謝金龍 趙文杰 孫理蘭 王 丹 張玉花 馬華剛

濰坊市人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科（山東濰坊 261041）

左卡尼汀聯(lián)合他莫昔芬對精子DNA碎片率的影響研究

謝金龍 趙文杰 孫理蘭 王 丹 張玉花 馬華剛*

濰坊市人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科（山東濰坊 261041）

目的 探討左卡尼汀聯(lián)合他莫昔芬治療男性不育，對患者精子DNA碎片率（DFI）的影響。方法 選擇門診就診的262例伴有DFI異常的男性不育患者，隨機分為治療組133例和對照組129例，治療組給予左卡尼汀口服液和他莫昔芬治療；對照組給予維生素E軟膠囊治療，療程為3個月。治療前后，采用計算機輔助精子分析（CASA）系統(tǒng)、精子染色質(zhì)擴散法、苯胺藍染色法分別檢測精液參數(shù)、DFI以及精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換（SNT）。結(jié)果 藥物治療后，治療組精子濃度（SC）[（46.9±7.8）×106/mL]與對照組[（32.6±8.8）×106/mL]及治療前[（31.9±6.8）×106/mL]相比顯著提高（P＜0.01）；前向運動精子百分率（PR%）[（36.4±6.2）%]較對照組[（28.4±4.2）%]及治療前[（26.4±5.2）%]顯著提高（P＜0.01）；DFI[（22.5±8.7）%]較對照組[（27.5±7.7）%]及治療前[（32.5±9.7）%]顯著下降（P＜0.01）；SNT[（12.6±4.9）%]較對照組[（14.6±6.7）%]及治療前[（18.6±4.7）%]顯著下降（P＜0.01）；正常形態(tài)精子百分比[（3.4±1.1）%]較對照組[（3.4±1.2）%]及治療前[（3.2±1.2）%]改善，但無顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)論 左卡尼汀聯(lián)合他莫昔芬治療男性不育，可以顯著降低精子DFI，提高精子活力，改善精子質(zhì)量。

肉堿; 他莫昔芬; 精子; DNA碎片裂

世界衛(wèi)生組織規(guī)定，夫婦未采取任何避孕措施同居生活1年以上，由于男方因素造成女方不孕者，稱為男性不育癥[1]。男性不育受諸多方面的病因影響，精液參數(shù)作為評估男性生育能力的主要指標(biāo)，易受到各類因素的影響，并不能準(zhǔn)確的預(yù)測精子的授精能力和臨床妊娠結(jié)局[2]。近年來，精子DNA碎片率（DNA fragmentation index，DFI）和精子核蛋白組型轉(zhuǎn)換（spermnucleoprotein transition, SNT）日益受到人們的重視，成為評估精液質(zhì)量和預(yù)測生育能力的新指標(biāo)[3,4]。目前關(guān)于藥物治療DFI異常的研究較少，我們通過應(yīng)用左卡尼汀聯(lián)合他莫昔芬治療精子DFI異常的男性不育患者，取得了較好的臨床效果，現(xiàn)報道如下。

資料與方法

一、臨床資料

1. 納入標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊》第5版標(biāo)準(zhǔn)[5]：少精子癥者精子濃度＜15.0×106/mL；弱精子癥者射精后1h內(nèi)，前向運動精子（progressive motile, PR）百分率＜32%。滿足少精子癥或弱精子癥中的一項，同時伴有DFI＞10%的男性不育癥患者，即納入本研究。

2. 排除標(biāo)準(zhǔn) 合并以下任一種情況：（1）泌尿生殖道感染；（2）生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)疾?。唬?）睪丸發(fā)育障礙；（4）隱睪；（5）精索靜脈曲張；（6）正在使用促性腺激素、睪酮、促蛋白合成類固醇和非甾體類抗炎藥物；（7）環(huán)境毒物接觸史。

本研究通過醫(yī)院的醫(yī)學(xué)倫理委員會審核，每位參與研究的患者都被詳細告知本研究的內(nèi)容和所涉及的患者權(quán)利，完全自愿參加。所有患者在接受治療前3個月未服用任何改善精子濃度或活力的藥物。本研究工作從2015年3月開始，持續(xù)12個月時間。

二、治療方法

治療組患者給予左卡尼汀口服液（生產(chǎn)廠家：東北制藥集團沈陽第一制藥生產(chǎn)；國藥準(zhǔn)字：H19990372）1.0g/次，每日3次，聯(lián)合他莫昔芬（生產(chǎn)廠家：揚子江藥業(yè)生產(chǎn)；國藥準(zhǔn)字：H32021472） 10mg/次，每日2次，療程3個月；對照組給予維生素E軟膠囊（生產(chǎn)廠家：青島雙鯨藥業(yè)生產(chǎn)；國藥準(zhǔn)字：H20043134）100mg/次，每日2次，療程3個月。治療期間保持規(guī)律性生活，避免不良生活習(xí)慣及遠離高溫、輻射等異常環(huán)境。于治療前及治療后3個月，分別檢測精液參數(shù)、精子正常形態(tài)率、DFI及SNT。治療期間，治療組有6例患者出現(xiàn)輕度胃腸道反應(yīng)及神經(jīng)精神癥狀，給予對癥處理后好轉(zhuǎn)。

三、標(biāo)本采集

所有患者均禁欲3～7d，取精前一晚避免過度勞累，用消毒液洗手，在本中心取精室通過手淫獲取精液，射入一次性無菌的取精杯中，靜置于37℃培養(yǎng)箱中液化，30min后開始檢測。

四、精液常規(guī)分析

測定精液體積及pH值，取10μL樣品于37℃預(yù)溫的Marker板中，使用計算機輔助精子分析儀器（computer assisted semen analysis，CASA，美國Hamilton Thorne公司）對精液進行常規(guī)分析，記錄精子濃度（sperm concentration，SC）和PR%。

五、精子正常形態(tài)率（sperm morphology，SM%）分析

采用精子染色試劑盒（深圳市博銳德生物科技有限公司）說明書介紹的Diff-Quik方法行SM檢測，簡述如下：采用拉薄技術(shù)法涂片，風(fēng)干后，加A液覆蓋涂片室溫反應(yīng)約15s，將涂片垂直豎立在吸水紙上以除去多余染劑；加B液覆蓋涂片室溫反應(yīng)10s，將涂片垂直豎立在吸水紙上以除去多余染劑；加C液覆蓋涂片室溫反應(yīng)15s，將涂片垂直豎立在吸水紙上以除去多余染劑；流水浸洗10～15次除去多余染劑，將涂片垂直豎立在吸水紙上以除去多余染劑，風(fēng)干后在普通光學(xué)顯微鏡下進行計數(shù)精子形態(tài)，每張玻片至少計數(shù)200個精子且重復(fù)3次。

六、DFI檢測（精子染色質(zhì)擴散法）

采用精子DFI檢測試劑盒（深圳市博銳德生物科技有限公司），將精子懸液與瓊脂糖混合鋪于載玻片上，酸處理后溶解細胞去除核蛋白，用染色劑染色，最后用顯微鏡觀察結(jié)果。根據(jù)精子DNA產(chǎn)生的光暈進行評估，正常的精子DNA產(chǎn)生擴散的光暈，而損傷的精子DNA則不產(chǎn)生或產(chǎn)生很小的光暈。多視野計數(shù)500個精子，記錄不同光暈所占比例，計算精子的DFI。

七、SNT檢測（苯胺藍染色法）

按精子核蛋白染色試劑盒（深圳華康生物醫(yī)學(xué)工程有限公司）說明書方法檢測，步驟簡述如下：精液液化后調(diào)整精子濃度至40×106/mL。取精子懸液1mL，加入Eppendorf管內(nèi)，1000×g，離心10min，除精漿。加1mL洗滌液，充分混勻。1000×g，離心3min，去上清液，如此共洗滌3次。最后一次離心棄上清液后，加1mL粘合液。取5μL涂片，空氣干燥。加固定液固定90s，甩去固定液。玻片以自來水輕輕沖洗7次，甩去玻片表面積水，加染液覆蓋膜片區(qū)，染色5min。自來水緩緩沖洗，將膜片浸泡至洗脫液中準(zhǔn)確脫色18～20min，至膜片無明顯藍色為止。立即甩去脫色液，自來水快速洗滌7次。迅速吹干后加封固液1滴，蓋片封片。油鏡計數(shù)200個精子，不成熟精子頭部呈藍色，計算頭部著色精子百分率。

八、統(tǒng)計學(xué)分析

計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）進行描述，2組治療前后精液參數(shù)及 DFI、SNT的對比采用配對t檢驗，治療后兩組精液參數(shù)及DFI、SNT比較采用獨立樣本的t檢驗。采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、基本信息情況

共有262例患者納入研究，隨機分為2組：對照組129例，治療組133例。最后有8例患者未納入統(tǒng)計分析，其中3例失去隨訪，5例不按規(guī)定服藥。資料完整的患者總計254例，其中對照組124例，年齡20～42（30.1±4.6）歲，不育時間（20.2±5.6）月；治療組130例，年齡20～40（29.6±3.9）歲，不育時間（20.5±6.8）月。治療前，兩組患者年齡、不育時間、SC、PR、SM、DFI以及SNT組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，見表1），具有可比性。

二、治療前后兩組患者精液參數(shù)變化情況比較

經(jīng)過3個月治療后，治療組精子SC、PR、DFI、SNT較治療前顯著提高（P＜0.01），SM較治療前改善，但無顯著性差異（P＞0.05）；對照組給予維生素E軟膠囊治療后PR、DFI、SNT較治療前改善效果顯著（P＜0.01）；同時治療組SC、PR、DFI、SNT較對照組改善效果顯著，有顯著性差異（P＜0.01），而SM在治療組和對照組改善效果均無顯著性差異（P＞0.05，見表2）。

表1 兩組患者的基本信息情況（x±s）

表2 兩組精液參數(shù)、SNT及DFI治療前后比較（x±s）

討 論

精子DNA是遺傳信息的載體，其完整性是親代將遺傳物質(zhì)正確傳遞給子代的前提，在受精和胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[6]。DFI被認為是一個獨立的預(yù)測精子質(zhì)量指標(biāo)，美國生殖醫(yī)學(xué)會專家共識建議男性不育患者行精子DNA損傷檢測[3,4]。

精子DNA損傷可能與精子生成成熟過程中的氧化應(yīng)激、染色質(zhì)包裝異常、細胞凋亡等因素有關(guān)[7,8]。生殖系統(tǒng)感染，放、化療等有害因素可以導(dǎo)致局部活性氧（reactive oxygen species，ROS）增加，引起精液發(fā)生氧化 應(yīng)激反應(yīng)[9]。ROS作用于精子DNA核酸親核基團堿基，引起DNA鏈異常聚集、氧化反應(yīng)、斷裂產(chǎn)生游離片段，造成精子DNA損傷；此外，ROS可通過脂質(zhì)過氧化作用影響DNA，引起超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）基因表達異常，導(dǎo)致SOD合成減少，促使精子DFI上升[9]。魚精蛋白表達異常、ROS過表達及生精細胞的異常凋亡等參與了精子DNA損傷過程[10]，Garcia-Peiro等[11]報道了在精子發(fā)生過程中大約85%組蛋白被魚精蛋白替代，當(dāng)組蛋白與魚精蛋白轉(zhuǎn)化異常以及魚精蛋白1與魚精蛋白2的比值異常導(dǎo)致不成熟精子比例增加以及人類精子DNA損傷。精子發(fā)生時，組蛋白替代過程容易出現(xiàn)精子DNA損傷。精子細胞核高度濃縮形成特異的染色質(zhì)，抑制核內(nèi)DNA復(fù)制轉(zhuǎn)錄功能，致使精子DNA修復(fù)能力下降，且其通過細胞凋亡來應(yīng)對DNA損傷的能力也已喪失[12]。

左卡尼汀在體內(nèi)主要存在于附睪、精漿和精子中，附睪中左卡尼汀的濃度直接影響精子的成熟、獲能及受精能力。左卡尼汀參與精子的能量代謝，在胞內(nèi)脂肪酸轉(zhuǎn)運中通過膜成分和結(jié)構(gòu)的改變，保持精子膜流動性，促進精卵結(jié)合[13,14]；同時，左卡尼汀可抑制ROS的產(chǎn)生，減少氧化應(yīng)激對精子DNA的損傷[15]。Abad等[16]報道抗氧化治療可以顯著改善精子DNA的損傷，有助于維持精子DNA的完整性。Balercia等[17]報道應(yīng)用左卡尼汀和乙酰左卡尼汀聯(lián)合治療特發(fā)性弱精子癥可提高精液清除ROS能力，提高精子活力。我們推測，左卡尼汀可能通過以下三方面作用減少精子DNA損傷：（1）提高精子生成過程中的能量代謝，滿足精子成熟授精以及運動能力的能量供應(yīng)；（2）增強抗氧化應(yīng)激能力，清除體內(nèi)自由基；（3）保持精子膜流動性，維持精子核蛋白復(fù)合物穩(wěn)定。

他莫昔芬是一種非類固醇類雌激素拮抗藥物，主要通過阻斷雌激素的負反饋效應(yīng)促進垂體分泌促性腺激素，提高體內(nèi)卵泡刺激素和黃體生成素水平，從而促進睪丸間質(zhì)細胞分泌睪酮，促進精子生成，并可以通過抗氧化效應(yīng)改善精子細胞核線粒體的功能，使線粒體ATP生成增加，保證精子生成成熟過程中的能量供應(yīng)，進而提高精子活力[18]。

商學(xué)軍等[10]通過對88例合并有精子DNA完整性異常（DFI＞15%）的不育癥患者研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用左卡尼汀口服液治療可以顯著改善精子活力與精子DNA完整性。Abad等[16]發(fā)現(xiàn)，聯(lián)用左卡尼汀、輔酶Q10、維生素C等藥物可以明顯改善少弱畸精子癥患者的DFI。目前國內(nèi)外尚無左卡尼汀聯(lián)合他莫昔芬治療DFI文獻報道。在本項研究中，治療組采用左卡尼丁聯(lián)合他莫昔芬。由于維生素E軟膠囊常用于男性不育癥的輔助治療，其在改善精液質(zhì)量中的作用已經(jīng)得到廣泛認可[19]。本項研究中對照組采用維生素E軟膠囊。我們的結(jié)果顯示藥物治療后，治療組患者SC、PR、DFI、 SNT較治療前均有顯著性改善，這幾項數(shù)據(jù)與對照組比較亦有顯著性差異，說明左卡尼汀聯(lián)合他莫昔芬在改善精子常規(guī)參數(shù)及DFI效果方面較維生素E軟膠囊更顯著，肯定了左卡尼汀在男性不育中的治療效果，這也與專家共識相吻合[19]。

精子DNA的損傷受老齡化、環(huán)境毒物污染、生殖系統(tǒng)感染、放療、化療、睪丸局部溫度過高以及不良生活習(xí)慣等多個方面因素影響，損傷的具體機制有待于進一步探究。我們的研究結(jié)果顯示，左卡尼汀聯(lián)合他莫昔芬能夠在一定程度上降低了精子DNA碎片率，提高精子質(zhì)量。但本研究樣本量較小，左卡尼汀聯(lián)合他莫昔芬治療的安全性和有效性仍有待于進一步評估。此外，治療后精液相關(guān)數(shù)據(jù)的改善與其配偶妊娠結(jié)局的改善尚需進一步研究。

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11 Garcia-Peiro A, Martinez-Heredia J, Oliver-Bonet M, et al. Protamine 1 to protamine 2 ratio correlates with dynamic aspects of DNA fragmentation in human sperm. Fertil Steril 2011; 95(1): 105-109

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（2017-05-25收稿）

Effects of L-carnitine and tamoxifen on sperm DNA fragmentation index

Xie Jinlong, Zhao Wenjie, Sun Lilan, Wang Dan, Zhang Yuhua, Ma Huagang＊
Department of Reproductive Medicine, Weifang, People's Hospital, Weifang 261041, Shandong, China Corresponding author: Ma Huagang, E-mail: mahuagang@126.com

Objective To evaluate the effects of L-carnitine and tamoxifen on sperm DNA fragmentation index of male infertile patients. Methods Total of 262 infertile men with abnormal sperm DNA fragmentation index (DFI＞10%) were recruited in this study, and then randomly divided into a treatment group(133 patients) treated orally with L-carnitine and tamoxifen, and a control group (129 patients), treated with Vitamin E capsule, both for 3 months. Semen parameters, DFI and SNT were measured by computer assisted semen analysis (CASA), Sperm chromatin diffusion assay and Aniline blue staining, respectively. Results After 3 months treatment, a remarkable increase in the sperm concentration was observed in the treatment group (46.9±7.8×106/mL) compared with that before treatment (31.9±6.8×106/mL), or compared with that of the control group (32.6±8.8×106/mL, P＜0.01); an obvious improvement in progressive motile (36.4±6.2)% compared with that before treatment (26.4±5.2)%, or compared with that of the control group (28.4±4.2%, P ＜0.01); a significant decrease in DFI (22.5±8.7)% compared with that before treatment (32.5±9.7)%, or compared with that of the control group(27.5±7.7%, P＜0.01); a remarkable decrease in nucleoprotein transition (12.6±4.9)% compared with that before treatment (18.6±4.7%), or compared with that of the control group (14.6±6.7%, P＜0.01). However, there was no significant difference in sperm normalmorphology. Conclusion L-carnitine combined with tamoxifen might be effective in the treatment of the patients with male infertility by decreasing sperm DFI and improving sperm quality.

carnitine; tamoxifen; Spermatozoa; DNA fragmentation

10.3969/j.issn.1008-0848.2017.04.006

R 698.2

＊通訊作者，E-mail：mahuagang@126.com