焦 強(qiáng),王艷艷,李華妮，葛文靜

(1.河南省口岸食品檢驗(yàn)檢測所，河南 鄭州 450003； 2.河南省中醫(yī)藥研究院，河南 鄭州 450004)

·藥學(xué)研究·

懷山藥中甲基硫菌靈及其代謝物多菌靈殘留測定及安全性評價*

焦 強(qiáng)1,王艷艷2,李華妮2，葛文靜2

(1.河南省口岸食品檢驗(yàn)檢測所，河南 鄭州 450003； 2.河南省中醫(yī)藥研究院，河南 鄭州 450004)

目的：研究了甲基硫菌靈及其代謝物多菌靈在懷山藥根莖的消解動態(tài)和最終殘留。方法：采用HPLC法, Luna C18色譜柱，流動相為甲醇-四氫呋喃-水(43∶2∶55), 檢測波長267 nm(甲基硫菌靈)、277 nm(多菌靈)。對山藥根莖中的多菌靈殘留量進(jìn)行檢測，對其數(shù)據(jù)用DAS 2.0軟件按照非房室模型統(tǒng)計矩參數(shù)分析。結(jié)果：多菌靈在1.222～122.200 ng時,r=1.000 0,呈良好的線性關(guān)系；甲基硫菌靈在0.786～78.600 ng時,r=0.999 7,呈良好的線性關(guān)系。山藥中甲基硫菌靈的添加回收率在82.5%～84.9%之間，RSD 2.91%～7.64%；山藥中多菌靈的添加回收率在88.3%～92.8%之間，RSD 3.02%～7.90%。施藥后，甲基硫菌靈在山藥中未檢出，其轉(zhuǎn)化為多菌靈，并在植物中消解代謝。甲基硫菌靈施用量為11.25 kg/hm2時，多菌靈的半衰期為10.20 d，Tmax 2.0 d，Cmax 0.72 μg/g；甲基硫菌靈施用量為22.50 kg/hm2時，多菌靈的半衰期為7.81 d，Tmax 2.0 d，Cmax 0.58 μg/g；甲基硫菌靈施用量為45.00 kg/hm2時，多菌靈的半衰期7.57d, Tmax 1.7d，Cmax 0.44 μg/g。 甲基硫菌靈及其代謝物多菌靈在山藥根莖中最終殘留量均低于0.02 μg/g。 結(jié)論:山藥根莖中甲基硫菌靈及代謝物多菌靈動態(tài)消解，并在30 d內(nèi)全部消解。

懷山藥；甲基硫菌靈/測定；多菌靈/測定；殘留；高效液相色譜

山藥為薯蕷科植物薯蕷DioscoreaoppositaThunb.的干燥根莖。懷山藥是山藥的道地藥材，其多糖等含量高于非道地山藥 ,比普通淮山藥的營養(yǎng)與藥用價值高。炭疽病(anthracnose)是懷山藥的主要病害之一，主要危害山藥的莖、葉，也可危害葉柄和零余子，嚴(yán)重時可造成葉片枯死、脫落，甚至整株死亡，以致絕產(chǎn)。甲基硫菌靈是一種廣譜性內(nèi)吸性低毒殺菌劑，對山藥炭疽病前期、中期均有良好效果，懷山藥道地藥材區(qū)普遍施用甲基硫菌靈農(nóng)藥[1-3]。甲基硫菌靈不穩(wěn)定，在通過山藥的葉、莖吸收后，代謝為多菌靈，并緩慢消解。筆者通過對種植的懷山藥噴灑甲基硫菌靈研究甲基硫菌靈和多菌靈的殘留的變化，為甲基硫菌靈在懷山藥生產(chǎn)中的安全性評價提供參考依據(jù)[4]。

1 藥品、試劑與儀器

甲基硫菌靈標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥99.2%，由國家農(nóng)藥質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心提供，批號20081228；多菌靈標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥99.2%，由國家農(nóng)藥質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心提供，批號20081229。甲醇，為色譜純，德國Merck公司產(chǎn)品，批號603-001-X；水為高純水；其他試劑均為分析純。Waters 2695-996型高效液相色譜儀，美國Waters公司產(chǎn)品。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品種植、施藥與采摘

供試山藥采用傳統(tǒng)種植的壚土鐵棍山藥。實(shí)驗(yàn)地設(shè)在溫縣岳村鄉(xiāng)韓郭作村山藥規(guī)范化種植試驗(yàn)田。地塊為新茬地，660 m2，每小區(qū)15 m2，3次重復(fù)，共28個小區(qū)(含清水對照)，隨機(jī)排列，小區(qū)間設(shè)保護(hù)行距。山藥為兩年生，按種植計劃在霜降前后采收。根據(jù)推薦劑量設(shè)計此次施藥的甲基硫菌靈質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2,4,8 g/L,即施用量分別為11.25，22.50，45.00 kg/hm2，3個施藥水平設(shè)3個重復(fù)小區(qū)，面積3 m×10 m，保護(hù)行距2 m。并設(shè)一個空白對照小區(qū)，面積30 m2。計劃在7月底8月初噴藥，之后按照如下采收間隔進(jìn)行：0(施藥后藥液基本風(fēng)干的2 h內(nèi))，1，2，3，5，7，14，21，30 d，一共9次。按“S”法采集樣品，所采樣品為全株，采樣后立刻包裝好，于低溫冰箱中保存?zhèn)溆肹5]。

2.2 樣品處理

稱取樣品30.00 g放入勻漿機(jī)中，加入丙酮100 mL勻漿，用丙酮洗滌勻漿機(jī)；勻漿液合并洗液，移至250 mL錐形瓶中；超聲處理30 min，濾過；濾渣用丙酮超聲處理2次，每次40 mL，超聲處理15 min，濾過；濾液合并，用真空旋轉(zhuǎn)濃縮器35℃濃縮至近干，以2.0 mL甲醇∶二氯甲烷(3∶97)溶解殘渣，待凈化。取PSA固相萃取小柱，用5.0 mL甲醇∶二氯甲烷(3∶97)淋洗小柱，棄去淋洗液；當(dāng)溶劑液面達(dá)到小柱吸附層表面時，立即將上述提取液加入柱中，用甲醇∶二氯甲烷(3∶97)10 mL洗脫；收集洗脫液到10 mL離心管中；將離心管置氮吹儀上，水浴35 ℃，用氮?dú)獯抵两?；殘渣甲醇溶解定容? mL，過0.22 μm 濾膜，待測[6]。

2.3 色譜條件

色譜柱為Luna C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇-四氫呋喃-水(43∶2∶55)；流速1.0 mL/min；甲基硫菌靈的檢測波長為267 nm，多菌靈的檢測波長為277 nm；甲基硫菌靈的保留時間為9.09 min，多菌靈的保留時間為6.35 min；柱溫30 ℃[7]。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線與儀器檢出限

精密稱取甲基硫菌靈7.86 mg，用甲醇稀釋成78.6 mg/L；另精密稱取多菌靈12.22 mg，用甲醇稀釋成122.2 mg/L，分別進(jìn)樣1，5，10，25，100μL測定。結(jié)果：甲基硫菌靈在0.786～78.6 ng內(nèi)有良好線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Y=12 231X+121.7，r=0.999 7，檢出限0.422 ng,方法的最小檢出質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.33 ng/g。多菌靈在1.222～122.2 ng內(nèi)有良好線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Y=18 937X-413.4，r=1.000 0 ，檢測限0.561 ng，方法的最小檢出質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.83 ng/g。見圖1。

A.甲基硫菌；B.多菌靈；C.樣品圖1 甲基硫菌靈、多菌靈、樣品色譜圖

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取甲基硫菌靈和多菌靈對照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，測定峰面積。結(jié)果：甲基硫菌靈RSD為0.06%，多菌靈RSD為0.04%。結(jié)果表明：儀器進(jìn)樣精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取新制備的供試溶液，在0,2,4,8,16,24 h分別進(jìn)樣10 μL，測定峰面積。結(jié)果：甲基硫菌靈的RSD為1.88%，多菌靈RSD為0.31%。結(jié)果表明：供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品6份，照2.2項(xiàng)下方法制備供試液，進(jìn)行測定。結(jié)果：甲基硫菌靈RSD為3.75%，多菌靈RSD為2.38%。結(jié)果表明：重復(fù)性良好。

2.8 回收率試驗(yàn)

精密稱取未噴灑農(nóng)藥的山藥樣品15份，每批5份，分為3批，分別加入一定量(3個梯度濃度)的甲基硫菌靈和多菌靈對照品溶液，照2.2項(xiàng)下方法制備供試液，進(jìn)行測定，結(jié)果見表1。

表1 甲基硫菌靈和多菌靈在山藥中的回收率

2.9 多菌靈與甲基硫菌靈殘留測定結(jié)果

山藥根莖部分未檢出甲基硫菌靈，檢出多菌靈，其數(shù)據(jù)采用DAS 2.0軟件按照非房室模型統(tǒng)計矩參數(shù)分析。結(jié)果：甲基硫菌靈施用量為11.25 kg/hm2時，多菌靈的半衰期為10.20 d，Tmax 2.0 d，Cmax 0.72 μg/g；甲基硫菌靈施用量為22.50 kg/hm2時，多菌靈的半衰期為7.81 d，Tmax 2.0 d，Cmax 0.58 μg/g；施用量甲基硫菌靈施用量為45.00 kg/hm2時，多菌靈的半衰期7.57d, Tmax 1.7d，Cmax 0.44 μg/g。 最終殘留試驗(yàn)結(jié)果顯示，甲基硫菌靈及代謝物多菌靈在山藥根莖中最終殘留量均低于0.02 μg/g。 見表2、圖2。

表2 多菌靈在山藥中的消解動態(tài)

圖2 多菌靈在山藥中的消解動態(tài)

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：本方法快速簡單，靈敏度高，重現(xiàn)性好，能保證甲基硫菌靈和多菌靈的檢測數(shù)據(jù)可靠。甲基硫菌靈經(jīng)山藥莖葉吸收后很快被代謝，在其地下根莖中以多菌靈形式存在。本實(shí)驗(yàn)中，山藥根莖未檢出甲基硫菌靈而檢出多菌靈也充分證明了這一點(diǎn)。施用不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)甲基硫菌靈樣品的多菌靈殘留有差別,但不明顯。施藥后2 d，山藥根莖處的多菌靈含量達(dá)到最高值，之后緩慢降解；到14 d，降至約0.2 μg/g。

目前我國、國際食品法典委員會、歐盟和日本均未對山藥中多菌靈的農(nóng)藥殘留進(jìn)行規(guī)定,本次結(jié)果具有參考意義。建議山藥的甲基硫菌靈的施用量為45.00 kg/hm2，采收間隔期14 d以上，能保證山藥根莖中甲基硫菌靈和多菌靈農(nóng)藥殘留量較安全[8]。

[1]張帥.祁山藥炭疽病的病原鑒定、生物學(xué)特性及藥劑防治研究[D].保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué),2013.

[2]周玥,郭華,周潔.鐵棍懷山藥中主要營養(yǎng)成分的研究[J].中國食物與營養(yǎng),2011,17(3):69-71.

[3]張重義,謝彩俠,黃曉書,等.懷山藥道地產(chǎn)區(qū)與非道地產(chǎn)區(qū)藥材質(zhì)量比較[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐,2003, 17(1):19-21.

[4]陳偉,朱盈蕊,劉紅彥, 等.苯并咪唑類殺菌劑殘留分析方法研究進(jìn)展[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,52(3):623-629.

[5]田金改,金紅宇,彭方,等.多菌靈在人參生長期的殘留動態(tài)研究[J].中草藥,2006, 37(9):1413-1415.

[6]曹愛華,李義強(qiáng),徐光軍, 等.高效液相色譜法同時測定煙草中吡蟲啉、多菌靈、甲基硫菌靈的殘留量[J].中國煙草科學(xué),2009,30(1):31-34.

[7]彭方,田金改,金紅宇, 等.高效液相色譜法測定人參中多菌靈農(nóng)藥殘留含量[J].中國藥學(xué)雜志,2007,42(6):475-477.

[8]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會，中華人民共和國農(nóng)業(yè)部，國家食品藥品監(jiān)督管理總局.GB2763-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)：食品中農(nóng)藥最大殘留限量[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2016.

1001-6910(2017)10-0069-04

R284

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2017.10.29

國家十一五科技支撐計劃項(xiàng)目“中藥材資源與生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范”(2006BAI21B07)

2017-07-04；

2017-08-21

(編輯 陶 珠)