王玉，王思明，曾潔,3，楊睿悅，李紅霞，董軍,，陳文祥,3

(1.北京大學第五臨床醫(yī)學院(北京醫(yī)院)，北京 100730；2.北京醫(yī)院 國家老年醫(yī)學中心，北京 100730；3.衛(wèi)生部臨床檢驗中心，北京 100730)

·臨床檢驗技術(shù)研究·

高效液相色譜法測定血清卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶活性的建立*

王玉1，王思明2，曾潔2,3，楊睿悅2，李紅霞2，董軍1,2，陳文祥2,3

(1.北京大學第五臨床醫(yī)學院(北京醫(yī)院)，北京 100730；2.北京醫(yī)院 國家老年醫(yī)學中心，北京 100730；3.衛(wèi)生部臨床檢驗中心，北京 100730)

目的建立高效液相色譜法(HPLC)測定血清卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(LCAT)活性的方法，觀察LCAT活性與動脈粥樣硬化性心血管病(CVD)傳統(tǒng)危險因素的關系。方法選用7-脫氫膽固醇和1,2-二癸?；视?3-磷酸(10∶0 PC)作為LCAT的反應底物，加入LCAT激活肽(LAP642)，制備脂質(zhì)體；在冰水浴中將500 μL脂質(zhì)體與10 μL血清混合，37 ℃溫育1 h；提取脂質(zhì)，HPLC測定反應后7-脫氫膽固醇及其酯之比，計算LCAT活性。用所建方法測定120例健康志愿者血清的LCAT活性，分析其與CVD危險因素的關系。結(jié)果7-脫氫膽固醇、10∶0 PC(物質(zhì)的量的比為1∶8.5)與LAP642組成的脂質(zhì)體制備簡單、性質(zhì)穩(wěn)定。當溫育時間0～8 h、血清量0～20 μL時，LCAT活性與變量線性相關；平均批內(nèi)不精密度(CV)和總CV分別小于1.76%、3.11%。方法比對結(jié)果顯示，所建方法與ELISA測定的LCAT質(zhì)量和內(nèi)源底物法測定的LCAT活性顯著正相關(P<0.01)。120例樣本LCAT活性與體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、三酰甘油(TG)等呈正相關(P<0.05)；與載脂蛋白AⅠ(apoAⅠ)(P<0.05)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)(P<0.01)等呈負相關。結(jié)論建立了HPLC測定LCAT活性的外源底物法，所建方法簡便、精密、可靠，結(jié)果不受反應底物影響，為脂代謝機制研究和CVD危險分析提供了新的方法學基礎。

卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶；心血管?。桓咝б合嗌V；7-脫氫膽固醇

Abstract：ObjectiveTo develop a high-performance liquid chromatography(HPLC)method for the measurement of lecithin-cholesterol acyltransferase(LCAT)activity and analyze the relationships between LCAT activity and the traditional risk factors of atherosclerotic cardiovascular disease(CVD).MethodsThe liposome which contained 7-dehydrocholesterol and 1,2-didecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(10∶0 PC)as the substrate of LCAT and LCAT activating peptide(LAP642)as LCAT activator was mixed with 10 microliters of serum sample(50∶1, V/V)in ice-water bath and subsequently incubated at 37 ℃ for 1 h. After extracting with hexane, the lipid was analyzed by HPLC and the LCAT activity was calculated as the ratio of 7-dehydrocholesterol ester to free 7-dehydrocholesterol. LCAT activities of 120 health volunteers were measured and its relationship with traditional risk factors of CVD was analyzed.ResultsThe liposome composed of substrates(7-dehydrocholesterol and 10∶0 PC with ratio of amount 1∶8.5)and LAP642 was stable, efficient and easy for preparation. LCAT activity was a linear correction during 8 hours of incubation and was independent of the volume of serum added in the range from 0 to 20 microliters. The averages of intra- and total coefficients of variation(CV)were less than 1.76% and 3.11% respectively. The comparison of two methods showed that the results of the HPLC method were highly correlated with LCAT mass measured by commercial ELISA method and LCAT activity measured by endogenous substrate fractional esterification of high density lipoprotein cholesterol(FERHDL)(P<0.01). LCAT activity positively correlated with body mass index(BMI), triglyceride(TG)(P<0.05)and negatively correlated with apolipoprotein AΙ(apoAΙ)(P<0.05)and high density lipoprotein cholesterol(HDL-C)(P<0.01)in the volunteers.ConclusionA simple, precise and reliable HPLC method for determination of LCAT activity using artificial substrate has been established, and the results were not influenced by endogenous cholesterol levels in serum. The newly developed method could be a useful tool in the study of lipid metabolism and the assessment for risk factors of CVD.

Keywords: lecithin-cholesterol acyltransferase; cardiovascular disease; high-performance liquid chromatography; 7-dehydrocholesterol

高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)降低是動脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)性心血管病(cardiovascular diseases，CVD)的重要危險因素[1]，這與HDL在膽固醇逆轉(zhuǎn)運(reverse cholesterol transport，RCT)中發(fā)揮的作用密不可分。RCT指外周組織過量的游離膽固醇酯化后被運回肝臟進而排出體外的過程；卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(lecithin-cholesterol acyltransferase，LCAT)作為膽固醇酯化的唯一催化酶且主要作用于HDL，理論上與CVD密切相關[2-3]。但LCAT與CVD的關系一直存在爭議，簡便、可靠的LCAT測定方法對LCAT功能研究及CVD風險預測具有重要意義。目前，LCAT測定主要有質(zhì)量測定和活性測定兩類方法，后者反映LCAT功能，與CVD相關性更高，可分為內(nèi)源底物法[4-7]和外源底物法[8-11]。代表性的內(nèi)源底物法為Dobiasova建立的全血清酯化速率法(cholesterol esterification rate, CER)[4]和高密度脂蛋白膽固醇分數(shù)酯化速率法(fractional esterification rate of HDL cholesterol，F(xiàn)ERHDL)[5]，3H標記全血清或HDL上的膽固醇，37 ℃溫育，薄層層析分離游離膽固醇及其酯，通過液閃計數(shù)定量計算CER或FERHDL。此外，我們課題組也建立了準確測定FERHDL的HPLC內(nèi)標法[6]。內(nèi)源法與CVD多種危險因素密切相關[6-7]，但測定結(jié)果依賴底物濃度，不能反映LCAT的真正活性。經(jīng)典外源底物法[8]選用膽固醇(或類似物)和卵磷脂作為底物制備脂質(zhì)體，加入少量血清，37 ℃溫育，測定單位時間內(nèi)同位素標記膽固醇的酯化率，計算LCAT活性。外源底物法理論上為真正意義的酶活性測定方法，但由于脂質(zhì)體制備中加入各類外源物質(zhì)，影響酶促反應程度不同，測定結(jié)果可能無法反映LCAT真實活性。本研究在探討酶促反應條件和酯化反應檢測方法的基礎上建立了HPLC測定LCAT活性的方法，并用其測定了120例健康志愿者的LCAT活性，分析LCAT與CVD傳統(tǒng)危險因素的關系。

1 材料和方法

1.1儀器與試劑 Agilent 1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；Nova-Pak C18色譜柱(5 μm，3.9 mm×150 mm，美國Waters公司)；十萬分之一天平(德國Sartorious公司)；減壓干燥箱(美國Fisher Scientific 公司)；LAURD p18水浴鍋(德國LAURD公司)；氮吹儀(北京八方世紀公司)；旋渦混合器等。脂質(zhì)體制備所用7-脫氫膽固醇購自美國Sigma公司，10∶0 PC購自美國Avanti Polar Lipids公司，LAP642由中國SBS公司合成，LCAT質(zhì)量測定試劑盒購自捷克BioVendor公司。有機溶劑乙腈、異丙醇、正己烷、無水乙醇等為HPLC級，購自美國Fisher Scientific公司。其他化學試劑如甲醇、氯仿、磷酸鹽等均為國產(chǎn)分析純試劑，購自北京化學試劑公司。

1.2LCAT活性測定底物和反應條件的選擇 選擇具有共軛雙鍵的7-脫氫膽固醇作為膽固醇類似物。為選擇合適磷脂，固定7-脫氫膽固醇濃度及其與不同碳鏈磷脂的物質(zhì)的量比，分別制備脂質(zhì)體(一定比例的磷脂和膽固醇在水中形成的穩(wěn)定微型泡囊體)，與血清溫育后，HPLC測定酯化速率；為考察LCAT酶催化反應的動力學，向脂質(zhì)體(每份500 μL)中加入3種不同個體血清，37 ℃分別溫育1、2、4、6、8 h，HPLC測定酯化速率；為考察樣本用量，向脂質(zhì)體(每份500 μL)中加入2.5、5、10、15及20 μL血清，37 ℃溫育，HPLC測定酯化速率。

1.3LCAT活性測定

1.3.1脂質(zhì)體制備 精密稱取7-脫氫膽固醇6 mg(0.015 6 mmoL)和10∶0 PC 75 mg(0.132 mmoL)，溶于1 mL氯仿，與1 mL含25 mg LAP642(0.009 mmoL)的甲醇溶液混合，N2吹干至有機溶劑完全揮發(fā)，加入100 mL三羥甲基氨基甲烷(Tris)(50 mmol/L，pH=7.45)，渦旋振蕩約0.5 min，混勻、分裝并保存于-80 ℃。

1.3.2LCAT活性測定 自-80 ℃取出脂質(zhì)體、血清和質(zhì)控血清，室溫融化。取500 μL脂質(zhì)體于冰水浴中預冷的試管中，加入各待測血清和質(zhì)控血清10 μL，37 ℃溫育1 h，溫育結(jié)束后置于冰水浴中并加入500 μL乙醇終止反應，加入正己烷1 mL，渦旋震蕩20 min抽提脂質(zhì)，轉(zhuǎn)移正己烷500 μL至進樣瓶，減壓干燥，加入0.3 mL流動相重組，HPLC分析。

1.3.3HPLC分析 取重組后的溶液30 μL進行HPLC分析。流動相為乙腈、異丙醇(1∶1)；流速1 mL/min；檢測波長280 nm。HPLC同時分離測定反應后底物(7-脫氫膽固醇)和產(chǎn)物(7-脫氫膽固醇酯)水平，酯化峰所占的面積比即酯化率，將酯化率轉(zhuǎn)化為酶活性國際單位Kat，1 Kat=(C×L1×R)/(L2×T)，其中C為7-脫氫膽固醇濃度(mol/L)，L1為每份脂質(zhì)體的體積(L)，R為酯化率(%)，L2為每份脂質(zhì)體加入血清的體積(L)，T為酯化時間(h)。

1.4不精密度考察和方法學比對 為考察LCAT測定的不精密度，取LCAT活性高、中、低的不同個體血清3份，分別測定LCAT活性5次，每次每種血清重復分析3份；質(zhì)控血清兩份，分別測定10次，每次兩個平行管；計算批內(nèi)CV和總CV。分別用本方法、市售LCAT質(zhì)量測定法和FERHDL法測定80例個體血清樣品，每樣品測定2次，考察各方法測定結(jié)果的相關性。

1.5健康志愿者樣品測定 2015年3月招募北京醫(yī)院120名健康志愿者(年齡19～72歲，男51例，女69例)，測量身高、體質(zhì)量、血壓等體征指數(shù)；采集晨起空腹血液，室溫放置1 h后離心取上清，-80 ℃保存。用所建方法測定樣品LCAT活性，每次13～18個樣品和2個質(zhì)控血清，8次完成全部測定。血清總膽固醇(TC)、TG和肌酐采用酶法測定；血清葡萄糖采用己糖激酶法；HDL-C、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)采用勻相法；apoAⅠ、apoB采用免疫比濁法。所有試劑均為Roche 公司產(chǎn)品，按試劑盒說明書在日立7180自動生化分析儀上進行測定。FERHDL和各種氨基酸、肉毒堿和溶血卵磷脂等測定使用我室建立的HPLC[6]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[12]。本研究通過北京醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會批準，志愿者均簽署了知情同意書。

1.6統(tǒng)計學分析 用Microsoft Office Excel 2010軟件分析所建方法的線性、不精密度等。用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件分析120個數(shù)據(jù)，Levene檢驗示數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布；Pearson相關分析LCAT活性與其他指標的關系，P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 實驗與結(jié)果

2.1LCAT活性測定底物的選擇 7-脫氫膽固醇最大紫外光吸收波長為280 nm，HPLC可直接測定7-脫氫膽固醇及其酯的水平。7-脫氫膽固醇與不同碳鏈長度的磷脂(14∶0、12∶0、10∶0、8∶0 PC)制備脂質(zhì)體，與血清溫育后用HPLC檢測。結(jié)果顯示，隨著脂肪酸鏈縮短，酯化峰的保留時間縮短，8∶0 PC的保留時間最短，但酯化率低，綜合酯化率與保留時間選擇10∶0 PC。HPLC分離7-脫氫膽固醇及其癸酸酯的色譜圖見圖1，分離于6 min完成。7-脫氫膽固醇濃度0.156 mmol/L，與10∶0 PC物質(zhì)的量比為1∶8.5，LAP642濃度0.09 mmol/L時，脂質(zhì)體反應活性最高。

2.2LCAT反應動力學和樣本量的選擇 脂質(zhì)體與不同個體血清反應的動力學見圖2，結(jié)果顯示溫育時間0～8 h，酯化速率與溫育時間呈線性關系。LCAT酯化反應與血清量的關系見圖3，結(jié)果顯示血清量0～20 μL，酯化速率與血清量線性相關。本研究選用溫育時間1 h，每份脂質(zhì)體加入10 μL血清(脂質(zhì)體與血清的體積比5∶1)的實驗條件。

注：峰1，7-脫氫膽固醇；峰2，7-脫氫膽固醇癸酸酯。

圖1 HPLC分離7-脫氫膽固醇及其酯化產(chǎn)物的色譜圖

圖2 3名不同個體血清LCAT酯化7-脫氫膽固醇的動力學曲線

圖3 LCAT酯化反應與血清量的關系

2.3LCAT活性測定的不精密度和方法學比對 高、中、低3個樣品和質(zhì)控樣品LCAT活性測定的平均批內(nèi)CV和總CV見表1。平均批內(nèi)CV和總CV分別小于1.76%和3.11%，精密度良好。方法比對結(jié)果顯示， 80例樣品LCAT活性與ELISA測定的LCAT質(zhì)量(r=0.50,P<0.01)和內(nèi)源底物法測定的LCAT活性(FERHDL)(r=0.52,P<0.01)均呈正相關。

2.4健康志愿者LCAT活性測定 健康志愿者血清LCAT活性測定結(jié)果與其他CVD危險因素的關系見表2。120例樣本LCAT活性為(45.33±7.44)μKat/L，其中女性為(45.46±7.55)μKat/L，男性為(45.15±7.35)μKat/L，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。將LCAT活性與其他CVD危險因素進行相關分析，LCAT活性與BMI(r=0.284，P<0.05)、TG(r=0.259，P<0.05)、谷氨酸(r=0.299，P<0.05)、亮氨酸(r=0.212，P<0.05)、苯丙氨酸(r=0.248，P<0.05)呈正相關(P<0.05)；與apoAⅠ(r=-0.225，P<0.05)、HDL-C(r=-0.320，P<0.001)、尿總酚/肌酐(r=-0.221，P<0.05)、谷氨酸/谷氨酰胺(r=-0.291，P<0.05)、溶血卵磷脂18∶1(r=-0.219，P<0.05)呈負相關；與肉毒堿10∶1、18∶1無相關關系(P>0.05)。

表1 HPLC測定血清LCAT活性的精密度

表2 120例健康志愿者LCAT活性及其與CVD危險因素的相關性

參數(shù)x±sr(P)LCAT(μKat/L)45．33±7．44-年齡(歲)42．53±15．11-0．267??(<0．05)BMI23．11±3．240．284??(<0．05)TC(mmol/L)4．70±0．97-0．113(>0．05)TG(mmol/L)1．20±0．800．259??(<0．05)HDL?C(mmol/L)1．43±0．38-0．320??(<0．01)LDL?C(mmol/L)2．99±0．92-0．084(>0．05)apoAⅠ(mg/L)1．57±0．25-0．225?(<0．05)apoB(mg/L)0．91±0．250．007(>0．05)尿總酚/肌酐123．57±53．06-0．221?(<0．05)Glu(μmol/L)7．08±1．910．299?(<0．05)Gln(μmol/L)85．91±9．55-0．072(>0．05)Gln/Glu13．06±4．00-0．291??(<0．05)Val(μmol/L)29．88±5．450．146(>0．05)Ile(μmol/L)9．80±2．540．140(>0．05)Leu(μmol/L)17．62±3．560．212?(<0．05)Phe(μmol/L)11．62±1．840．248??(<0．05)Tyr(μmol/L)12．15±2．050．091(>0．05)Trp(μmol/L)13．01±2．140．111(>0．05)LPC16∶0(μmol/L)53．32±9．090．027(>0．05)LPC18∶0(μmol/L)10．15±3．44-0．067(>0．05)LPC18∶1(μmol/L)10．26±2．10-0．219?(<0．05)LPC18∶2(μmol/L)31．58±10．44-0．054(>0．05)Carnitine(μmol/L)6．73±1．50-0．046(>0．05)Acetylcarnitine(μmol/L)1．82±0．61-0．083(>0．05)C10∶1acylcarnitine(μmol/L)0．11±0．05-0．114(>0．05)C18∶1acylcarnitine(μmol/L)0．07±0．02-0．157(>0．05)

注：Glu,谷氨酸;Gln谷氨酰胺;Val纈氨酸;Ile,異亮氨酸;Leu,亮氨酸;Phe,苯丙氨酸;Tyr,酪氨酸;Trp,色氨酸;LPC,溶血卵磷脂; Carnitine,肉毒堿; Acetylcarnitine,乙酰肉毒堿。

3 討論

LCAT活性測定是酶反應測定，測定結(jié)果依賴于反應體系和過程，因此反應體系的選擇和反應過程的定義至關重要。一直以來，LCAT活性測定的外源底物法在脂質(zhì)體的組成、制備和反應檢測等方面設計多樣，結(jié)果缺乏可比性。首先， LCAT的底物不溶于水，幾乎無法在不添加任何外源性物質(zhì)的情況下制備穩(wěn)定性高、活性強的反應底物脂質(zhì)體。外源物質(zhì)主要有apoAⅠ、清蛋白[8]、巰基乙醇、溶血卵磷脂等，不同方法加入的種類和含量均不同，對LCAT活性的影響程度不一。其次，底物類型選擇不同，檢測方法也隨之不同，同位素標記法采用液閃計數(shù)測定，安全性差，不適合臨床使用；具有熒光基團的甾醇(DHE)[10]采用熒光光度法測定，靈敏度高；標準曲線內(nèi)標法用HPLC法測定，需二次測定，處理過程復雜，結(jié)果變異大[11]。第三，脂質(zhì)體制備常采用超聲破碎、膽酸鈉透析法等，操作復雜、費時，穩(wěn)定性差[8,11]。

本研究選擇7-脫氫膽固醇和10∶0 PC作為底物，加入LAP642作為LCAT的激活劑和底物助溶劑。之前文獻選用apoAⅠ，其純化困難，價格昂貴，性質(zhì)不穩(wěn)定，本實驗用LAP642代替apoAⅠ，價格低、具有較好助溶性，只需渦旋混合即可制備性質(zhì)穩(wěn)定的脂質(zhì)體。HPLC可同時分析反應后的7-脫氫膽固醇及其酯，不需要校準物和內(nèi)標，通過峰面積計算7-脫氫膽固醇酯所占的百分比，即酯化速率，很大程度上簡化了實驗步驟，減少實驗誤差。溫育時間0～8 h、血清量0～20 μL范圍內(nèi)，LCAT活性與變量線性相關，說明在一定血清量和時間段內(nèi)，單位時間LCAT轉(zhuǎn)化底物的物質(zhì)的量相同，酯化率不受內(nèi)源性底物(血清膽固醇)的影響，符合零級反應。精密度評價結(jié)果顯示，平均批內(nèi)CV和總CV分別小于1.76%和3.11%，與之前報道的方法相比，精密度更好[8,11]。方法比對結(jié)果顯示，本法測定的LCAT活性與LCAT質(zhì)量和FERHDL檢測結(jié)果顯著正相關，但因為不同方法測定的LCAT的生物學意義不同，測定結(jié)果并不完全一致。

用所建方法測定了120例健康志愿者血清的LCAT活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LCAT活性與CVD危險因素指標如BMI、TG、FERHDL檢測結(jié)果等正相關，與CVD保護因素apoAⅠ、HDL等負相關，具有統(tǒng)計學意義，提示本研究所測定的LCAT活性越高，CVD風險越高。這一結(jié)論與Dullaart、Holleboom和Tani等[13-15]的研究一致，與Sethi等[16]不同。另外，LCAT活性與多種CVD新生物學標志物[12](支鏈和芳香族氨基酸、溶血卵磷脂等)密切相關。綜上所述，本研究所建方法脂質(zhì)體制備簡便、快速；脂質(zhì)體穩(wěn)定，反應活性高；HPLC同時檢測7-脫氫膽固醇及其酯，不需要校準品和內(nèi)標，精密度高；基本不受內(nèi)源性底物的影響，結(jié)果反映血清LCAT活性，所建方法用于LCAT功能研究和CVD危險分析。本研究仍存在不足之處，由于人體血清中本身含有apoAⅠ，實驗中加入其類似物LAP642，對血清中LCAT活性的影響可能不均一，導致測定結(jié)果有所偏差。故仍需進一步深入研究不加任何外源物質(zhì)的脂質(zhì)體制備。

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Measurementoflecithin-cholesterolacyltransferaseactivityusinghigh-performanceliquidchromatography

WANGYu1,WANGSi-ming2,ZENGJie2,3,YANGRui-yue2,LIHong-xia2,DONGJun1,2,CHENWen-xiang2,3

(1.PekingUniversityFifthSchoolofClinicalMedicine,BejingHospital,Beijing100730;2.BeijingHospital,NationalCenterofGerontology,Beijing100730; 3.NationalCenterforClinicalLaboratories,Beijing100730,China)

R446；R541.4

A

2017-04-17)

(本文編輯王海燕)

國家自然科學基金(81472035，81171647)。

王玉，1991年生，女，碩士研究生，研究方向為血脂代謝。

董軍，研究員，博士研究生導師，E-mail:jun_dong@263.net。

10.13602/j.cnki.jcls.2017.09.02