徐 紅， 余偉志， 薛 瑩， 邢 悅， 肖昭揚(yáng)， 孫藝平， 張萬(wàn)琴， 趙 杰， 唐一源， 殷盛明△

(1. 大連醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 遼寧 大連 116044； 2. 大連醫(yī)科大學(xué)13-15級(jí)研究生， 遼寧 大連 116044；3. 大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二臨床學(xué)院， 遼寧 大連 116023； 4. 美國(guó)德州理工大學(xué)腦成像研究院， 德克薩斯州 79409)

MPTP致空間學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠腦內(nèi)NSF表達(dá)變化*

徐 紅1， 余偉志2， 薛 瑩2， 邢 悅2， 肖昭揚(yáng)3， 孫藝平1， 張萬(wàn)琴1， 趙 杰1， 唐一源4， 殷盛明1△

(1. 大連醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 遼寧 大連 116044； 2. 大連醫(yī)科大學(xué)13-15級(jí)研究生， 遼寧 大連 116044；3. 大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二臨床學(xué)院， 遼寧 大連 116023； 4. 美國(guó)德州理工大學(xué)腦成像研究院， 德克薩斯州 79409)

目的觀察1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)致空間學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠腦內(nèi)N-乙基馬來酰亞胺敏感融合蛋白(NSF)表達(dá)變化。方法C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為2組(n=24)，包括對(duì)照組和MPTP處理組，雌雄各半。MPTP處理組給予C57BL/6J小鼠MPTP (20 mg/0.2 ml/(kg·d), s.c.) 連續(xù)8 d，每天一次，對(duì)照組給予等量的生理鹽水用同樣方法處理。第9天起采用水迷宮實(shí)驗(yàn)，連續(xù)4 d檢測(cè)C57BL/6J小鼠空間學(xué)習(xí)記憶的改變，水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)束后，采用免疫組化和Western blot方法檢測(cè)小鼠腦內(nèi)NSF表達(dá)改變。結(jié)果每組選取小鼠24只進(jìn)行水迷宮測(cè)試，與對(duì)照組相比，MPTP處理組小鼠出現(xiàn)空間學(xué)習(xí)記憶障礙；每組選取小鼠5只進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，同時(shí)每組選取5只小鼠進(jìn)行Western blot檢測(cè)，海馬CA1區(qū)NSF免疫反應(yīng)活性明顯減弱(P<0.01)，前額葉皮層NSF的免疫反應(yīng)活性(P<0.01)和蛋白表達(dá)(P<0.05)都明顯增高。結(jié)論MPTP致空間學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠腦內(nèi)NSF表達(dá)出現(xiàn)異常，可能參與MPTP致空間學(xué)習(xí)記憶障礙的發(fā)病機(jī)制。

1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶；空間學(xué)習(xí)記憶；N-乙基馬來酰亞胺敏感融合蛋白

MPTP; spatial Learning memory; NSF

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是常見的中老年神經(jīng)變型性疾病，認(rèn)知障礙是常見的非運(yùn)動(dòng)癥狀[1]，包括空間學(xué)習(xí)記憶障礙，影響PD患者的生活質(zhì)量，但是其相關(guān)機(jī)制尚不清楚。

已有研究提示PD患者表現(xiàn)出工作記憶障礙，與其皮層相關(guān)神經(jīng)元通路的受損有關(guān)[2,3]。1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP)作為神經(jīng)毒物可作用于多巴胺能神經(jīng)元，進(jìn)而引起其變性，已經(jīng)廣泛用來制備PD模型。MPTP可引起人和猴的認(rèn)知功能障礙[4]，認(rèn)知功能障礙發(fā)生在運(yùn)動(dòng)癥狀之前[5]。我們前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)MPTP可引起小鼠空間學(xué)習(xí)記憶障礙[5,6]。但是MPTP致空間學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠腦內(nèi)N-乙基馬來酰亞胺敏感融合蛋白(N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein, NSF)表達(dá)是否有異常改變尚不清楚。

NSF是在1998年Block等首次純化得到。NSF已知在多種囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮重要作用[7]。NSF與學(xué)習(xí)記憶關(guān)系密切，NSF調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放和參與調(diào)解神經(jīng)突觸可塑性，通過突觸前和突觸后機(jī)制在學(xué)習(xí)記憶中起著重要的作用[8]。越來越多的研究提示NSF不僅參與調(diào)控生理?xiàng)l件下的學(xué)習(xí)記憶功能而且與病理狀態(tài)下引起的學(xué)習(xí)記憶障礙密切相關(guān)。已有報(bào)道NSF在不同的學(xué)習(xí)記憶障礙動(dòng)物模型的海馬有異常表達(dá)[9]。Morris 水迷宮用于檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)記憶能力。Morris水迷宮可檢測(cè)海馬、紋狀體、基底前腦和大腦皮層損傷的動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)記憶障礙[10]。本研究通過Morris 水迷宮篩選出MPTP引起的空間學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠，進(jìn)一步觀察并分析小鼠海馬和皮層區(qū)域NSF表達(dá)改變及其表達(dá)分布的變化特點(diǎn)，為進(jìn)一步揭示PD患者伴有認(rèn)知功能障礙的機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

MPTP購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，NSF抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司，β-actin 抗體購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。實(shí)驗(yàn)所用C57BL/6J小鼠，體重為18～22 g，雌雄各半，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。水迷宮實(shí)驗(yàn)裝置為DMS-2型水迷宮自動(dòng)記錄儀，是由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研制。水迷宮主要由直徑為120 cm和高50 cm的圓形水池構(gòu)成，圓形水池平均分為4個(gè)象限。在其中一個(gè)象限低于水面0.5 cm處放置直徑為12 cm和高為24 cm的透明有機(jī)玻璃站臺(tái)。

1.2 MPTP模型制備與分組

48只6～7周齡的C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和MPTP處理組，每組24只。MPTP處理組小鼠給予頸部皮下注射MPTP(20 mg/0.2 ml/(kg·d))，每天一次，連續(xù)注射8日，對(duì)照組同樣處理方法給予相同劑量的生理鹽水。第9天進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，每組選取小鼠24只進(jìn)行水迷宮測(cè)試，檢測(cè)C57BL/6J小鼠空間學(xué)習(xí)記憶的改變，水迷宮實(shí)驗(yàn)連續(xù)測(cè)試4 d，結(jié)束后每組選取小鼠5只進(jìn)行免疫組化檢測(cè)小鼠腦內(nèi)NSF免疫反應(yīng)活性改變，同時(shí)每組選取小鼠5只進(jìn)行Western blot檢測(cè)小鼠腦內(nèi)NSF蛋白表達(dá)改變。

1.3 Morris水迷宮測(cè)試

具體實(shí)驗(yàn)方法參見已發(fā)表論文[5]。在測(cè)試中，實(shí)驗(yàn)裝置周圍的參照物不變，實(shí)驗(yàn)水域中加入脫脂奶粉便于識(shí)別實(shí)驗(yàn)小鼠。將小鼠放在實(shí)驗(yàn)平臺(tái)上停留20 s，分別在每個(gè)象限，將實(shí)驗(yàn)小鼠面向水池壁的中點(diǎn)處放入水中，60 s內(nèi)如果小鼠找到平臺(tái)，就讓其停留20 s，如果小鼠沒找到平臺(tái)，就將其放在平臺(tái)上停留20 s，連續(xù)訓(xùn)練3 d。第4天將小鼠隨機(jī)從任意象限中點(diǎn)面壁入水，訓(xùn)練其尋找平臺(tái)。記錄4 d的尋找隱匿平臺(tái)潛伏期，評(píng)估其空間學(xué)習(xí)能力，第5天移除平臺(tái)，在第1象限放入小鼠，記錄小鼠在60 s內(nèi)在目標(biāo)象限和對(duì)側(cè)象限里的游泳時(shí)間占總游泳時(shí)間的百分比，用以評(píng)估小鼠空間記憶能力。

1.4 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)

采用4%水合氯醛 (400 mg/kg，i.p.) 將實(shí)驗(yàn)小鼠麻醉。分別用1%和4%的多聚甲醛進(jìn)行灌流，將腦組織取出于4%的多聚甲醛中加以固定，蔗糖梯度脫水后，冰凍切取冠狀腦片，厚度為50 μm，10 min×2的PBS漂洗，采用1%BSA進(jìn)行30 min孵育；加入NSF抗體(1∶500)和β-actin 抗體(1∶500)后在 4℃條件下進(jìn)行孵育過夜，10 min×2的PBS漂洗；分別與相應(yīng)的生物素化二抗 (1∶400) 在室溫下，進(jìn)行1 h的振蕩孵育，10 min×2的PBS漂洗；加入卵白素化生物素復(fù)合物A∶B∶PBS (1∶1∶400) 在室溫下，振蕩孵育2 h，采用二氨基聯(lián)苯胺(3,3’-diaminobenzidine，DAB)進(jìn)行顯色?？瞻讓?duì)照腦片的第一抗體用PBS加以代替。采用HPIAS系列彩色病理圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行定量計(jì)數(shù)NSF免疫反應(yīng)陽(yáng)性表達(dá)信號(hào)數(shù)量。各組選取5只小鼠、測(cè)量面積為3120.4 μm2(43.1 μm×72.4 μm)，計(jì)算選取的4個(gè)部位的計(jì)數(shù)平均值。根據(jù)Paxinos& Franklin (1997)小鼠腦圖譜選取腦區(qū)，如圖所示(圖3A)，所選方框腦區(qū)放大后為下列圖。標(biāo)尺為50 μm。前額葉皮層處的腦切片從Bregma 1.18 mm 開始連續(xù)切4片，海馬從Bregma 2.18 mm開始連續(xù)切4片。每組選5個(gè)樣本，統(tǒng)計(jì)分析前額葉皮層錐體細(xì)胞層和海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞層的NSF免疫反應(yīng)陽(yáng)性表達(dá)信號(hào)數(shù)量。

1.5 Western blot檢測(cè)小鼠腦內(nèi)NSF蛋白表達(dá)含量的變化

根據(jù)圖譜定位,選取小鼠額葉皮層腦區(qū)，每50～100 mg的小鼠腦組織加入1 ml Trizol進(jìn)行勻漿，加入0.2 ml的氯仿進(jìn)行搖勻，12 000 g×離心15 min；在有機(jī)相(大約0.8 ml)中加入1.5 ml異丙醇，在室溫下靜置10 min，在4℃條件下，12 000 g×離心10 min，棄上清后， 95%乙醇進(jìn)行洗滌沉淀20 min×3，每次在洗滌后，在4℃條件下，7 500 g×離心5 min。真空條件下，干燥10 min，用1%SDS進(jìn)行溶解沉淀(50℃，3 h)，在4℃條件下，進(jìn)行10 000 g×離心10 min，將上清移置新管，于-80℃條件下進(jìn)行保存。采用分光光度計(jì)于595 nm下，進(jìn)行蛋白含量的測(cè)定，SDS-PAGE，之后轉(zhuǎn)膜、染色和脫色，采用凝膠分析系統(tǒng)(上海天能公司生產(chǎn))進(jìn)行定量分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理NSF表達(dá)產(chǎn)物與內(nèi)參的比值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 水迷宮實(shí)驗(yàn)

MPTP處理8 d后，進(jìn)行4 d的Morris水迷宮測(cè)試，測(cè)定其第1～4天尋找隱匿平臺(tái)潛伏期。與對(duì)照組相比，MPTP組小鼠尋找隱匿平臺(tái)潛伏期較對(duì)照組明顯延長(zhǎng)(P<0.01)。MPTP小鼠空間學(xué)習(xí)能力明顯下降(圖1)。

與對(duì)照組相比，MPTP組小鼠在第5天，于目標(biāo)象限游泳的時(shí)間占總時(shí)間的百分比明顯降低，在對(duì)側(cè)象限游泳的時(shí)間占總時(shí)間百分比明顯增高(P<0.01, 圖2)。MPTP小鼠的空間記憶能力明顯下降。

Fig.1The escape latency of C57BL/6 mice in the spatial learning MPTP: 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine**P<0.01vscontrol(n=24)

Fig.2Measurement of spatial learning and memory ability in C57BL/6J mice(n=24)**P<0.01vscontrol

2.2 免疫組織化學(xué)結(jié)果

與對(duì)照組相比，MPTP組小鼠海馬CA1區(qū)NSF免疫反應(yīng)陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)明顯減弱(圖3A，1，2)，單位面積免疫反應(yīng)陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)數(shù)量明顯降低(P<0.01，圖3B)；在前額葉皮層(prefrontal cortex，PFc)的NSF免疫反應(yīng)陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)明顯增強(qiáng)(圖3A，4)，單位面積免疫反應(yīng)陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)數(shù)量明顯增多(P<0.01，圖3B)。

2.3 Western blot結(jié)果

與對(duì)照組相比，MPTP組C57BL/6J小鼠在前額葉皮層(PFc)的NSF蛋白表達(dá)明顯增多(P<0.01, 圖4)。

3 討論

認(rèn)知功能障礙是帕金森病患者的非運(yùn)動(dòng)癥狀，隨著其發(fā)生率的增高，對(duì)PD伴有的學(xué)習(xí)記憶障礙的相關(guān)研究逐步深入。Leplow B等發(fā)現(xiàn)PD早期的患者已經(jīng)出現(xiàn)降低的學(xué)習(xí)記憶[11]。我們前期研究已經(jīng)表明連續(xù)8 d給予MPTP(20 mg/0.2 ml/(kg·d))可引起C57BL/6J小鼠出現(xiàn)空間學(xué)習(xí)記憶障礙[5,6]。與我們的研究報(bào)道相似的還有李學(xué)坤等曾報(bào)道給予2次MPTP (4.0 mg/kg，s.c.)，可引起 C57BL/6J小鼠出現(xiàn)空間學(xué)習(xí)記憶障礙[12]。MPTP作為神經(jīng)毒物，可選擇性引起多巴胺能神經(jīng)元的變性，用于制備PD模型。我們前期研究已發(fā)現(xiàn)早期PD鼠腦內(nèi)出現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞激活[13]，凋亡因子的表達(dá)增加[14]，腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子降低[15]和強(qiáng)啡肽表達(dá)出現(xiàn)異常[16]。但是MPTP致空間學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠腦內(nèi)NSF表達(dá)是否有異常改變尚不清楚。

Fig.3The results of NSF immnunoreactivity-positive signals in hippocampal CA1 and prefrontal cortex (scale bar=50 μm) A: 1 and 3 represented the control mice, 2 and 4 represented MPTP treated mice; B: The statistical results of NSF immnunoreactivity-positive signals in hippocampal CA1 and prefrontal cortex(n=5); MPTP: 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine; PFC: Prefrontal cortex; CA1: Hippocampus area**P<0.01vscontrol

Fig.4The changes of NSF protein expression in prefrontal cortex A: 1 represented the control mice, 2 represented MPTP treated mice； B: The statistical results of NSF protein expression in prefrontal cortex(n=5)； NSF: N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein**P<0.01vscontrol

NSF是在神經(jīng)遞質(zhì)釋放過程中，參與突觸囊泡和突觸前膜融合過程的一種ATP酶，可調(diào)節(jié)不同類型細(xì)胞分泌過程及囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)，并參與神經(jīng)遞質(zhì)釋放過程中突觸囊泡和突觸前膜的融合[17]。采用NSF抑制劑N-ethylmaleimide(NEM)處理神經(jīng)元后，能夠阻斷誘導(dǎo)與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(long-term potentiation, LTP)[18]。在海馬切片水平的研究表明，NEM能夠明顯增強(qiáng)CA1區(qū)的錐體神經(jīng)元的抑制性突觸電流的頻率[19]。這些研究均提示NSF參與維持正常學(xué)習(xí)記憶的功能。但是MPTP引起的空間學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠腦內(nèi)NSF表達(dá)改變及其表達(dá)分布的變化特點(diǎn)尚不清楚。

我們的研究發(fā)現(xiàn)MPTP小鼠出現(xiàn)空間學(xué)習(xí)記憶障礙，在海馬CA1區(qū)的NSF免疫反應(yīng)陽(yáng)性表達(dá)信號(hào)的免疫反應(yīng)活性減弱，CA1區(qū)是海馬三級(jí)突觸的主要組成部分。CA1區(qū)錐體細(xì)胞通過Schaffer 側(cè)支通路產(chǎn)生的LTP參與學(xué)習(xí)記憶，而且在CA1區(qū)的神經(jīng)遞質(zhì)也參與學(xué)習(xí)記憶的調(diào)控機(jī)制。海馬CA1區(qū)參與海馬依賴的空間學(xué)習(xí)過程。我們發(fā)現(xiàn)MPTP致學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠海馬CA1處NSF表達(dá)減少很可能是引起學(xué)習(xí)記憶障礙的原因之一。有趣的是，我們還發(fā)現(xiàn)MPTP致學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠前額葉皮層的NSF免疫反應(yīng)活性和NSF蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)。PD患者的額葉功能損害最為常見[20]，已有研究證實(shí)PD伴有的認(rèn)知功能障礙與皮質(zhì)-皮質(zhì)下多巴胺環(huán)路的破壞有關(guān)[21]。MPTP致學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠前額葉皮層的NSF表達(dá)的增加有可能是MPTP造成損傷后的代償機(jī)制。我們研究提示CA1區(qū)和前額葉皮層的NSF異常表達(dá)可能與PD小鼠空間學(xué)習(xí)記憶障礙的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。進(jìn)一步論證仍需采用以NSF基因?yàn)榘悬c(diǎn)的轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行深入研究。

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R282.74

A

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2016-12-23

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