楊 輝， 閆曉哲， 蒲鵬飛， 蘇 文， 杜嬌嬌， 彭任芳

(陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安 710021)

蘋果渣浸提液乳酸發(fā)酵劑的研究

楊 輝， 閆曉哲， 蒲鵬飛， 蘇 文， 杜嬌嬌， 彭任芳

(陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安 710021)

蘋果渣綜合利用是蘋果產(chǎn)業(yè)發(fā)展的技術瓶頸之一，為了探索蘋果渣高值利用的新途徑，本文以水為溶劑制取蘋果渣浸提液，接種不同組成及比例的混合乳酸菌，通過考察混合乳酸菌發(fā)酵液中乳酸菌量、產(chǎn)酸耗糖量等指標變化，確立理想的乳酸發(fā)酵劑組成.研究結果表明嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌、雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌，按2∶1∶2∶3∶4比例配比，接種量4 mL/100 mL，初始pH=6.3時發(fā)酵36 h，發(fā)酵液中活菌數(shù)達到12.35×108CFU/mL，產(chǎn)酸量達到14.45 g/L，耗糖量29.37 g/L，為蘋果渣乳酸發(fā)酵的高值利用及蘋果渣乳酸發(fā)酵粉的制備提供試驗基礎.

菌種； 菌種比例； 乳酸菌； 果渣浸提液

Abstract:Pomace utilization is one of the technical bottlenecks in development of apple industry.In order to explore the new way of high utilization of apple pomace,in this paper the pomace was used to prepare extract liquid using water as the solvent,then the extract was inoculated with different compositions and proportions of mixed lactic acid bacteria.The ideal component of the lactic acid starter and its optimal fermentation conditions were determined by selecting the lactic acid bacteria,measuring the total bacteria count in fermented broth,detecting the consumption of sugar.The results showed thatLactobacillusacidophilus,Lactobacillusrhamnosus,Lactobacillusplantarum,BifidobacteriumthermophilusandStreptococcusthermophiluswere mixed in the proportion of 2∶1∶2∶3∶4,inoculation amount 4 mL/100 mL,fermented for 36 h,at a natural pH 6.3，the number of viable cells in the fermented mash reached 12.35×108CFU/mL and the acid yield reached 14.45 g/L.The sugar consumption was 29.37 g/L.The obtained results can provide technology support to utilize pomace efficiently and prepare lactic acid bacteria powder for pomace fermentation.

Keywords:culture; bacterial proportion; lactic acid bacteria; pomace extract

0 引言

蘋果是我國盛產(chǎn)水果之一，栽種面積大，產(chǎn)量高，20%用于深加工，且加工量的90%用于蘋果濃縮汁的生產(chǎn)，副產(chǎn)物果渣產(chǎn)量每年達24～26萬t[1]，其中70%果渣被廢棄.蘋果渣中含有可溶性糖、粗纖維、果膠、酚酸等物質[2]，其中可溶性糖、粗纖維、果膠的含量分別占干重的9.5%～22.6%、10.5%、1.5%～4%[3]，其含有的生物活性物質具有抗氧化性、降低膽固醇和減肥的作用，具有很大的開發(fā)價值.

乳酸菌(Lactic acid bacteria)是指發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生50%以上乳酸的一類細菌總稱[4]，其中雙歧桿菌是人類腸道中有益菌群的代表之一[5]，它們可以在人體腸道中生長繁殖，并通過抑制病原體生長[6]，維持腸道有益菌群的平衡，來保持人體健康[7,8].

近年來，有關乳酸菌和雙歧桿菌的醫(yī)療保健作用及其機理研究不斷深入，其相應的保健食品陸續(xù)問世，并且市場份額越來越大.趙鑫等[9]研究了不同比例的嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌對酸奶品質的影響發(fā)現(xiàn)，當改變乳酸菌的比例可以調節(jié)酸奶的風味和貨架期.盧兆蕓等[10]利用保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌通過乳酸新型發(fā)酵工藝發(fā)酵紫紅薯酸牛奶，其產(chǎn)品風味芳香、營養(yǎng)豐富、口感好.張明等[11]研究了以葡萄糖為碳源的鼠李糖乳桿菌飲料發(fā)酵工藝，并制備了活菌數(shù)為8.5×108CFU/mL，沉淀率為1.1 %的乳酸飲料.汪立平等[12]利用4種植物乳桿菌為菌種，制得發(fā)酵蘿卜泡菜的發(fā)酵劑.安興娟等[13]優(yōu)化了植物乳桿菌發(fā)酵枸杞和紅蘿卜混合汁的工藝，并得到了色澤均勻、口感酸爽柔和的果味飲品.

在上述眾多的研究和乳酸產(chǎn)品的生產(chǎn)中，乳酸菌的品質及獲取無疑是重要的，基于此，結合蘋果渣綜合利用的緊迫需求，本文提出以水為溶劑浸提蘋果渣的營養(yǎng)物質，以此進行混合乳酸發(fā)酵.本實驗首先從收集到的菌中篩選出五種乳酸菌和一株雙歧桿菌進行不同的組合，然后對其發(fā)酵過程進行研究，確定適于果渣浸提液乳酸發(fā)酵的菌種組合和配比，為果渣乳酸發(fā)酵菌粉的制備提供技術支撐.

1 材料與方法

1.1 主要材料

旬邑紅富士蘋果，成熟度好、無蟲害、無機械損傷，市售；碳酸鈉，分析純，天津市紅巖化學試劑廠；檸檬酸，分析純，湖南湘中化學試劑開發(fā)中心；葡萄糖，分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；次甲基藍，分析純，天津市恒興化學試劑有限公司；酒石酸鉀鈉、硫酸銅，分析純，天津市天力化學試劑有限公司.

1.2 菌種

嗜酸乳桿菌(L9)、保加利亞乳桿菌(L10)、鼠李糖乳桿菌(L20)、植物乳桿菌(L60)、雙歧桿菌(BB28)、嗜熱鏈球菌(L70) ，由陜西科技大學1C419實驗室提供.

1.3 培養(yǎng)基

MRS瓊脂培養(yǎng)基、MRS肉湯，生化試劑，北京陸橋技術股份有限公司；M17培養(yǎng)基，生化試劑，青島高科園海博生物技術有限公司.

(1)MRS瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨 10.0 g/L、牛肉粉 5.0 g/L、酵母粉 4.0 g/L、葡萄糖 20.0 g/L、吐溫80 1 mL/L、磷酸氫二鉀 2.0 g/L、乙酸鈉 5.0 g/L、檸檬酸三銨 2.0 g/L、硫酸鎂 0.2 g/L、硫酸錳 0.05 g/L、瓊脂15.0 g/L；

(2)MRS肉湯: 蛋白胨 10.0 g/L、牛肉粉 10.0 g/L、酵母粉 5.0 g/L、葡萄糖 20.0 g/L、硫酸鎂 0.1 g/L、醋酸鈉 5.0 g/L、檸檬酸銨 2.0 g/L、磷酸氫二鉀2.0 g/L、硫酸錳 0.05 g/L、吐溫80 1 mL/L；

(3)M17培養(yǎng)基：大豆胨 5.0 g/L、蛋白胨2.5 g/L、酪蛋白胨 2.5 g/L、酵母浸粉2.5 g/L、牛肉粉5.0 g/L、乳糖 5.0 g/L、抗壞血酸0.5 g/L、β-甘油磷酸鈉19.0 g/L、硫酸鎂0.25 g/L.

1.4 儀器

恒溫培養(yǎng)箱，山東濰坊醫(yī)療器械廠；電子分析天平，賽多利斯(北京)科技有限公司；pHS-4C+酸度計，成都市方舟科技開發(fā)公司；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司；超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；榨汁機，廣東美的精品電器制造有限公司；YX-24LDJ型滅菌鍋，江陰濱江醫(yī)療設備有限公司.

1.5 實驗方法

將新鮮蘋果分切四塊，置于榨汁機中制取果渣.取新鮮果渣40 g和新鮮切塊的蘋果30 g混合打漿，加入0.1%VC溶液護色，按料液比7∶3(W∶V)加入30 mL蒸餾水進行浸提，90 ℃～92 ℃滅菌20 min，待冷卻后添加0.6 g/L的果膠酶，50 ℃下酶解4 h，過濾得到澄清浸提液.取蘋果渣水提取液100 mL，按設計接入4 mL活菌數(shù)在108CFU/mL的乳酸菌培養(yǎng)液，于pH 6.3、溫度37 ℃～39 ℃條件下發(fā)酵約36 h.然后，對發(fā)酵液進行乳酸菌計數(shù)，菌液分離后，測定總滴定酸、耗糖量，以發(fā)酵液中活菌數(shù)為主要指標，殘?zhí)呛涂偹釣閰⒖贾笜?，篩選菌種或菌種組合.

1.5.1 單因素試驗

(1)單一菌種發(fā)酵

分別利用L9、L10、L20、L60、BB28、L70進行發(fā)酵，選取一種較優(yōu)菌種.

(2)兩組合菌種發(fā)酵

兩種菌種接種量比例為1∶1，根據(jù)表1中的組合方式分別進行發(fā)酵，選一較優(yōu)菌種組合.

表1 兩種菌種組合表

(3)三組合菌種發(fā)酵

三菌種接種量比例為1∶1∶1，根據(jù)表2中的組合方式分別進行發(fā)酵，選一較優(yōu)菌種組合.

表2 三種菌種組合表

(4)四組合菌種發(fā)酵

四菌種接種量比例為1∶1∶1∶1，根據(jù)表3中的組合方式分別進行發(fā)酵，選一較優(yōu)菌種組合.

表3 四種菌種組合表

(5)五組合菌種發(fā)酵

五菌種接種量比例為1∶1∶1∶1∶1，根據(jù)表4中的組合方式分別進行發(fā)酵，選一較優(yōu)菌種組合.

表4 五種菌組合表

(6)菌株組合的選取

將以上5組單因素中選出的菌株組合與六種菌株組合接種發(fā)酵.以發(fā)酵液中活菌數(shù)為主要指標，總酸和耗糖為參考指標，選取較佳菌株組合.

1.5.2 菌株配比的選擇

根據(jù)選出較優(yōu)組合L9 L20 L60 BB28 L70，保證接種量4%不變，對于每個菌株設置4個梯度分別進行實驗.具體組合安排見表5.以發(fā)酵液中活菌數(shù)為主要指標，總酸和耗糖為參考指標，選取較佳菌株配比.依據(jù)此五種菌比例進行發(fā)酵，考察最適菌組合產(chǎn)酸和耗糖性能.

表5 接種量配比

1.5.3 分析方法

總酸的測定按國標GB/T12456-2008方法測定；總糖的測定按國標GB/T15038-2006方法測定；發(fā)酵液中活菌數(shù)按國標GB 4789.3-2016方法測定.

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel、Spss軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理，利用Origin進行畫圖.

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果分析

本試驗選擇的菌種L9、L10、L20、L60、BB28、L70它們能夠利用一些寡糖和葡萄糖等單糖作為主要的碳源生產(chǎn)乳酸，且被廣泛研究和應用，因果渣中以葡萄糖、果糖等單糖為主，故它們適于蘋果渣發(fā)酵，同時它們之間存在著數(shù)量上的平衡，功能上的協(xié)調，營養(yǎng)上的互補等[14]，這些是維護腸道菌群平衡、代謝健康的前提和基礎，基于此本文對單一乳酸菌發(fā)酵、混合菌發(fā)酵條件進行研究，并且探索它們之間的比例關系，確定蘋果渣乳酸發(fā)酵劑的組成.

2.1.1 單一菌種發(fā)酵

六株菌種單獨發(fā)酵，結果如圖1所示.圖1結果表明L20為較優(yōu)發(fā)酵菌種.所選菌種L9可以利用一些蛋白質的水解產(chǎn)物和一些單糖和寡糖進行同型發(fā)酵[15]，但果渣浸提液中缺少生長刺激物，在發(fā)酵時產(chǎn)酸速度慢，生長緩慢.對于L10，當發(fā)酵液pH值在3.5左右時， 細胞內外pH梯度差減少，新陳代謝活動開始受到抑制[16,17]導致發(fā)酵滯后，因此，L10在發(fā)酵液中菌量較少.BB28是嚴格厭氧的異型發(fā)酵菌，在發(fā)酵過程中，浸提液內殘留的氧氣影響丙酮酸酶活性，導致丙酮酸積累進而影響其生長[18]，發(fā)酵液中活菌數(shù)最低.而果渣浸提液中缺乏L70所需氨基酸、肽類、維生素之類的生長輔助因子[19]，使其生長條件受到限制，發(fā)育不良，因此發(fā)酵情況也不好.相比之下，L20是從健康人體腸道中分離出的一種益生菌[20]，具有良好的耐酸能力[21]，對于不良環(huán)境的適應能力優(yōu)于其他乳酸菌和一些益生菌[22]所以生長旺盛，發(fā)酵水平較高；L60有較強的發(fā)酵碳水化合物的能力[23]但發(fā)酵能力不及L20.綜上所述，選擇L20為較優(yōu)發(fā)酵菌種.

圖1 單一菌株發(fā)酵結果

2.1.2 兩組合菌種發(fā)酵

兩組合菌種發(fā)酵，其結果如圖2所示.根據(jù)圖2描述各組合發(fā)酵結束時活菌數(shù)可知，組合6(L10L20)活菌數(shù)含量較高.L20的主產(chǎn)物是乳酸而且具有良好的耐酸機制，能夠適應高酸環(huán)境，持續(xù)發(fā)酵.L10是一種常用的發(fā)酵菌種[24]， 其本身能夠代謝產(chǎn)生多種氨基酸從而促進L20的代謝過程，并且本身耐酸，發(fā)酵后期仍能生長發(fā)育.

圖2 兩組合菌種發(fā)酵結果

2.1.3 三組合菌種發(fā)酵

三組合菌種發(fā)酵，其結果如圖3所示.圖3結果表明，組合6(L9 L20 BB28)比較適合蘋果渣發(fā)酵.在BB28代謝過程中少量氧氣存在都會產(chǎn)生丙酮酸的積累，同時，L9和L20是通過EMP途徑進行糖酵解的，丙酮酸是其中間代謝產(chǎn)物[18]，有利于EMP途徑的進行.L9和BB28有很強的耐酸性和抑菌能力，有利于后續(xù)發(fā)酵[18].張香美等[25]通過研究雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌促進嗜酸乳桿菌生長增殖，嗜酸乳桿菌對雙歧桿菌無明顯的促進或抑制作用，兩菌在混合培養(yǎng)體系中有良好的微生態(tài)關系.L20的終端產(chǎn)物是乳酸，對于L9的生長有明顯的促進作用，同時L9分解蛋白質產(chǎn)生游離氨基酸可以促進L20和BB28的生長.

圖3 三組合菌種發(fā)酵結果

2.1.4 四組合菌種發(fā)酵

四組合菌種發(fā)酵，其結果如圖4所示.圖4表明組合5(L9 L20 L60 L70)為較佳發(fā)酵菌種組合.組合5中L9代謝可以產(chǎn)生賴氨酸、精氨酸、纈氨酸等游離氨基酸，這些游離氨基酸能夠促進L20 L60 L70的生長和繁殖[26,27]，L70代謝產(chǎn)生的甲酸和CO2能夠促進L9的生長，L20產(chǎn)生的乳酸也能夠促進L9的生長繁殖.相比于乳制品，果渣浸提液中營養(yǎng)匱乏，L20適應惡劣環(huán)境能力較強[21]，能夠在果渣浸提液中生長繁殖.L60發(fā)酵碳水化合物的能力較強[23]，同時在L60發(fā)酵體系中有氨基態(tài)氮含量較高能夠促進L9 L20 L70的生長.所以組合5發(fā)酵能力較佳.

圖4 四組合菌種發(fā)酵結果

2.1.5 五組合菌種發(fā)酵

五組合菌種發(fā)酵，其結果如圖5所示.由圖5可知，菌種組合2(L9 L20 L60 BB28 L70)比較適合蘋果渣浸提液發(fā)酵.組合2中L9發(fā)酵產(chǎn)生的纈氨酸、精氨酸、賴氨酸等氨基酸能夠促進乳桿菌和BB28的生長，同時L70產(chǎn)生的甲酸和CO2能夠促進L9的繁殖代謝，它們有一定的促進作用[25,26].BB28與L70之間也存在協(xié)同效應[27]，同時由于微量氧氣的存在BB28發(fā)酵體系中丙酮酸積累[18]，將促進其他幾種乳酸菌代謝.L20對于環(huán)境的適應較強[21]，而且L60對于普通碳水化合物的發(fā)酵能力較強[23]體系中氨基態(tài)氮含量增加，為L20和BB28后期的發(fā)酵創(chuàng)造條件，所以組合2能夠充分發(fā)揮各組合菌的代謝優(yōu)勢.

圖5 五組合菌種發(fā)酵結果

2.2 較佳菌種配比的選擇

利用較佳菌種組合與六種菌種全部進行對比試驗如圖6所示.

圖6 較佳組合乳酸菌與其他 組合菌組發(fā)酵結果比較

圖6中組合5(五種菌株組合)是上述研究的最適組合，相比四種菌株組合多了BB28菌，由于發(fā)酵前期微量的氧氣存在，使BB28在發(fā)酵過程中大量積累丙酮酸，而丙酮酸是EMP途徑中重要的中間代謝產(chǎn)物，對于菌體的繁殖代謝至關重要，所以最適五菌組合發(fā)酵效果較佳.在六菌組合中，雖然保加利亞乳桿菌與其他菌種存在共生關系，可能因為在保持接種量4 mL/100 mL不變時，各菌種接種量減少，其代謝產(chǎn)物減少，前三組合有很好促進作用但是相比于第四組和第五組合促進關系不明顯，故選擇組合L9 L20 L60 BB28 L70.

2.3 混合菌種接種量配比選取

2.3.1 各組成菌比例選擇

不同接種比例發(fā)酵，其結果如圖7所示.由圖7(a)可以看出組合3、5發(fā)酵效果較好且接近，由圖7(b)可以看出組合5耗糖量優(yōu)于組合3，故可知當組合為L9L20L60BB28L70五種菌配比比例為組合5(2∶1∶2∶3∶4)較好.接種比例最大的是L70，L70的產(chǎn)物乳酸、甲酸、CO2能夠不同程度刺激L9的生長發(fā)育.其次是BB28，在發(fā)酵前期，由于氧氣的存在使丙酮酸大量積累，為其他菌株生長代謝提供中間產(chǎn)物.L9和L60都可以產(chǎn)生氨基酸，共同促進L20產(chǎn)酸，L20產(chǎn)酸又來促進L9的代謝發(fā)育，同時L20和L9都有耐酸性，為后期持續(xù)發(fā)酵創(chuàng)造條件.

(a)發(fā)酵活菌數(shù)

(b)發(fā)酵結束時耗糖圖7 不同接種比例發(fā)酵結果

2.3.2 最適組合乳酸菌劑產(chǎn)酸和耗糖性能檢驗

乳酸菌的產(chǎn)酸量和耗糖量是乳酸發(fā)酵劑的重要性能.2.3.1的研究中以發(fā)酵液中乳酸菌數(shù)作為考量指標選出了五菌種組合的比例，沒有考察該組合菌的產(chǎn)酸量和耗糖指標，驗證試驗對此進行了考察，結果如圖8所示.

圖8結果表明， 最適菌種組合為L9 L20 L60 BB28 L70，在接種量4%，各菌種添加比例為2∶1∶2∶3∶4時進行發(fā)酵，發(fā)酵劑具有良好的菌增殖效果，同時具有較好的產(chǎn)酸能力和耗糖量，發(fā)酵液中活菌數(shù)可達到12.35×108CFU/mL，乳酸量14.45 g/L，耗糖量29.37 g/L.

圖8 最適五菌組合乳酸發(fā)酵劑 產(chǎn)酸和耗糖性能

3 結論

(1)以蘋果渣水浸提液為發(fā)酵培養(yǎng)基，5種乳酸菌-嗜酸乳桿菌(L9)、鼠李糖乳桿菌(L20)、植物乳桿菌(L60)、雙歧桿菌(BB28)、嗜熱鏈球菌(L70)的混合發(fā)酵優(yōu)于單一菌種或其他混合菌的乳酸發(fā)酵.

(2)混合菌組配比例是影響乳酸發(fā)酵的重要因素，當上述五種菌接種比例為2∶1∶2∶3∶4時有良好的發(fā)酵效果，其中上清液中活菌數(shù)可達到12.35×108CFU/mL，乳酸量可以達到14.45 g/L，耗糖量29.37 g/L，說明此發(fā)酵組合能夠充分利用蘋果渣培養(yǎng)基中的糖分，并能較好的將其轉化為乳酸，有利于乳酸菌的增殖.

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【責任編輯：蔣亞儒】

Studyonlacticacidstarterofapplepomaceextractfermentation

YANG Hui, YAN Xiao-zhe, PU Peng-fei, SU Wen, DU Jiao-jiao, PENG Ren-fang

(School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China)

2017-08-19

陜西省科技廳技術轉移與科技成果推廣引導計劃項目(2017CG-003)

楊 輝(1960-)，男，陜西西安人，教授，博士生導師，研究方向：生物材料和發(fā)酵工程

2096-398X(2017)05-0139-06

TS255.2

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