洪云鶴，劉 艷，崔鳳云，許秀麗，方恩華，張經華，張 峰，張寶善

(1.陜西師范大學，陜西 西安 710119；2.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176；3.北京市理化分析測試中心，北京市食品安全分析測試工程技術研究中心，北京 100089；4.北京出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，北京 100026；5.廈門市出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，福建 廈門 361026)

頭孢噻呋及去呋喃甲酰基頭孢噻呋的四極桿軌道阱串聯質譜分析及其在肉雞體內的殘留規(guī)律研究

洪云鶴1,2，劉 艷3，崔鳳云4，許秀麗2，方恩華5，張經華3，張 峰2，張寶善1

(1.陜西師范大學，陜西 西安 710119；2.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176；3.北京市理化分析測試中心，北京市食品安全分析測試工程技術研究中心，北京 100089；4.北京出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，北京 100026；5.廈門市出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，福建 廈門 361026)

建立了頭孢噻呋及其主要代謝物去呋喃甲?；^孢噻呋殘留的超高效液相色譜-四極桿軌道阱串聯質譜(UHPLC-Q-Orbitrap MS)分析方法。選用Kinetex F5 100A色譜柱(50 mm×3.0 mm×2.6 μm)分離，在Q-Exactive高分辨質譜Full MS/dd-MS2掃描模式下采集數據進行定性定量分析。兩種目標物在3種基質中相應濃度范圍內的線性關系良好，相關系數r2均大于0.990，回收率為83.2%～129.7%，RSD均小于15%。通過對雞體內頭孢噻呋及其代謝物殘留規(guī)律的分析表明，給藥后，雞胸肉中頭孢噻呋和去呋喃甲酰基頭孢噻呋均可檢出，且消除時間均為12～24 h；雞肝、雞腎中頭孢噻呋可在0.5 h內迅速代謝為去呋喃甲?；^孢噻呋，雞肝和雞腎中去呋喃甲?；^孢噻呋的消除時間分別為48～72 h和72～120 h。本研究可為保障動物源性食品安全以及雞體內頭孢噻呋最大殘留限量標準和休藥期的制訂提供理論和實踐依據。

四極桿軌道阱串聯質譜(Q-Orbitrap MS)；頭孢噻呋；雞肉；食品安全

Abstract: A method of liquid chromatography quadrupole-Orbitrap hybrid mass spectrometry was developed and validated for the determination of ceftiofur and desfuroylceftiofur in chicken. The Kinetex F5 100A column (50 mm×3.0 mm×2.6 μm) was used during the separation of ceftiofur and desfuroylceftiofur. Full MS/dd-MS2mode was chosen for data acquisition, which showed good form in sample qualitative and quantitative analysis. The fragmentation pathways of ceftiofur and desfuroylceftiofur were clarified based on the results of high-accuracy mass spectrometry. During analysis of three types of matrixes (chicken, liver and kidney), correlation coefficients of linear calibration curves of ceftiofur and desfuroylceftiofur are over 0.990 at the corresponding concentration ranges of 2-200 μg/kg. The average recoveries of ceftiofur and desfuroylceftiofur range from 83.2% to 129.7% with the inter-day relative standard deviation (RSD) less than 15% in spiked samples at three levels. Besides, the elimination of ceftiofur in hens was studied. Ceftiofur was injected in hens’ muscle once a day for three consecutive days. The residue can not be detected in chicken breast after 12 h, while ceftiofur and desfuroylceftiofur can be detected in chicken breast simultaneously during 12 h. The metabolism of ceftiofur in hens’ liver and kidney is fast. It can totally metabolize to desfuroylceftiofur during less than 0.5 h. The residue of desfuroylceftiofur in hens’ liver can not be detected after 48 h, while the residue in kidney can not be detected after 72 h. This research can provide a basis for reference for the future development of long plagued quality and safety issues.

Keywords： quadrupole-Orbitrap hybrid mass spectrometry (Q-Orbitrap MS); ceftiofur; chicken; food security

頭孢噻呋(Ceftiofur, EFT)又名賽德福，是Bernard等[1-2]于1984年研發(fā)的一種廣譜半合成抗生素。作為第三代頭孢菌素中的一種[3]，頭孢噻呋是現有50余種頭孢菌素中唯一被美國、日本及歐洲一些國家批準使用的動物專用頭孢菌素[4]，它因具有抗菌譜廣、抑菌活性強、藥物半衰期長、藥效持久等特點，在動物養(yǎng)殖過程中被廣泛使用。但是，頭孢噻呋在動物飼養(yǎng)過程中的不規(guī)范使用會導致藥物殘留于動物源性食品中[5]，帶來一系列的食品安全問題，還可能導致細菌產生耐藥性，生成“超級細菌”，給人類的健康帶來隱患。

EFT進入動物體內后，會在短時間內被吸收，并代謝成同樣具有抗菌活性的去呋喃甲?；^孢噻呋[6](DFC)。我國農業(yè)部235號文件[7]及歐盟EU/37/2010[8]中均指出，對頭孢噻呋進行定量分析時應充分考慮去呋喃甲?；^孢噻呋的含量。目前，對頭孢噻呋及其代謝物的殘留分析主要有高效液相色譜(HPLC)法[9-11]和高效液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)法[12-14]。其中，HPLC法大多存在靈敏度和定性準確性低，現已逐步被質譜分析方法所取代。而動物源性食品基質復雜，使用低分辨質譜對頭孢噻呋進行分析時常有雜質峰干擾[15]，影響其定量和定性準確性。

本研究擬采用超高效液相色譜-四極桿軌道阱質譜(UHPLC-Q-Orbitrap MS)法同時測定雞肉中頭孢噻呋及去呋喃甲酰基頭孢噻呋的殘留量，并應用二級碎片離子的精確質量數對兩者的裂解規(guī)律進行分析，推測其二級特征碎片離子可能的結構式。本研究還將探討頭孢噻呋在雞胸肉中的殘留情況，希望能對雞血漿中頭孢噻呋藥代動力學的相關研究[16]進行補充，填補國內頭孢噻呋及代謝物在雞肉、雞肝、雞腎中代謝及消除研究的空白，為保障動物源性食品安全以及雞體內頭孢噻呋最大殘留限量標準的制訂提供理論和實踐依據。

1 實驗部分

1.1 儀器與材料

Thermo Scientific Q Exactive四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜儀，Dionex UltiMate 3000快速高效液相色譜系統：美國Thermo Fisher公司產品；渦旋振蕩器：美國Scientific Industries公司產品；超聲清洗儀：昆山市超聲儀器有限公司產品；高速冷凍離心機：美國Beckman Coulter公司產品；純水儀：美國Millipore公司產品；分析天平：瑞士Mettler Toledo公司產品。

頭孢噻呋-EFT標準品(純度98%)：德國Dr. Ehrenstorfer公司產品；去呋喃甲酰基頭孢噻呋-DFC標準品(純度61%)：加拿大TRC公司產品；乙腈、正己烷：色譜純，美國Fisher Scientific公司產品；甲酸(純度99%)：北京百靈威公司產品。

動物實驗注射用頭孢噻呋(速克，1 g/瓶，批號：20151102): 普萊柯生物工程股份有限公司產品；注射工具：2.5 mL注射器，精確度0.1 mL。

1.2 標準溶液的配制

準確稱取0.01 g(精確至0.000 1 g)EFT標準品，以乙腈-水溶液(4∶1，V/V)定容至50 mL，稱取0.01 g(精確至0.000 1 g)DFC標準品，以乙腈-水溶液(4∶1，V/V)定容至30 mL，分別配制成200 mg/kg的標準儲備溶液，于-40 ℃貯存，備用。

混合標準溶液的配制：分別移取0.1 mL各標準品，定容至1 mL，即得20 mg/kg混合標準溶液，于-40 ℃貯存，使用時每周配制1次。

速克(動物用頭孢噻呋針劑)每瓶均溶于10 mL生理鹽水中，即得到100 g/L注射液。

1.3 實驗條件

1.3.1色譜條件 Phenomenex Kinetex F5 100A柱(50 mm×3.0 mm×2.6 μm)；流動相：A為水相(含0.1%甲酸)，B為乙腈(含0.1%甲酸)；梯度洗脫程序：0～0.2 min(5%B)，0.2～0.8 min(5%～95%B)，0.8～1.2 min(95%B)，1.2～2 min(95%～5%B)，2～3.5 min(5%B)；流速0.7 mL/min；進樣體積5 μL；柱溫30 ℃；樣品盤溫度8 ℃。

1.3.2質譜參數 HESI離子源，鞘氣壓力2.07×105Pa，輔助氣流速10 arb，噴霧電壓3.5 kV，S-lens電壓60 V，毛細管溫度300 ℃，輔助氣加熱溫度350 ℃，正離子采集模式。

1.4 實驗動物

實驗動物為北京油雞母雞，33周齡(231日齡)。實驗前注射2.5 mL生理鹽水，觀察24 h吸收良好，藥物注射前1天雞禁食。將實驗雞分為9組，1組為空白對照組，另外8組為給藥組，按其質量(60 mg/kg)腿部肌肉注射給藥，連續(xù)給藥3天后進行樣品采集。

樣品采集：停藥后按0.5、4、8、12、24、48、72、120 h隨機取雞，每個時間點取3只，剖殺后取胸肌肉、肝臟、腎臟，待測。

1.5 樣品前處理

稱取(5.0±0.05) g雞肉樣品，(2.5±0.05) g雞肝和雞腎樣品于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈-水溶液(4∶1，V/V)，渦旋1 min，超聲提取20 min后，于4 ℃以10 000 r/min離心10 min；取2 mL上清液，過PRiME HLB固相萃取柱，再以2 mL含0.1%甲酸的乙腈-水溶液(5∶1，V/V)洗脫1次，收集2次流出液，于常溫氮氣吹至不足1 mL，乙腈定容至1 mL，過0.22 μm濾膜，待UHPLC-Q-Orbitrap上機檢測。

2 結果與討論

2.1 儀器條件

選用Full MS/dd-MS2和Target-SIM/dd-MS2兩種掃描模式。Target-SIM/dd-MS2掃描模式下通過四極桿篩選出一級離子，進入高能碰撞池發(fā)生裂解，從而可以得到二級離子的碎片信息，提高目標物的定性準確性，但該掃描模式在對目標物的定量上稍顯不足。Full MS/dd-MS2掃描模式以一級離子和二級碎片離子的精確質量數定性、一級離子的色譜峰面積定量，可達到對目標物的篩查及定量的目的。研究初期查找二級特征子離子時使用Target-SIM/dd-MS2模式，而Full MS/dd-MS2模式則用于后期目標物的定性及定量篩查。

為得到EFT和DFC的二級特征碎片子離子，采用Target-SIM/dd-MS2模式對2種目標物的二級碎片離子進行監(jiān)控，選用Full MS/dd-MS2模式進行檢測方法開發(fā)和目標物篩查。在Full MS分辨率70 000，dd-MS2分辨率17 500時可得到最佳的監(jiān)測結果，結果列于表1。

通過二級離子的精確質量數，研究EFT和DFC在該儀器條件下的裂解規(guī)律。EFT的特征碎片離子為m/z126.012 08、241.038 6、285.010 80，DFC的特征碎片離子為m/z126.012 12、227.005 28、386.040 10。兩種物質均存在m/z126.012特征碎片離子，針對這一離子推斷出的兩種可能結構式示于圖1和圖2，進一步驗證了m/z126.012可作為EFT及DFC共有的特征碎片離子。在裂解規(guī)律推斷過程中發(fā)現，兩種物質的裂解規(guī)律大多為簡單的α裂解，部分裂解步驟中可能涉及到π鍵斷裂，本研究對兩種物質各選出響應較高的3個特征碎片離子進行分析，其裂解過程中未涉及結構重排。

表1 EFT和DFC的離子化模式、精確質量數和二級特征碎片離子Table 1 Formulas, ionization modes, parent ions and product ions of EFT and DFC

圖1 EFT的提取離子流圖(a)，子離子質譜圖(b)和裂解規(guī)律(c)Fig.1 Extracted ion chromatogram (a), MS2 (b) and main fragmentation pathways (c) of ceftiofur

圖2 DFC的提取離子流圖(a)，子離子質譜圖(b)和裂解規(guī)律(c)Fig.2 Extracted ion chromatogram (a), MS2 (b) and main fragmentation pathways (c) of desfuroylceftiofur

2.2 樣品前處理

本研究對比了液-液萃取(LLE)、固相萃取(SPE)和直接提取后離心處理三種前處理方法。其中，液-液萃取提取過程中選用乙腈-水溶液，考慮到水與正己烷互不相溶，但乙腈微溶于正己烷，因此選用乙腈飽和的正己烷溶液作為萃取液除去提取液中的脂類雜質。固相萃取考慮到提取溶液中有機相比例較高，因此使用PRiME HLB雜質吸附型固相萃取柱進行前處理凈化，除去磷脂等雜質。

稱取(5.0±0.05) g空白雞肉，(2.5±0.05) g空白雞肝和雞腎，加入10 mL乙腈-水溶液(4∶1，V/V) 作為提取液，渦旋混合，80 W超聲提取20 min，以10 000 r/min離心10 min，取上清液。液-液萃?。杭尤胍译骘柡驼和槿芤?，振搖約3 min，取下層清液過0.22 μm濾膜，待分析；固相萃?。喝? mL上清液，過PRiME HLB固相萃取柱，待樣品溶液全部流出后，再以2 mL含0.1%甲酸的乙腈-水溶液(5∶1，V/V)洗脫1次，收集2次流出液，氮吹濃縮至不足1 mL，乙腈定容至1 mL，過0.22 μm濾膜，待分析；直接提取-低溫離心：上清液直接過0.22 μm濾膜，上機檢測。使用3種前處理方式凈化后的樣品回收率示于圖3。

使用LLE方法時，乙腈飽和正己烷溶液雖然可除去雞肉、雞肝和雞腎提取液中脂類和非極性雜質的干擾，但同時也可能造成兩種低極性待測物在前處理過程中的損失，導致回收率偏低。

對于雞肉樣品而言，使用PRiME HLB固相萃取柱和提取-離心兩種前處理方式處理后的樣品回收率均可滿足檢測要求；肝臟、腎臟樣品經提取-離心處理后，基質效應明顯，而使用PRiME HLB固相萃取柱可有效減小雞肝、雞腎樣品的基質效應。

2.3 基質效應

Q-Orbitrap的質譜響應信號可能會被基質效應所影響，軟電離過程中的質譜響應可能會因基質效應而增強或減弱。為了減少檢測過程中的基質效應干擾，使用基質加標法繪制標準曲線。采用峰面積法考察基質效應：向空白雞肉、雞肝和雞腎樣品中加入50 μg/kg混合標準溶液進行樣品前處理，另取50 μg/kg混合標準溶液上機檢測，結果列于表2。

圖3 凈化方式對回收率的影響Fig.3 Effect of recoveries in different purify procedures

目標物Analyte線性方程Calibrationequations相關系數Correlationcoefficients(r2)確定限CCα/(μg/kg)檢測容量CCβ/(μg/kg)基質效應Matrixeffect/%回收率(相對標準偏差)Recoveries/%(RSDs)5μg/kg100μg/kg500μg/kg雞肉EFTy=-16813.3+13066.1x0.99901.222.08107.78120.04(12.88)94.94(5.15)83.20(9.56)DFCy=21333.7+23306.5x0.99981.402.39110.3297.37(2.13)92.86(7.07)104.50(8.63)雞肝EFTy=-2805140+1586040x0.99982.434.1395.53101.87(7.96)99.88(12.22)103.41(1.55)DFCy=-228083+42067.5x0.99664.427.5381.41104.68(11.80)100.37(6.29)129.07(4.80)雞腎EFTy=-5775550+1925740x0.99912.404.0985.9999.67(7.54)93.04(1.44)127.69(2.00)DFCy=-958132+50225.1x0.99383.636.1982.6198.75(12.22)101.68(7.18)118.50(2.37)

注：*n=6，即平行測定6組，取平均值

經前處理后的雞肉樣品基質效應較小，雞胸肉中EFT基質效應為107.78%、DFC基質效應為110.32%，雞肝中EFT基質效應為95.53%、DFC基質效應為81.41%，雞腎中EFT基質效應為85.99%、DFC基質效應為82.61%，均滿足雞肉中EFT和DFC殘留的日常檢測需求。

2.4 方法驗證

方法驗證參照歐盟2002/657/EC和美國食品藥監(jiān)局生物分析檢測指導手冊。

空白基質做等濃度梯度混合標準品添加處理，繪制標準曲線，計算CCα(α=1%)和CCβ(β=5%)。

采用基質匹配加標法在5～500 μg/kg范圍內分別繪制EFT和DFC的標準曲線；考察回收率指標時，回收率取各物質標準曲線上的高、中、低三個濃度，在空白基質中添加標準溶液(5、100和500 μg/kg)，其回收率列于表2。

在5～500 μg/L濃度范圍內，EFT和DFC在雞肉、雞肝和雞腎基質中均呈現良好的線性關系，線性相關系數大于0.993 8，CCα為1.22～4.42 μg/kg，CCβ為2.08～7.53 μg/kg。取高(500 μg/kg)、中(100 μg/kg)、低(5 μg/kg)3個濃度點進行基質加標處理，各濃度點平行測量6個樣品，平均回收率為83.2%～129.7%，RSD(日內精密度)為1.44%～12.88%。

2.5 EFT及DFC在雞體內的殘留規(guī)律

以60 mg/kg腿部肌肉連續(xù)注射3天藥物后，對雞胸肉、雞肝、雞腎樣品中EFT和DFC濃度進行測定，對照組均未檢出EFT和DFC殘留，給藥組雞胸肉、雞肝、雞腎中EFT和DFC濃度隨時間的變化示于圖4。

圖4 雞胸肉(a)，雞肝(b)和雞腎(c)中EFT和DFC含量變化趨勢圖Fig.4 Residual rule of ceftiofur and desfuroylceftiofur in chicken muscle (a), liver (b) and kidney (c)

雞胸肉中DFC的濃度變化小于EFT，可能是由于EFT除了自身降解消除外，還會代謝為DFC，樣品中檢測到的DFC全部是由EFT轉化而來。實驗采樣的8個時間點中并未出現DFC濃度升高的情況，說明DFC消除速度較EFT代謝成DFC的速度快。

在雞肝、雞腎中均未檢出EFT，但檢出的DFC濃度較高。此現象可能是因為EFT進入實驗雞肝臟中0.5 h就全部代謝為DFC，因此肝臟和腎臟中未檢出EFT原藥殘留。而雞胸肉中檢出的EFT均為殘留在血液和雞肉組織中的藥物，代謝速度較肝臟慢。

停藥后0.5～4 h內，雞胸肉中EFT和DFC的濃度均迅速下降，EFT由427.26 μg/kg下降至29.46 μg/kg，DFC由315.86 μg/kg下降至11.50 μg/kg；停藥后12 h樣品組中可檢測到EFT為3.56 μg/kg，DFC為2.03 μg/kg；停藥后24 h雞胸肉取樣檢測不到EFT和DFC。

停藥后0.5 h雞肝雞腎中DFC含量最高；隨后在停藥后0.5～4 h內，雞肝中DFC由2 695 μg/kg下降至581 μg/kg，雞腎中DFC由1 802 μg/kg下降至509 μg/kg；停藥后48 h可檢測到雞肝中DFC含量為15 μg/kg；停藥后72 h雞肝中檢測不到DFC；停藥后72 h雞腎中可檢測到DFC含量為6 μg/kg；停藥后120 h雞腎中檢測不到DFC。

3 結論

本研究建立了頭孢噻呋及去呋喃甲?；^孢噻呋殘留的UHPLC-Q-Orbitrap快速篩查方法。目標物經苯基柱分離，色譜峰形尖銳、對稱性好，可于5 min內完成頭孢噻呋和去呋喃甲酰基頭孢噻呋的分離檢測。雞肉、雞肝和雞腎中頭孢噻呋的檢出限分別為1.22、2.43、2.40 μg/kg；雞肉、雞肝和雞腎中去呋喃甲?；^孢噻呋的檢出限分別為1.40、4.42、3.63 μg/kg。該方法分析速度快、抗干擾能力強、定性準確度高、靈敏度高，可作為雞肉、雞肝、雞腎中頭孢噻呋及去呋喃甲?；^孢噻呋殘留的分析確證方法。

本研究同時探索了頭孢噻呋及去呋喃甲酰基頭孢噻呋在雞體內的殘留規(guī)律，結果表明，頭孢噻呋進入實驗雞肝臟、腎臟后可在0.5 h內迅速轉化為去呋喃甲酰基頭孢噻呋，肝、腎中的去呋喃甲?；^孢噻呋在3日內可消除。而在雞肉中，頭孢噻呋和去呋喃甲?；^孢噻呋同時存在，且均可在24 h內消除。因此，在制定雞體內頭孢噻呋殘留相關標準時，應充分考慮雞肉中頭孢噻呋及去呋喃甲酰基頭孢噻呋消除時間相同，以兩者總和計算殘留量。頭孢噻呋在雞肝臟和腎臟中代謝較快，作為原藥不易檢出，但可通過檢測其主要代謝物去呋喃甲酰基頭孢噻呋達到檢測頭孢噻呋的目的。

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Determination of Ceftiofur & Desfuroyl Ceftiofur Residue and the Elimination Analysis in Chicken Using Liquid Chromatography Quadrupole-Orbitrap Hybrid Mass Spectrometry

HONG Yun-he1,2, LIU Yan3, CUI Feng-yun4, XU Xiu-li2, FANG En-hua5, ZHANG Jing-hua3, ZHANG Feng2, ZHANG Bao-shan1

(1.ShanxiNormalUniversity,Xi’an710119,China;2.ChineseAcademyofInspectionandQuarantine,Beijing100176,China;3.BeijingEngineeringResearchCenterofFoodSafetyAnalysis,BeijingCenterforPhysical&ChemicalAnalysis,Beijing100089,China;4.TechnologyCenterofBeijingEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Beijing100026,China;5.XiamenEntry-ExitInspectionandQuarantineBureauofthePeople’sRepublicofChina,InspectionandQuarantineTechnologyCenter,Xiamen361026,China)

O657.63

A

1004-2997(2017)05-0526-08

10.7538/zpxb.2016.0168

2016-10-19;

2016-12-05

國家重大儀器開發(fā)專項(2012YQ14000806)；北京市科技計劃項目(Z141100002614020)資助

洪云鶴(1992—)，女(滿族)，河北遵化人，碩士研究生，農產品加工及貯藏工程專業(yè)。E-mail: hong_yunhe@163.com

張寶善(1968—)，男(漢族)，甘肅張掖人，教授，從事食品發(fā)酵原理與技術研究。E-mail: baoshan2@snnu.edu.cn 張 峰(1974—)，男(漢族)，山東棗莊人，研究員，從事食品安全檢測分析技術研究。E-mail: fengzhang@126.com

時間：2017-04-13；網絡出版地址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/11.2979.TH.20170413.0916.006.html