王玉潔高 山孫肇星曹俊平

（1徐州醫(yī)科大學(xué)麻醉學(xué)院，徐州221004；2江蘇省麻醉學(xué)重點實驗室，徐州醫(yī)科大學(xué)，徐州221004）

舒芬太尼對神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓背角P2X3受體表達的影響*

王玉潔1高 山1孫肇星1曹俊平2△

（1徐州醫(yī)科大學(xué)麻醉學(xué)院，徐州221004；2江蘇省麻醉學(xué)重點實驗室，徐州醫(yī)科大學(xué)，徐州221004）

目的：研究舒芬太尼對神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓P2X3受體表達的影響。方法：SD雄性大鼠36只，隨機分成3組：假手術(shù)組( Sham組) ; 對照組( CCI組) ; 舒芬太尼組( CCI+Suf組)。CCI和CCI+Suf組制備坐骨神經(jīng)慢性壓迫模型(chronic constriction injury, CCI)。Sham組和CCI組術(shù)后每天腹腔注射生理鹽水(0.1 ml/100 g), CCI+Suf組術(shù)后每天腹腔注射舒芬太尼(0.02 ml/100 g)。每組分別在術(shù)前、術(shù)后1、3、7、14天給藥30分鐘后，測定熱縮足潛伏期(thermal withdrawal latency, TWL)。于術(shù)后第7、14天TWL測定后，隨機選取6只大鼠L4-5節(jié)段脊髓，應(yīng)用免疫組化法檢測脊髓P2X3受體表達水平。結(jié)果：與Sham組比較，CCI組和CCI+Suf組TWL縮短，P2X3受體表達上調(diào)(P＜0.05)。與CCI組比較，CCI+Suf組TWL延長，P2X3受體表達下調(diào)(P＜0.05)。結(jié)論：舒芬太尼可以抑制脊髓P2X3受體的表達上調(diào)，并減輕大鼠神經(jīng)病理性痛。

P2X3受體；舒芬太尼；神經(jīng)病理性疼痛 ；熱縮足潛伏期

疼痛尤其是神經(jīng)病理性疼痛對人體生命活動的影響逐漸被人們重視。神經(jīng)病理性疼痛是病理性疼痛中最常見的一種，也是治療上比較困難的神經(jīng)病理性疼痛。國際疼痛學(xué)會(International Associationfor the Study of Pain, IASP)將神經(jīng)病理性疼痛定義為：軀體感覺系統(tǒng)損傷或疾病所直接導(dǎo)致的疼痛[1]。近年來，全球有數(shù)百萬病人深受神經(jīng)病理性疼痛（neuropathic pain, NP）的困擾，神經(jīng)病理性疼痛嚴(yán)重影響病人的日?；顒雍蜕钯|(zhì)量。

目前藥物治療是最基本、最主要的治療方法，其中，尤以阿片類藥物的治療效果確切[2～4]。在阿片類制劑中，舒芬太尼(sufentanil)的鎮(zhèn)痛效應(yīng)最強，起效較快，而且毒性作用低，安全范圍廣，具有心血管穩(wěn)定性好的特點[5,6]，目前臨床應(yīng)用范圍廣泛。

嘌呤受體P2X家族是目前研究疼痛信號傳導(dǎo)的新型外周受體，其亞型之一P2X3受體在傳導(dǎo)疼痛信號[7]，調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性，引起傷害性感受[8]中起了重要作用。Jarvis等[9]發(fā)現(xiàn)在鞘內(nèi)注射P2X3受體新型選擇性拮抗劑A-317491可以很大程度上減輕慢性神經(jīng)擠壓傷后的機械性疼痛和熱痛覺過敏，提示P2X3受體在痛信息處理中存在重要作用。但阿片類藥物減輕神經(jīng)病理性疼痛的具體機制以及是否通過影響P2X3受體的表達從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應(yīng)以往研究未見報道。

本研究采用坐骨神經(jīng)慢性壓迫模型(chronic constriction injury, CCI)模擬神經(jīng)病理性疼痛，觀察舒芬太尼對神經(jīng)病理性疼痛大鼠痛閾的影響，采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測大鼠脊髓背角P2X3受體表達的變化，探討舒芬太尼減輕神經(jīng)病理性痛可能的機制。

方 法

1.實驗材料

（1）實驗動物

所有實驗均遵從國際疼痛研究聯(lián)合會相關(guān)指南，并得到徐州醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會的許可。清潔級雄性SD大鼠36只，體重200～250 g，徐州醫(yī)科大學(xué)動物中心提供。

（2）實驗儀器、藥品等

枸櫞酸舒芬太尼注射液(1 ml: 50 μg)，Anti-P2X3 antibody（美國Abcam公司、貨號Ab10269），BWPlantar 390足底熱測痛儀（IITC公司)，超敏兔兩步法檢測試劑盒（北京中杉金橋，PV-9001）等。

2.實驗方法

（1）實驗分組

36只SD雄性大鼠隨機方法（抽簽）分為3組，每組12只，分別為假手術(shù)組（Sham組）；模型對照組（CCI組）；舒芬太尼組（CCI+Suf組）；Sham組只暴露坐骨神經(jīng)，CCI組和CCI+Suf組建立坐骨神經(jīng)CCI模型。

（2）模型制備

CCI組和CCI+Suf組參照Bennett和Xie方法制作坐骨神經(jīng)CCI[10]，大鼠在10% 水合氯醛(3 ml/kg)麻醉下，左側(cè)大腿中部切開，暴露出坐骨神經(jīng)，在總干分叉前用4-0絲線繞神經(jīng)干分別做3個結(jié)扎環(huán)，間距1 mm，結(jié)扎強度以引起小腿肌肉輕度顫動反應(yīng)為宜，然后逐層縫合切口，消毒傷口，常規(guī)籠養(yǎng)。所有手術(shù)操作均由同一個人完成，以保證一致性。

（3）給藥方式

Sham組和CCI組術(shù)后每天腹腔注射生理鹽水(0.1 ml/100 g), CCI+Suf組術(shù)后每天腹腔注射舒芬太尼0.02 ml/100 g。

（4）行為學(xué)檢測

每組分別在術(shù)前、術(shù)后 1、3、7、14 天給藥30分鐘后，測定熱縮足潛伏期(thermal withdrawal latency, TWL)。于術(shù)后第7、14 天測定TWL后，隨機抽取6只（抽簽決定），提取大鼠L4-5節(jié)段脊髓。 TWL：按照Hargreaves法[11]進行測定。在安靜的環(huán)境中，將大鼠單獨放置于透明的有機玻璃體中，待大鼠適應(yīng)環(huán)境15～30 min后，用熱輻射刺激儀照射大鼠左側(cè)足底緊貼玻璃板部位，記錄照射開始至大鼠出現(xiàn)抬足時間，截止時間為25 s，實驗中，保持刺激強度相同。重復(fù)5次，每次間隔時間至少5 min，最后取3次的平均值為TWL，每天測量時間點相同。

（5）脊髓取材及切片

大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉后，立即開胸，經(jīng)左心室插管，并剪開右心耳，先用生理鹽水灌注約300 ml，再用4 % 的多聚甲醛灌注。灌注后暴露脊髓切取腰膨大處，將取出標(biāo)本置入4 %多聚甲醛溶液中繼續(xù)后固定過夜，30 % 蔗糖脫水至沉底，進行冰凍切片（片厚30 μm）。

（6）免疫組化方法

脊髓切片0.3 % H2O2孵育消除內(nèi)源性辣根過氧化物酶后，室溫10 min PBS洗，5 min×3次；滴加1：400兔抗P2X3（PBS稀釋）4℃過夜；PBS沖洗，5 min×3次；滴加超敏兔兩步法檢測試劑盒相關(guān)試劑；PBS沖洗，5 min×3次；DAB顯色；脫水，透明，封片。

（7）免疫組化結(jié)果判定

每只大鼠各切取10張切片用于P2X3陽性標(biāo)記分析。使用光學(xué)顯微鏡（Nikon Eclipse E600）對脊髓切片進行攝片，使用Image Pro Plus 6.0軟件進行P2X3陽性結(jié)構(gòu)計數(shù)。

3.統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析和t檢驗。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.舒芬太尼對神經(jīng)病理性疼痛大鼠痛行為的影響

各組大鼠在術(shù)前的熱縮足潛伏期比較無統(tǒng)計學(xué)差異；CCI術(shù)后大鼠均出現(xiàn)縮足、舔爪等行為學(xué)改變。CCI術(shù)后1天，大鼠的TWL開始出現(xiàn)明顯降低。與假手術(shù)組( Sham組)相比，CCI組和CCI+Suf組術(shù)后TWL顯著縮短（P＜0.05）；與CCI組相比，CCI+Suf組術(shù)后TWL顯著延長（P＜0.05，見圖1、表1）。

2.舒芬太尼對神經(jīng)病理性大鼠脊髓背角P2X3表達的影響

P2X3受體免疫陽性細(xì)胞主要分布在脊髓背角Ⅱ?qū)?，以中、小?xì)胞神經(jīng)元為主（見圖2）。Sham組大鼠在術(shù)后第7天和14天脊髓背角P2X3受體陽性細(xì)胞表達數(shù)量分別為91±3和108±1;與同一時間點假手組比較，CCI組P2X3受體陽性細(xì)胞表達增加，統(tǒng)計結(jié)果分別為134±2和152±14 。而腹腔注射舒芬太尼（即CCI+Suf組）各時間點P2X3受體陽性細(xì)胞表達數(shù)量較對照組各時間點降低（見圖3）。

討 論

慢性坐骨神經(jīng)壓迫模型（CCI）是目前研究神經(jīng)病理性疼痛最經(jīng)典模型之一，有學(xué)者對CCI模型大鼠疼痛行為學(xué)觀察進行了詳細(xì)地描述：CCI術(shù)后1～2周，手術(shù)足趾并攏輕度外翻，下肢行走無力，步態(tài)呈現(xiàn)跛行，經(jīng)?；紓?cè)足懸空或不敢著地；站立時以健側(cè)后肢持重，患側(cè)后肢抬起并緊貼于腹部；術(shù)后14天左右，患側(cè)后肢出現(xiàn)比較明顯的肌肉萎縮[12]，本實驗大鼠CCI后表現(xiàn)為結(jié)扎一側(cè)后足不愿著地，足底外翻和縮攏等現(xiàn)象，模型制備結(jié)果與上述一致，同時，CCI組術(shù)后TWL顯著低于Sham組，說明模型制備成功[13]。而且在實驗中通過設(shè)立Sham組，排除了因手術(shù)切口的損傷可能對測試結(jié)果的干擾。

CCI術(shù)后，CCI+Suf組TWL較CCI組顯著延長，說明腹腔注射舒芬太尼可減輕大鼠的神經(jīng)病理性疼痛，目前研究認(rèn)為阿片類藥物的鎮(zhèn)痛作用主要通過與μ、κ、δ阿片受體結(jié)合，進而抑制P物質(zhì)的釋放，抑或減少鈣離子內(nèi)流影響細(xì)胞的興奮性，從而抑制動作電位的形成和轉(zhuǎn)導(dǎo)，或者增加鉀離子外流使突觸后膜超級化，影響神經(jīng)元的興奮性，從而發(fā)揮突觸后抑制功能[14]。

圖1 大鼠坐骨神經(jīng)損傷后不同時間點TWL的變化(n=12，±SD)Fig.1 The change of TWL at different time points after CCI (n=12，±SD)

表1 大鼠坐骨神經(jīng)損傷后不同時間TWL的變化(±SD)Table1 The change of TWL at different times after CCI (±SD)

表1 大鼠坐骨神經(jīng)損傷后不同時間TWL的變化(±SD)Table1 The change of TWL at different times after CCI (±SD)

*P＜0.05，與術(shù)前比較compared with preoperation；△P＜0.05，與Sham組比較, compared with Sham group；#P＜0.05，與CCI組比較,compared with CCI group.

術(shù)后痛閾（Postoperative pain threrold）(s)1 d 3 d 7 d 14 d Sham 14.65±1.47 14.46±3.02 9.08±0.91 13.97±2.61 15.98±0.57 CCI 15.4±1.33 7.85±1.38*△ 6.27±1.26*△ 9.56±1.13*△ 4.83±0.64 *△CCI+Suf 16.07±0.86 10.91±2.78*#△ 9.15±0.89*# 11.92±1.27*# 11.00±1.52*#△組別Group基礎(chǔ)痛閾(s)Basal pain threrold

圖2 大鼠坐骨神經(jīng)損傷后脊髓背角P2X3受體陽性神經(jīng)元Fig.2 P2X3-immunoreactive neurons in spinal cord dorsal horn after CCI in rats

圖3 大鼠坐骨神經(jīng)損傷后脊髓背角P2X3受體陽性神經(jīng)元數(shù)量的變化(n=6，±SD)Fig.3 The change of P2X3-immunoreactive neurons in spinal cord dorsal horn after CCI in rats (n=6，±SD)

P2X3受體是P2X受體的一個亞型，屬于一種配體門控離子通道受體，對Ca2+的通透性最大，可特異性地表達在與C類纖維相連的神經(jīng)元上，與致痛有密切關(guān)系，被認(rèn)為是傷害特異性受體，外周傷害性刺激可引起脊髓神經(jīng)元釋放大量ATP，激活脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞P2X受體，引起Ca2+內(nèi)流，從而激活了絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路，釋放致炎細(xì)胞因子、化學(xué)增敏素等，這些可擴散因子與鄰近神經(jīng)元的突觸前膜、后膜相應(yīng)受體結(jié)合，從而增強神經(jīng)元的興奮性，導(dǎo)致痛覺過敏[15]。坐骨神經(jīng)CCI可誘發(fā)大鼠發(fā)生熱痛覺過敏，同時導(dǎo)致脊髓背角神經(jīng)元P2X3受體表達上調(diào)，提示P2X3受體參與了神經(jīng)病理性痛的形成和維持。本實驗中，免疫組化分析結(jié)果顯示，坐骨神經(jīng)CCI模型后7天、14天脊髓L4-5節(jié)段P2X3受體表達增強，這與上述敘述一致；CCI+Suf組P2X3受體表達較CCI組明顯減少，說明舒芬太尼減輕神經(jīng)病理性疼痛的機制可能與抑制P2X3受體的表達有關(guān)。

綜上所述，舒芬太尼可以有效抑制P2X3受體表達從而減輕大鼠神經(jīng)病理性痛的熱痛敏，而舒芬太尼下調(diào)脊髓背角P2X3受體表達的具體機制有待進一步探討。

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EFFECTS OF SUFENTANIL ON THE EXPRESSION OF P2X3 RECEPTORS IN A RAT MODEL OF NEUROPATHIC PAIN*

WANG Yu-Jie1, GAO Shan1, SUN Zhao-Xing1, CAO Jun-Ping2△
(1School of Anethesiology,Xuzhou Medical University, Xuzhou 221004, China;2Jiangsu Province Key Laboratory of Anethesiology, Xuzhou Medical University, Xuzhou 221004, China）

Objective:To investigate the effect of sufentanil on the expression of P2X3 receptors in spinal cord dorsal horn of rats with neuropathic pain.Methods:Thirty-six male SD rats were randomly divided into three groups (n=12): the sham operation group (Sham group), the Chronic Compression Injury (CCI) group (CCI group) and the CCI with sufentanil group (CCI+Suf group).The sham and CCI groups

intraperitoneal injection with saline once a day after operation (0.1 ml /100 g).The CCI+Suf group was intraperitoneally injected with sufentanil once a day after operation (0.02 ml /100 g).Thermal withdrawal latency (TWL) was measured 30 min after saline or sufentanil administration, at different time points including before operation and 1, 3, 7, and 14 days after CCI.Six rats in each group were sacrificed at 7 and 14 days after operation and the spinal cords were collected immediately.The expression of P2X3 receptors were measured with immunohistochemical methods.Results:Compared with the Sham group, TWL was shortened in CCI and CCI+Suf groups and the expression of P2X3 receptors was increased significantly.However, in CCI+Suf group, TWL was prolonged and the expression of P2X3 receptors was decreased as compared with those in CCI group.Conclusion:Injection of sufentanil can alleviate neuropathic pain with inhibition of the upregulation of P2X3 receptors expression in the dorsal horn of the spinal cord.

P2X3 receptor; Sufentanil; Neuropathic pain; Thermal withdrawal latency

10.3969/j.issn.1006-9852.2017.08.005

2015江蘇省高等學(xué)校大學(xué)生實踐創(chuàng)新計劃（201510313032Y）；國家自然科學(xué)基金（No 30900417、30901402）；江蘇省高校自然科學(xué)基金（08KJB180011、9KJD320008）

△通訊作者 caojp@xzhmu.edu.cn