王靜，王成，萬淑君，李丹丹，張春妮，汪俊軍

(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院臨床檢驗科，南京 210002)

·臨床實驗研究·

2型糖尿病及其微血管并發(fā)癥患者血清miR-661水平變化及其輔助診斷價值*

王靜，王成，萬淑君，李丹丹，張春妮，汪俊軍

(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院臨床檢驗科，南京 210002)

目的觀察2型糖尿病(T2DM)及其微血管并發(fā)癥(T2DMC)患者血清miR-661水平變化并分析其臨床輔助診斷價值。方法用實時熒光定量PCR技術(shù)(qRT-PCR)檢測60例T2DM患者、60例T2DMC患者及60例健康對照者血清中miR-661水平，同時測定空腹血糖(FPG)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和糖化血紅蛋白(HbA1c)等指標(biāo)水平，ROC曲線、相關(guān)性分析及Logistic regression分析血清miR-661對T2DM及T2DMC的診斷價值。結(jié)果qRT-PCR結(jié)果顯示，T2DM患者和T2DMC患者血清miR-661相對含量[中位數(shù)(四分位數(shù))][M(P25，P75)]分別為230.1(83.6，426.2)fmol/L和441.3(212.9，1 021.0)fmol/L，與健康人對照組的118(63.6，192.4)fmol/L相比，均升高(U值分別為1 207和435，P均<0.01)；血清miR-661 T2DM的ROC曲線下面積(AUCROC)為0.665(95%CI=0.565～0.765，P<0.01)，T2DMC的AUCROC為0.879(95%CI=0.821～0.938，P<0.01)，區(qū)分T2DM及T2DMC的AUCROC為0.694(95%CI=0.600～0.788，P<0.01)；相關(guān)性分析結(jié)果顯示血清miR-661水平與FPG和LDL-C呈正相關(guān)(r值分別為0.291和0.149，P均<0.05)，與HDL-C呈負(fù)相關(guān)(r為-0.243，P<0.01)；進(jìn)一步用單因素和多因素Logistic regression分析結(jié)果顯示，血清miR-661是T2DM和T2DMC的獨立危險因素(P均<0.01)。結(jié)論血清中表達(dá)升高的miR-661是T2DM及T2DMC患者潛在輔助診斷標(biāo)志物及獨立危險因素。

2型糖尿?。晃⒀懿l(fā)癥；微小核糖核酸；血清；生物標(biāo)志物

Abstract:ObjectiveTo investigate the serum levels of miR-661 in type 2 diabetes(T2DM)patients and type 2 diabetes with microvascular complications(T2DMC), and to further evaluate its clinical auxiliary diagnosis significance.MethodsThe serum levels of miR-661 were examined in 60 T2DM patients, 60 T2DMC patients and 60 healthy controls using quantitative real-time PCR(qRT-PCR). The sera levels of biochemical parameters including fasting plasma glucose(FPG), cholesterol(TC), triglycerides(TG), low density lipoprotein(LDL-C), high density lipoprotein(HDL-C)and haemoglobinA1C(HbA1c)were determined by biochemical analyzer. The ROC curve analysis, correlation analyses and logistic regression analyses were performed to evaluate the clinical auxiliary diagnosis value of serum miR-661, respectively.ResultsThe qRT-PCR results showed that the concentrations of miR-661 was 118(63.6,192.4)fmol/L in healthy controls, which were significant lower than those of T2DM patients[230.1(83.6,426.2)fmol/L,(U=1 207，P<0.01)]and T2DMC patients[441.3(212.9,1 021)fmol/L,(U=435，P<0.01)]. ROC curve(AUCROC)of miR-661 was 0.665( 95%CI: 0.585～0.765,P<0.01)for T2DM patients and 0.879( 95%CI: 0.821 ～ 0.938,P<0.01)for T2DMC patients. The AUCROCbetween T2DM and T2DMC patients was 0.694(95%CI: 0.600～0.788,P<0.01). The correlation analyses revealed that the levels of miR-661 was positively correlated with concentrations of FPG(r=0.291,P<0.05)and LDL-C(r=0.149,P<0.05), and negatively correlated with concentrations of HDL-C(r=-0.243，P<0.01). Logistic regression analysis revealed that serum miR-661 was an independent risk factor in T2DM and T2DMC(P<0.01).ConclusionSerum miR-661 was potential biomarker and risk factor for T2DM and T2DMC.

Keywords: type 2 diabetes; microvascular complications; microRNA; serum; biomarkers

2型糖尿病(type 2 diabetes，T2DM)發(fā)病機(jī)制目前尚不完全清楚。隨著患病時間延長，T2DM患者發(fā)生微血管病變(type 2 diabetes microvascular complications，T2DMC)幾率上升，但目前臨床尚缺乏有效診斷T2DMC的血清生物標(biāo)志物。

微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是一類非編碼單鏈小RNA分子，可通過與靶信使RNA 3′端非翻譯序列完全或部分互補(bǔ)結(jié)合調(diào)控靶基因表達(dá)[1]。研究顯示，miRNA與β細(xì)胞功能、胰島素分泌和T2DM發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-661可參與胰島素合成及調(diào)節(jié)，與血管內(nèi)皮細(xì)胞功能及內(nèi)皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，提示其可能與T2DM及T2DMC發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3-4]。人血清/血漿中含有大量穩(wěn)定表達(dá)的miRNA，其對T2DM臨床價值目前尚不清楚，但相關(guān)研究較少。本研究檢測了T2DM及T2DMC患者血清中miR-661的表達(dá)水平，探討其作為T2DMC輔助診斷的生物標(biāo)志物的可能性，為T2DM及其微血管并發(fā)癥的診斷和發(fā)病機(jī)制探討提供新的思路。

1 材料和方法

1.1研究對象 收集2013年9月至2015年5月南京總醫(yī)院內(nèi)分泌科T2DM患者。T2DM患者(包括微血管并發(fā)癥患者)按照WHO制定的標(biāo)準(zhǔn)入選：即FPG≥7.0 mmol/L和/或75 g口服葡萄糖耐量試驗(OGTT) 2 h血糖≥11.1 mmol/L和/或糖化血紅蛋白(HbA1c)≥6.5%；T2DMC納入標(biāo)準(zhǔn)：患有T2DM并被確診有糖尿病腎病或/和糖尿病神經(jīng)病變或/和糖尿病視網(wǎng)膜病變。T2DM患者60例，其中男39例，女21例，年齡18～74歲，平均年齡47.8歲；T2DMC患者60例，其中男47例，女13例，年齡22～93歲，平均年齡51.7歲。T2DM及T2DMC患者排除標(biāo)準(zhǔn)：一個月內(nèi)使用過降糖藥物治療、肝臟疾病、慢性腎功能不全、患有其他內(nèi)分泌疾病及最近一個月內(nèi)做過大型外科手術(shù)。健康對照者為在我院體檢人群，其中男40例，女20例，年齡34～88歲，平均年齡48.9歲。納入標(biāo)準(zhǔn)為：3年內(nèi)無手術(shù)或重大疾病史，各項體檢指標(biāo)包括體格檢查、血液學(xué)檢驗、體液檢驗、影像學(xué)檢查等均正常。

1.2標(biāo)本采集與保存 采集患者入院時(新發(fā)或一個月內(nèi)未使用任何降糖藥物)及健康對照者空腹靜脈血5 mL，室溫1 500×g離心5 min，收集血清標(biāo)本于-80 ℃保存，采集研究對象靜脈血2.5 mL,肝納素抗凝。

1.3儀器及試劑 LightCycler?480Ⅱ?qū)崟r熒光定量PCR(qRT-PCR)儀(美國Roche公司)；2720型PCR儀、miRNA測定用TaqMan探針(美國ABI公司)；WH-851型渦旋儀(南京大學(xué))，1612-1型高速離心機(jī)(上海醫(yī)療器械公司)；5418型高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；SAS67120型超純水機(jī)(法國Millipore公司)；7600型全自動生化分析儀(日本Hitachi公司)；HLC-723GB HbA1c檢測全自動分析儀及其配套試劑(日本TOSOH公司)；酸性水飽和酚、DEPC水(美國Sigma公司)；分析純氯仿、異丙醇、無水乙醇(上海化學(xué)試劑公司)；miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR檢測試劑盒(大連TaKaRa公司)；人工合成的miRNA成熟體(上海Invitrogen公司)；空腹血糖(FPG)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)檢測試劑(英國Randox公司)；低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)檢測試劑(日本積水醫(yī)療株式會社)。

1.4生化指標(biāo)測定 用配套的校準(zhǔn)品校準(zhǔn)儀器，校準(zhǔn)通過、質(zhì)控在控后用7600型全自動生化分析儀通過酶法測定血清FPG、TC、TG、LDL-C、HDL-C水平。用HLC-723GB HbA1c檢測全自動分析儀通過離子交換高效液相色譜法(high performance liquid chromatography)測定HbA1c。

1.5血清RNA提取及實時熒光定量PCR 用課題組前期建立和優(yōu)化的酸性苯酚-氯仿一步抽提法提取血清RNA[5]。RNA提取后溶于20 μL DEPC水并保存于-80 ℃待用。血清miRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)總體系為10 μL，包括DEPC水3.5 μL，5×AMV緩沖液2 μL，dNTP 1 μL，逆轉(zhuǎn)錄引物1 μL，MV逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL，RNA 2 μL。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參數(shù)：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，4 ℃保存。qRT-PCR總反應(yīng)體系為20 μL，包括ddH2O 14.77 μL、10 × PCR緩沖液2 μL、25 mmol/L MgCl21.2 μL、10 mmol/L dNTPs 0.4 μL、Taq聚合酶0.3 μL、miRNA檢測引物及探針0.33 μL、cDNA 1 μL。qRT-PCR反應(yīng)參數(shù)為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min(收集熒光)，共40個循環(huán)。miRNA檢測均設(shè)置3復(fù)孔，結(jié)果取均值。同時以DEPC處理的不含cDNA模板的ddH2O作為陰性對照。血清miRNA定量尚缺乏合適、通用內(nèi)參基因，我們在RNA提取過程中加入20 μL 106fmol/L人工合成的外源植物MIR2911(序列為5′-GGCCGGGGGACGGGCUGGGA-3′)作為外參，用于校正RNA提取效率和誤差，并將待測miRNA與MIR2911同時檢測，擴(kuò)增結(jié)束后根據(jù)擴(kuò)增曲線設(shè)定統(tǒng)一的閾值，用儀器自帶SDS 2.0分析軟件分析擴(kuò)增曲線，獲得待測miRNA和外參MIR2911的Ct值。根據(jù)待測miRNA和MIR2911的Ct值計算待測樣本及對照中血清miR-661的相對表達(dá)量，計算公式為2-ΔCt，其中ΔCt=Ct待測miRNA-CtMIR2911。

2 結(jié)果

2.1臨床資料及血生化指標(biāo)測定結(jié)果 患者組年齡、性別與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但兩組患者BMI、舒張壓和收縮壓則高于健康人對照組(P<0.01)。生化指標(biāo)測定結(jié)果見表1，兩組糖尿病患者FPG、HbA1c、TG均高于健康人對照組(P均<0.01)，而HDL-C則低于健康人對照組(P<0.01)，T2DMC患者LDL-C高于健康人對照組(P<0.01)。

表1 糖尿病及糖尿病微血管患者臨床資料及血生化測定結(jié)果

注：a，T2DM與對照比較；b，T2DMC組與對照比較；c，T2DMC組與T2DM比較。

2.2血清miR-661檢測 qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，T2DM患者和T2DMC患者血清miR-661相對含量[M(P25，P75)]分別為230.1(83.6,426.2)fmol/L和441.3(212.9,1 021.0)fmol/L，與健康人對照組118(63.6,192.4)fmol/L相比均升高，U值分別為1 207和435，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.3miR-661輔助診斷T2DM及T2DMC 的ROC曲線分析結(jié)果 miR-661診斷T2DM的ROC曲線下面積(AUCROC)為0.665(95%CI=0.565～0.765，P<0.01)；診斷T2DMC的AUCROC為0.879(95%CI=0.821～0.938，P<0.01)；鑒別T2DM及T2DMC的AUCROC為0.694(95%CI=0.600～0.788，P<0.01)。

2.4相關(guān)性分析 對血清miR-661的水平和其他生化指標(biāo)相關(guān)性分析結(jié)果顯示，血清miR-661水平與FPG和LDL-C呈正相關(guān)，r值分別為0.291和0.149，P均<0.05，與HDL-C呈負(fù)相關(guān)，r值為-0.243，P<0.01，但與TC和TG無相關(guān)性，r值分別為-0.096和0.091，P均>0.05。

2.5邏輯回歸分析 單因素分析結(jié)果顯示，當(dāng)以健康對照為二分類參考變量時，miR-661是T2DM和T2DMC獨立危險因素。進(jìn)一步多因素回歸分析校正年齡、性別、BMI、血壓及吸煙等因素后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)以健康人對照組為參考變量時，miR-661仍是T2DM和T2DMC患者潛在的獨立危險因素，邏輯回歸分析結(jié)果見表2。

表2 血清miR-661單因素及多因素邏輯回歸分析

注：模型1中二分類參考變量為健康對照組；模型2中二分類參考變量為T2DM組。

3 討論

研究顯示，miRNA可作為T2DM的生物標(biāo)志物[6]。然而，目前臨床上仍無理想的生物標(biāo)志物用于預(yù)測T2DMC。miRNA通過對基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控，參與包括糖尿病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程[7]。miRNA亦被報道廣泛參與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及纖維化等微血管并發(fā)癥發(fā)生的重要病理過程，進(jìn)一步提示miRNA在血管功能紊亂及微血管并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用[8-9]。

細(xì)胞外miRNA可穩(wěn)定存在于血循環(huán)中，是T2DM潛在的生物學(xué)標(biāo)志物[10-11]。Kong等[12]發(fā)現(xiàn)，與糖尿病前期患者及糖耐量正常的糖尿病高?；颊呦啾?，7個miRNAs在新發(fā)糖尿病患者血清中水平明顯增高。Zhang等[13]和Liu等[14]則發(fā)現(xiàn)T2DM患者降低的血漿miR-126可作為預(yù)測T2DM發(fā)生發(fā)展的指標(biāo)。miR-661與糖尿病及其微血管并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。β-淀粉樣前體蛋白裂解酶(BACE1)在胰島素生物合成過程中發(fā)揮重要作用，其表達(dá)缺失可導(dǎo)致胰島素分泌嚴(yán)重不足。最新證據(jù)顯示，miR-661可通過與BACE1 mRNA結(jié)合并調(diào)控其表達(dá)參與T2DM發(fā)生。同時，miR-661還被報道參與鋅指轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程和促進(jìn)細(xì)胞增殖。這些證據(jù)均提示miR-661可能與T2DM及T2DM相關(guān)的微血管并發(fā)癥發(fā)生密切相關(guān)[15]，但其作為T2DMC輔助診斷和預(yù)測標(biāo)志物研究尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)在T2DM及T2DMC患者血清miR-661的表達(dá)水平顯著升高，ROC曲線分析結(jié)果提示miR-661對T2DM及T2DMC患者具備一定的輔助診斷價值，同時還存在鑒別診斷潛能；同時miR-661與多種血生化指標(biāo)存在相關(guān)性，進(jìn)一步提示miR-661可能參與了T2DM及其微血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展，是T2DMC潛在的獨立危險因素，可作為T2DMC患者新的輔助診斷標(biāo)志物。

研究表明，循環(huán)中miRNA可以微囊泡包裹或游離形式存在。其中，包裹于微囊泡的miRNAs能被各種細(xì)胞主動或被動分泌，并隨血液循環(huán)運輸至受體細(xì)胞并發(fā)揮生物學(xué)功能。miR-661在T2DM患者血清中的升高機(jī)制及存在形式仍不明確。但研究顯示，包裹于微囊泡的miR-661還可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞粘附及功能改變[16]?；诖?，我們猜測miR-661在T2DM及其微血管并發(fā)癥的發(fā)展過程可能來自特定細(xì)胞的分泌或釋放，并可進(jìn)入血管內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)其功能改變，對于血清miR-661的深入研究將會為T2DM并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供新的方向。

但我們研究的樣本量還不夠大，下一步將進(jìn)一步擴(kuò)大研究的病例數(shù)，驗證miR-661在T2DM及T2DMC患者中表達(dá)，并通過細(xì)胞、動物試驗研究其作用機(jī)制，為T2DM及其T2DMC的診治提供新思路。

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SerumlevelsofmiR-661anditsclinicalvalueintype2diabetespatientswithorwithoutmicrovascularcomplications

WANGJing,WANGCheng,WANShu-jun,LIDan-dan,ZHANGChun-ni,WANGJun-jun

(DepartmentofClinicalLaboratory,NanjingGeneralHospitalofNanjingMilitaryCommend,PLA,Nanjing210002,Jiangsu,China)

王靜，1983年生，女，主管技師，大學(xué)本科，主要從事臨床檢驗工作。

R446;R587.1

A

2017-02-16)

(本文編輯王海燕)

國家自然科學(xué)基金(81271904,81401257)；江蘇省自然科學(xué)基金(BK20140730);南京總醫(yī)院院課題(2017049)。

汪俊軍，主任技師，教授，博士，E-mail:wangjj9202@163.com。

10.13602/j.cnki.jcls.2017.09.06