各組小鼠進行生化檢查和病理組織形態(tài)學檢查。結果：香鱗毛蕨95%乙醇提取物的小鼠LD50為13.53 g/kg；病變部位為心肌凝固性壞死，腎皮質、髓質內可見腎小管變性壞死脫落，肝細胞輕度濁腫，空泡變性，脾臟及肺臟等未見明顯病變。結論：香鱗毛蕨95%乙醇提取物具有一定的毒性。

香鱗毛蕨；急性毒性；LD50

香鱗毛蕨Dryopterisfragrans(L.)Schott是鱗毛蕨科Dryopteridaceae鱗毛蕨屬DryopterisAdans.植物，多生長于高寒地區(qū)的滑石坡、森林中的碎石坡和火山周圍的巖漿縫隙中，主要分布于我國東北、華北各省，俄羅斯、日本、朝鮮以至歐洲、北美洲亦都有分布[1]。間苯三酚類化合物是鱗毛蕨屬植物的特征性化學成分，也是產生藥理活性的主要成分，有研究發(fā)現香鱗毛蕨95%乙醇提取物中間苯三酚類含量最高[2-3]。范華倩[2]等發(fā)現香鱗毛蕨95%乙醇提取液中間苯三酚含量最高，且對紅色毛癬菌、犬子孢子菌等有一定的抑制作用。樊銳鋒等[4]發(fā)現間苯三酚類衍生物含量越高，香鱗毛蕨提取物抑菌效果越好。

香鱗毛蕨的化學成分結構類型主要有間苯三酚類、萜類、黃酮類等。目前對香鱗毛蕨的生物活性研究主要集中在抗腫瘤[5-9]、抗菌[10-14]、抗氧化[15]、抗炎[16]及治療皮膚病[17]等方面，未見對其毒性研究的報道。本課題前期實驗中發(fā)現香鱗毛蕨水提物和香鱗毛蕨30%乙醇提取物對小鼠無毒性，其60%乙醇提取物及95%乙醇提取物對小鼠有一定的毒性，且95%乙醇提取物毒性相比60%乙醇提取物毒性更大，因此，本研究進行了對香鱗毛蕨95%乙醇提取物的急性毒性研究，為其安全合理使用提供一定依據。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康昆明種小鼠，雌雄各半，18～22 g，由中國食品藥品檢定研究院提供，動物許可證編號SCXK(京)20140013。小鼠在SPF級動物室適應性飼養(yǎng)2 d，自由攝食、飲水，室溫22～26 ℃，濕度30% ～50%。

1.1.2 藥物 香鱗毛蕨采自黑龍江省五大連池地區(qū)，由北京中醫(yī)藥大學中藥學院高增平教授鑒定為Dryopterisfragrans(L.)Schott，憑證標本(DF0110801)保存于北京市中醫(yī)研究所。

取香鱗毛蕨粗粉適量，加12倍95%乙醇，浸0.6 h，超聲提取0.6 h，抽濾，減壓濃縮至無醇味，加入0.5%羧甲基纖維素鈉溶液制成含生藥2 g/mL的混懸液，依次稀釋得各濃度混懸液。

1.1.3 試劑與儀器 羧甲基纖維素鈉(F20070608，國藥集團化學試劑有限公司)；尿素氮(BUN，20160526，英科新創(chuàng)(廈門)科技有限公司)；谷丙轉氨酶(ALT，20160526，英科新創(chuàng)(廈門)科技有限公司)；谷草轉氨酶(AST，20160526，英科新創(chuàng)(廈門)科技有限公司)；肌酐(CR，20160615，北京科美生物技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 60只健康昆明小鼠隨機分為6組，每組10只，雌雄各半，分別為：空白對照組，香鱗毛蕨95%乙醇提取物24.00 g/kg組，19.20 g/kg組，15.36 g/kg組，12.29 g/kg組，10.00 g/kg組。采用Bliss計算半數致死量(LD50)及95%可信區(qū)間。

40只健康昆明小鼠水機分為4組，每組10只，雌雄各半，分別為：空白對照組，香鱗毛蕨95%乙醇提取物32 g/kg組(H)，16 g/kg組(M)，8 g/kg組(L)。進行組織病理學檢查和血清生化檢測。

1.2.2 給藥方法 實驗前禁食不禁水16 h，次日上午灌胃給藥1次，按體積40 mL/kg小鼠體重灌胃。空白對照組灌胃等量0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，其他各給藥組分別灌胃各對應濃度藥物，常規(guī)飼養(yǎng)，連續(xù)觀察8 d，記錄動物反應及死亡情況。

1.2.3 取材與檢測方法 對死亡的動物及時進行解剖尸檢，肉眼觀察各臟器，記錄病變情況。取其心、肝、脾、肺、腎臟，經10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，顯微鏡下進行形態(tài)足學檢查；

未死亡小鼠取血，37 ℃靜置0.5 h，低溫離心(10 min，3 000 r/min)，取上清液，上清液中檢測BUN、CR、ALT、AST含量。

1.3 統(tǒng)計學方法 運用SPSS 17.0軟件，對數據做正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，兩項均符合，采用單因素方差分析進行統(tǒng)計計算。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1 香鱗毛蕨95%醇提物組毒性反應 灌胃給藥后，95%醇提物組小鼠活動明顯減少，出現倦怠、呼吸加速、反應遲鈍、運動失衡等癥狀，10 min后小鼠開始出現死亡，小鼠死亡多集中在0.5～1 h，所有死亡小鼠均在給藥當天死亡，且死亡前大多伴陣發(fā)性抽搐。給藥第2天以后未發(fā)現小鼠死亡，未死亡小鼠與空白組小鼠相比呈現較明顯抑制狀態(tài)，隨時間延長小鼠飲食、體重逐漸恢復正常。

2.2 香鱗毛蕨95%乙醇提取物組LD50及95%可信區(qū)間 根據各劑量組小鼠累計死亡數及給藥劑量，采用Bliss法計算香鱗毛蕨95%醇提物組LD50及95%可信區(qū)間。見表1。香鱗毛蕨95%乙醇提取物的小鼠LD50為13.53 g/kg，95%可信區(qū)間為11.971～15.155 g/kg。

表1 香鱗毛蕨95%乙醇提取物對小鼠LD50測定結果

注:“—”表示無數據

2.3 血清生化檢查 對香鱗毛蕨95%乙醇提取物組小鼠和空白對照組小鼠血清進行生化檢查發(fā)現，95%醇提物中劑量組小鼠血清中ALT、BUN與空白組小鼠比較差異有統(tǒng)計學意義，低劑量組小鼠血清與空白組比較差異無統(tǒng)計學意義，而95%乙醇提取物組小鼠血清中AST、CR與空白組小鼠比較差異均無統(tǒng)計學意義。見圖1。

圖1 各組小鼠血清生化指標

注:“C”：空白對照組；“L”：香鱗毛蕨95%乙醇提取物低劑量組；“M”：香鱗毛蕨95%乙醇提取物中劑量組“*”：P<0.05

2.4 組織病理學檢查 各組動物的脾臟、肺臟等臟器均未見明顯病變：白髓淋巴組織脾小結明顯，外部邊緣區(qū)淋巴細胞增生，紅髓髓索清楚，其間髓竇充滿紅細胞并伴多核巨細胞增生；肺池壁毛細血管充有紅細胞。各級支氣管周圍間質有肺動、靜脈、淋巴組織和疏松結締組織。肺泡充氣良好。香鱗毛蕨95%乙醇提取物組小鼠心肌凝固性壞死；肝細胞輕度濁腫，空泡變性，并可見出血壞死；腎皮質、髓質內可見腎小管變性壞死脫落，腎小血管周圍炎細胞浸潤。見圖2。

圖2 香鱗毛蕨急性毒性病理切片(物鏡100×)

注：A.空白對照組心臟；B.空白對照組肝臟；C.空白對照組腎臟；D.香鱗毛蕨95%醇提物高劑量組(32.00 g/kg)，箭頭指示為心肌凝固性壞死；E.香鱗毛蕨95%醇提物高劑量組(32.00 g/kg)，箭頭指示為肝出血壞死；F.香鱗毛蕨95%醇提物高劑量組(32.00 g/kg)，箭頭指示為腎小管變性壞死脫落

3討論

香鱗毛蕨95%乙醇提取物急性毒性實驗中，與空白組小鼠比較，各給藥組小鼠均出現活動減少，呆滯，運動失衡，呼吸加速等中毒癥狀，說明香鱗毛蕨95%乙醇提取物有一定的毒性，灌胃給藥后的LD50為13.53 g/kg，95%的可信限為11.971～15.155 g/kg，根據化學物質急性毒性劑量分級表可知，香鱗毛蕨95%乙醇提取物灌胃給藥分級為微毒。

研究結果顯示：單次大劑量給藥香鱗毛蕨95%乙醇提取物可引起小鼠心肝腎急性損傷，長期給藥是否會造成蓄積損傷及損傷是否可逆還不明確。課題組對香鱗毛蕨95%乙醇提取物進行急性毒性研究，可對今后用藥有一定指導意義。但是目前香鱗毛蕨毒性物質基礎、體內毒性過程、毒性作用特點、毒性作用機制尚不明確，仍有待進一步研究。課題組對香鱗毛蕨95%乙醇提取物進行急性毒性研究，對其新藥研發(fā)有一定指導意義。

[1]徐冬英.藥用蕨類植物的研究進展[J].中醫(yī)藥信息,1997，14(4)：20-21.

[2]范華倩,沈志濱,陳艷芬,等.香鱗毛蕨不同提取液體外抗真菌作用研究[J].中藥材,2012，35(12):1981-1985.

[3]杜文釗,宋國強,劉海燕,等.香鱗毛蕨中間苯三酚類化合物的研究[J].廣東藥學院學報,2016，32(1):22-24.

[4]樊銳鋒,黃慶陽,常纓.香鱗毛蕨抑菌特性比較[J].東北農業(yè)大學學報，2012，43(3):81-84.

[5]Zhang Y，Luo M，Zu Y，et al.Dryofragin，a phloroglucinol derivative，induces apoptosis in human breast cancer MCF-7 cells through ROS-mediated mitochondrial pathway[J].Chem Biol Interact，2012，199(2):129-136.

[6]Sun Y，Gao G，Luo M，et al.Aspidin PB，a phloroglucinol derivative，induces apoptosis in human hepatocarcinoma HepG2 cells by codulating PI3/Akt/GSK3β pathway[J].Chem Biol Interact，2013，201(1-3):1-8.

[7]Zhao DD，Zhao QS，Liu L，et al.Compounds from Dryopteris fragrans(L.)Schott with Cytotoxic Activity[J].Molecules，2014，19(3):3345-3355.

[8]Song R，Li G，Li S.Aspidin PB，a novel natural anti-fibrotic compound，inhibited fibrogenesis in TGF-β1-stimulated keloid fibroblasts via PI-3K/Akt and Smad signaling pathways[J].Chem Biol Interact，2015，238：66-73.

[9]Wan D，Jiang C，Hua X，et al.Cell cycle arrest and apoptosis induced by aspidin PB through the ρ53/ρ21 and mitochondria-dependent pathways in human osteosarcoma cells[J].Anticancer Drugs，2015，26(9)：931-941.

[10]Gao C，Guo N，Li N，et al.Investigation of antibacterial activity of aspidin BB against Propionibacterium acnes[J].Arch Dermatol Res，2016，308(2):79-86.

[11]Li N，Gao C，Peng X，et al.Aspidin BB，a phloroglucinol derivative，exerts its antibacterial activity against Staphylococcus aureus by inducing the generation of reactive oxygen species[J].Res Microbiol，2014，165(4)：263-272.

[12]黃奕曦,沈志濱,江濤,等.香鱗毛蕨有效部位對紅色毛癬菌體外抗真菌的作用[J].廣東藥學院學報,2016，32(1):78-82.

[13]王潔,唐春萍,江濤,等.香鱗毛蕨有效部位對糠秕馬拉色菌的體外抗真菌作用研究[J].中成藥,2015，37(3):642-645.

[14]萬江帆,沈志濱,江濤,等.香鱗毛蕨有效部位對申克孢子絲菌酵母相的體外抗真菌作用研究[J].中藥新藥與臨床藥理,2014，25(1):44-48.

[15]Li XJ，Wang W，Luo M，et al.Solvent-free microwave extraction of essential oil from Dryopteris fragrans and evaluation of antioxidant activity[J].Food Chem，2012，133(2):437-444.

[16]Peng B，Bai RF，Han XY，et al.Two new glycosides from Dryopteris fragrans with anti-inflammatory activities[J].J Asian Nat Prod Res，2016，18(1):59-64.

[17]殷先君.香鱗毛蕨治療48例難治性手足癬的療效觀察[J].現代藥物與臨床,2013，28(1)：57-58.

(2016-09-14收稿 責任編輯：徐穎)

AcuteToxicityof95%EthanolExtractsfromDryopterisfragrans(L.)Schott

Zhu Chongchong, Peng Bing, Zeng Zuping, Han Xuyang, Wang Hong, Wang Tianyuan

(BeijingInstituteofTraditionalChineseMedicine,BeijingHospitalofTraditionalChineseMedicineAffiliatedtoCapitalMedicalUniversity,Beijing100010,China)

Objective:To study the acute toxicity of 95% ethanol extracts from Dryopteris fragrans (L.) Schott in mice.Methods:The Dryopteris fragrans 95% ethanol extracts were given to the healthy Kunming mice by intragastric administration. The dose range of 95% ethanol extracts were 10.00 g/kg～24.00 g/kg. The movement and toxic symptoms were observed and the number of dead mice were recorded. LD50were calculated by Bliss′ method. Pathological changes were examined by pathological section.Results:LD50of the 95% ethanol extracts were 13.53 g/kg, respectively. Pathological section indicated that the myocardial coagulation necrosis, renal tubular degeneration and necrosis, and mild swelling of liver cells, vacuole degeneration, while other organs such as the spleen and lung were with no significant pathological changes.Conclusion:The 95% ethanol extracts of Dryopteris fragrans possesses certain toxicity.

Dryopteris fragrans (L.) Schott; Acute toxicity; LD50

R285；R282.71

：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2017.09.048

北京市自然科學基金項目(7144200)

朱沖沖(1990.01—)，男，碩士研究生，研究方向：中藥化學，E-mail：1004410653@qq.com

彭冰(1978.04—)，男，博士，副研究員，研究方向：中藥藥效物質及質量標準研究，E-mail：pengbing126@126.com