李河山

（桂林理工大學(xué)，廣西桂林541000）

烹飪食物中丙烯酰胺的檢測及變化規(guī)律

李河山

（桂林理工大學(xué)，廣西桂林541000）

建立一種快速、高效的固相萃取-高效液相色譜法檢測烹飪食物中丙烯酰胺含量的分析方法，研究食物在烹飪過程中丙烯酰胺含量變化的規(guī)律。樣品經(jīng)5 mol/L NaCl溶液提取后，采用HLB固相萃取小柱進行凈化和富集。以體積比20%的乙腈溶液作為流動相，200 nm的檢測波長下檢測，外標法峰面積定量。結(jié)果表明，丙烯酰胺標準溶液在0.05 μg/mL～5.00 μg/mL 濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù) R2為 0.999，檢出限為 4.5 μg/kg，定量限為 15.0 μg/kg，加標回收率達到96.2%～98.5%，相對標準偏差（RSD）為1.8%～3.2%。

高效液相色譜；烹飪；丙烯酰胺

Abstract：A rapid and effective method was established for the determination of acrylamide in cooking food by high performance liquid chromatography （HPLC），and the changes of acrylamide content during the cooking process.After extracted by 5 mol/L NaCl solution，the sample was concentrated and purified by HLB solid phase extraction column.The separation of targeted use acetonitrile solution with volume ratio of 20%as mobile phase，with 200 nm as the detection wavelength and the peak area was quantified by external standard method.The linear range of acrylamide was in the range of 0.05 μg/mL-5.00 μg/mL with a correlation coefficient of 0.999.The detection limit was 4.5 μg/kg and the quantitative limit was 15.0 μg/kg.The recovery rate was 96.2%-98.5%，and the relative standard deviation（RSD）ranged from 1.8%to 3.2%.

Key words：high performance liquid chromatography（HPLC）；cooking；acrylamide

丙烯酰胺的分子量為70.08，是一種小分子化合物，結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖1 丙烯酰胺的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of acrylamide

丙烯酰胺已被WHO國際癌癥研究中心列為可能致癌物質(zhì)，體外細胞實驗和動物實驗都證明丙烯酰胺可導(dǎo)致遺傳物質(zhì)的改變和癌癥的發(fā)生[1]。食品中丙烯酰胺的形成是一系列復(fù)雜的多級反應(yīng)過程，該過程包含離子型反應(yīng)和自由基反應(yīng)。例如，丙烯醛、丙烯酸與氨發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)，氨基酸分子的重新排列和轉(zhuǎn)化、氨基酸和糖類物質(zhì)發(fā)生美拉德反應(yīng)等[2]。當(dāng)食物在烹飪過程中被加熱到120℃以上時，食物中的天門冬酰胺和還原性糖在高溫加熱過程中通過美拉德反應(yīng)即可生成丙烯酰胺，此外食物的烹飪方式對丙烯酰胺的產(chǎn)生影響很大，也決定過程中丙烯酰胺的含量多少[3-5]。本試驗在研究檢測烹飪食物中丙烯酰胺含量方法的基礎(chǔ)上，研究不同烹飪階段以及不同烹飪方式對食物中丙烯酰胺含量的影響。

目前食品中丙烯酰胺檢測方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜法、高效液相色譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等[6-12]。其中，氣相色譜-質(zhì)譜法在對樣品的前處理過程中，要對目標物進行溴衍生化，方法比較繁瑣，目標物回收率不高；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法所需儀器非常昂貴，試驗一般很難推廣。本試驗利用高效液相色譜法結(jié)合固相萃取技術(shù)對烹飪的食品進行丙烯酰胺的檢測，針對烹飪食品中含有大量脂肪、蛋白質(zhì)的特點，固相萃取技術(shù)可以很好地提高目標物的提取率以及凈化目標物的溶液[13-19]。本試驗選用HLB固相萃取柱用于丙烯酰胺樣品凈化，并對其條件進行摸索研究，建立一種快速、簡便、凈化效果好的固相萃取-高效液相色譜法分析烹飪食品過程中丙烯酰胺含量的方法，并用此方法研究烹飪不同階段以及不同烹飪方式下食物中丙烯酰胺含量的變化。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

2695型高效液相色譜系統(tǒng)、2998型PDA檢測器、HLB固相萃取小柱（規(guī)格3 cc，250 mg）：美國Waters公司；RV10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國IKA公司；丙烯酰胺標準品：國家標準物質(zhì)中心。

1.2 色譜條件

色譜柱：SepaxSapphireC18（4.6mm×250mm，5μm）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

1.3 方法

1.3.1 流動相體系的選擇

分別研究6種不同體積分數(shù)的乙腈溶液（0%、20%、40%、60%、80%、100%）作為流動相，以此來考察對目標物的分離效果。

1.3.2 檢測波長的選擇

通過二極管陣列檢測器對丙烯酰胺的標準溶液進行全波長掃描（掃描范圍190 nm～350 nm），根據(jù)目標峰的響應(yīng)值，選擇有最大響應(yīng)值的波長。

1.3.3 標準曲線的制作

準確稱取10.0 mg丙烯酰胺標準品于10.0 mL容量瓶中，用甲醇完全溶解后定容至刻度，配制成1.0 mg/mL丙烯酰胺標準儲備液。再吸取相應(yīng)體積的標準儲備液配制成 0.05、0.50、1.00、2.00、5.00 μg/mL 等系列濃度的標準溶液，進行儀器分析，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標繪制標準曲線。

1.3.4 樣品前處理條件的優(yōu)化

對前處理過程分別優(yōu)化樣品的提取溶劑以及提取方式的選擇、樣品的脫脂溶劑的選擇；在選用HLB固相萃取小柱凈化和富集目標物時，分別對洗脫液的選擇、洗脫液體積等方面進行優(yōu)化，以便選較合適的條件進行方法試驗，結(jié)果以加標回收率作為比較依據(jù)。

1.3.5 加標回收試驗及樣品測定

在以上試驗的優(yōu)化條件下，利用已知含量的樣品進行加標回收率試驗，分別添加 50、100、200 μg/kg等3個梯度濃度的標準溶液，每個濃度平行測定3次，計算回收率。

1.3.6 烹飪過程中不同階段以及不同烹飪工藝中食物的丙烯酰胺含量

以糖醋排骨為例，研究烹飪過程中丙烯酰胺的變化，樣品中丙烯酰胺的測定按照優(yōu)化后的試驗方法進行。此外，還測定了不同烹飪工藝制成的食品中丙烯酰胺的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動相體系的選擇

由丙烯酰胺的結(jié)構(gòu)可知，它是一種極性很強的化合物。因此在色譜柱中進行分離時，流動相的選擇對其有很大影響。本試驗比較了6種不同體積分數(shù)的乙腈溶液（0%、20%、40%、60%、80%、100%）作為流動相，以此來考察對目標物的分離效果。

濃度為2.0 μg/mL丙烯酰胺標準溶液的色譜圖見圖2所示。

圖2 丙烯酰胺的色譜圖Fig.2 The chromatograms of acrylamide

如圖2所示，以純水和純乙腈為流動相分離目標物時，色譜圖中沒有出現(xiàn)相應(yīng)的目標峰；以40%、60%、80%的乙腈溶液作流動相時，目標峰的色譜峰形較差，同時以80%的乙腈溶液做流動相時，色譜峰的基線穩(wěn)定性不好。當(dāng)以20%的乙腈溶液作為流動相時，目標峰的保留時間和峰形都較理想，基線平穩(wěn)且無明顯漂移的現(xiàn)象，色譜峰的分離效果也比較好，所以本試驗選擇20%的乙腈溶液作為分離丙烯酰胺目標峰的流動相組成。

2.2 檢測波長的選擇

丙烯酰胺的檢測波長，各文獻表述不太一致，其中最大波長可達260 nm，最小為197 nm[21-24]。為提高試驗的準確性和靈敏度，本試驗通過二極管陣列檢測器對丙烯酰胺的標準溶液進行全波長掃描，選擇目標物有最大響應(yīng)值的波長。丙烯酰胺的全波長掃描圖見圖3。

圖3 丙烯酰胺的全波長掃描圖Fig.3 Full wavelength scanning chart of acrylamide

結(jié)果如圖3顯示，丙烯酰胺的最大吸收波長在190 nm～220 nm范圍內(nèi)，然后分別比較在190、200、210、220 nm波長下的丙烯酰胺標準溶液色譜圖。結(jié)果顯示，在190 nm和200 nm下丙烯酰胺色譜峰的吸收值最高，但是在190 nm下色譜峰的基線噪音比較大，所以本試驗選擇200 nm作為丙烯酰胺目標物的檢測波長。

2.3 標準曲線的制作

為了驗證丙烯酰胺在20%的乙腈溶液流動相中的線性關(guān)系，配制了濃度為0.05、0.50、1.00、2.00、5.00 μg/mL的系列標準溶液。試驗結(jié)果表明，丙烯酰胺在 0.05 μg/mL～5.00 μg/mL 內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系（R2＞0.99）；依據(jù)色譜峰的信噪比的3倍確定檢出限（LOD），信噪比的10倍確定定量限（LOQ），得到丙烯酰胺組分的 LOD 為 4.5 μg/kg，LOQ 為 15.0 μg/kg，結(jié)果見表1。

表1 丙烯酰胺的保留時間、標準曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限Table 1 Retention time，standard curve，correlation coefficient，detection limit and quantitative limit of acrylamide

2.4 樣品提取方法的優(yōu)化

2.4.1 提取溶劑的選擇

丙烯酰胺極易溶于水、甲醇、乙醇等溶劑，特別是在水中的溶解度很大，所以一般用水作為目標物的提取溶劑。但是考慮到實際樣品中含有蛋白質(zhì)、油脂等物質(zhì)，如果直接用水提取，容易發(fā)生乳化現(xiàn)象，所以一般會用NaCl溶液代替純水作為提取溶劑。NaCl溶液在提取目標物的同時，會使樣品中的蛋白質(zhì)等物質(zhì)發(fā)生鹽析現(xiàn)象，從而利用丙烯酰胺的提取。本試驗分別選用5 mol/L NaCl溶液與純水作為提起溶劑，再分別選用超聲提取和高速均質(zhì)等提取方式進行比較。不同提取溶劑以及提取方式對回收率的影響見表2。

表2 不同提取溶劑以及提取方式對回收率的影響Table 2 Effects of different solvents and extraction methods on recovery

從表2結(jié)果可以看出，5 mol/L的氯化鈉溶液作為提取溶劑，并結(jié)合高速均質(zhì)的提取方式進行樣品中丙烯酰胺提取的效果最好。

2.4.2 脫脂溶劑的選擇

烹飪過程中食物中的油脂會影響丙烯酰胺目標物的提取及純化效果，所以一般要對樣品進行脫脂處理。由于丙烯酰胺不溶于烷烴化合物，故本研究分別選取正己烷、環(huán)己烷、石油醚3種溶劑對樣品進行脫脂，并比較脫脂過程中三者對丙烯酰胺損失率的影響。不同脫脂劑對丙烯酰胺損失率的影響見表3。

表3 不同脫脂劑對丙烯酰胺損失率的影響Table 3 Effect of different degreasing agents on the loss rate of acrylamide

如表3結(jié)果所示，正己烷、環(huán)己烷和石油醚對樣品進行脫脂后，丙烯酰胺的損失率分別為1.8%、3.0%和4.6%，這說明脫脂步驟并不會對丙烯酰胺的提取造成很大影響。其中正己烷作為脫脂溶劑時，丙烯酰胺的損失率最小為1.8%，故本試驗選擇正己烷作為樣品的脫脂溶劑。

2.5 固相萃取條件的優(yōu)化

2.5.1 洗脫液的選擇

試驗選用HLB固相萃取小柱對目標物進行提取和純化，在對小柱的洗脫液方面分別比較了超純水、25%、50%、75%、100%的甲醇溶液5種溶液的洗脫效果，并分別對 3個濃度 0.05、0.25、1.00 μg/mL 的丙烯酰胺標準品進行洗脫，比較目標物的回收率。不同體積分數(shù)甲醇溶液作為洗脫液對丙烯酰胺回收率的影響見圖4。

圖4 不同體積分數(shù)甲醇溶液作為洗脫液對丙烯酰胺回收率的影響Fig.4 The effect of different volume fractions of methanol solution on the recovery of acrylamide

結(jié)果如圖4所示，當(dāng)選用純水進行洗脫時，3種濃度的目標物回收率都比較高；但是隨著溶液中甲醇比例的增加，目標物的回收率有所下降。當(dāng)甲醇體積分數(shù)增長到75%時，已檢測不到0.05 μg/mL的目標物含量，所以本試驗選擇超純水作為樣品的洗脫溶劑。

2.5.2 洗脫液體積的選擇

在上述選用超純水作為HLB固相萃取小柱洗脫液的基礎(chǔ)上，比較了洗脫液體積對目標物回收率的影響。分別比較了超純水1、2、3、4、5 mL 5種體積對丙烯酰胺目標物洗脫效果的影響。洗脫液體積對丙烯酰胺回收率的影響見圖5。

圖5 洗脫液體積對丙烯酰胺回收率的影響Fig.5 The effect of eluent volume on the recovery of acrylamide

如圖5所示，隨著洗脫液體積不斷增加，丙烯酰胺的回收率逐漸升高，但洗脫液體積達到3 mL以后再增加洗脫劑體積，丙烯酰胺回收率并沒有明顯增加，所以從節(jié)約的角度考慮，選擇3 mL為洗脫體積較合適。

2.6 加標回收與相對偏差

在以上試驗的優(yōu)化條件下，利用已知含量的樣品進行加標回收率試驗，在分別添加50、100、200 μg/kg 3個梯度濃度的標準溶液，每個濃度平行測定3次，測定結(jié)果見表4。

表4 方法的回收率及相對標準偏差（n=3）Table 4 Recoveries and relative standard deviations（RSD）of the method（n=3）

由表4可見，丙烯酰胺的加標回收率為96.2%～98.5%，相對標準偏差（RSD）為1.8%～3.2%，表明本試驗所建立的方法具有可靠的準確度和精密度。

2.7 烹飪過程中不同階段以及不同烹飪工藝中食物的丙烯酰胺含量

本試驗以糖醋排骨為例，研究烹飪過程中各個階段丙烯酰胺的含量情況。測定方法按照本試驗優(yōu)化后的試驗條件進行，整個烹飪工藝分為7個階段來進行測定。在烹飪過程中丙烯酰胺含量的變化見圖6。

圖6 在烹飪過程中丙烯酰胺含量的變化（n=3）Fig.6 The change of acrylamide content during the cooking process（n=3）

如圖6所示，在烹飪糖醋排骨的過程中，從油炸過程開始時整個食物的丙烯酰胺的含量開始快速上升，并一直保持到食物烹飪完為止，但是遠低于規(guī)定的每日平均0.1 mg/kg體重才會有致癌風(fēng)險的限量值[25]。

3 結(jié)論

建立一種固相萃取-高效液相色譜法檢測烹飪食品中丙烯酰胺含量的分析方法。結(jié)果表明，在體積比20%的乙腈溶液作為流動相體系中，丙烯酰胺能得到良好的基線分離，其峰型良好，出峰時間合適。在200 nm的檢測波長下，丙烯酰胺在 0.05 μg/mL～5.00 μg/mL內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，并得到丙烯酰胺LOD為4.5 μg/kg，LOQ 為 15.0 μg/kg。樣品以 5 mol/L NaCl溶液作為提取溶劑，并結(jié)合高速均質(zhì)的提取方式進行樣品中丙烯酰胺提取的效果最好；采用HLB固相萃取柱法，以3 mL超純水作為洗脫溶劑，可實現(xiàn)對目標物的凈化與富集。丙烯酰胺的加標回收率為96.2%～98.5%，相對標準偏差（RSD）為1.8%～3.2%，表明本試驗所建立的方法具有可靠的準確度和精密度。并以此檢測方法研究食品烹飪過程中丙烯酰胺的變化過程，發(fā)現(xiàn)食物以高溫油炸烹飪工藝后丙烯酰胺的含量較高。

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Determination and Change Rule of Acrylamide in Cooking Food

LI He-shan
（Guilin University of Technology，Guilin 541000，Guangxi，China）

2017-04-11

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.19.029

李河山（1979—），男（壯），講師，碩士研究生，研究方向：旅游烹飪與營養(yǎng)。