黃圓圓 康利平 彭華勝 劉大會 郝慶秀 趙加六 陳敏 黃璐琦

[摘要]為了從化學(xué)成分上研究長柱重樓是否具有重樓藥材代用品的開發(fā)價值，該研究利用UPLCQTOF MS比較了長柱重樓和滇重樓的化學(xué)成分，并進一步利用HPLCUV同時測定了77株不同來源的長柱重樓中8 種重樓皂苷的含量。結(jié)果顯示長柱重樓和滇重樓的化學(xué)成分相似，長柱重樓化學(xué)成分更為復(fù)雜，鑒定的22個主要共有峰均為甾體類化合物。不同株長柱重樓中重樓皂苷的含量具有一定的差異，其中藥典規(guī)定4種甾體皂苷（重樓皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ，Ⅶ）總量最高的為330%，最低的為0068%，8種甾體皂苷總量最高的為618%，最低的為071%。長柱重樓中78%的樣品符合《中國藥典》要求，整體質(zhì)量較為穩(wěn)定，可以作為重樓替代品種進行研究開發(fā)。

[關(guān)鍵詞]重樓； 長柱重樓； 甾體皂苷； 定性定量分析

Qualitative and quantitative analyses of primary saponins in Paris forrestii

HUANG Yuanyuan1，2， KANG Liping1， PENG Huasheng2， LIU Dahui3， HAO Qingxiu1，

ZHAO Jialiu4， CHEN Min1*， HUANG Luqi1*

（1 State Key Laboratory Breeding Base of Daodi Herbs， National Resource Center for Chinese Materia Medica，

China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China；

2Anhui University of Chinese Medicine， Hefei 230012， China；

3College of Pharmacy， Hubei University of Chinese Medicine， Wuhan 430065， China；

4Lanping County in Ecological Industry Co.， Ltd， Nujiang 673100， China）

[Abstract]In order to study whether Paris forrestii could be developed as a substitute of Paridis Rhizome， chemical compositions of P. forrestii and P. polyphylla var yunnanensis were investigated by UPLCQTOF MS In addition， the contents of eight primary steroidal saponins in 77 batches of P. forrestii samples from different habitats were simultaneously determined by HPLCUV The results showed that P. forrestii and P. polyphylla var yunnanensis have similar chemical compositions， and all 22 major common peaks were identified as steroid derivatives Meanwhile， there were some differences in the contents of saponins in P. forrestii samples from different habitats The contents of 4 steroidal saponins in Chinese Pharmacopoeia ranged from 0068% to 330%， and the highest content of the 8 kinds of steroidal saponins was 618%， while the lowest was just 071% Moreover， 78% of P. forrestii samples were in conformity with the requirements of Chinese Pharmacopoeia， indicating that P. forrestii samples had relatively stable quality and could be further studied as a substitute for Paridis Rhizome

[Key words]Paris； Paris forrestii； steroidal saponins； qualitative and quantitative analyses

2015年版《中國藥典》[1]記載重樓來源于滇重樓Paris polyphylla Smith var yunnanensis （Franch）Hand.Mazz和七葉一枝花P. polyphylla Smith var chinensis （Franch） Hara的根莖。重樓中主要含有甾體皂苷類成分，目前已報道的有160余種，這類成分具有止血、抗腫瘤、抗菌、消炎、鎮(zhèn)痛等藥理活性[27]。重樓是云南白藥、宮血寧、金復(fù)康口服液、樓連膠囊和季勝德蛇藥片等中成藥的主要組成藥味[8]，具有顯著的臨床療效和經(jīng)濟價值。

李恒等對中國重樓資源現(xiàn)狀進行了評估，發(fā)現(xiàn)重樓消費量大于野生重樓儲存量的總和，導(dǎo)致重樓資源瀕臨枯竭[9]。隨著重樓需求量的不斷增長和重樓野生資源的減少，滇重樓和七葉一枝花的產(chǎn)量已經(jīng)不能滿足市場供應(yīng)。重樓屬植物長柱重樓P. forrestii （Takht） H Li在民間常做重樓藥材使用[6，10]，且長柱重樓具有易栽培、產(chǎn)量高等特性?！对颇现参镏尽分幸灿涊d長柱重樓以根莖入藥，用于無名腫毒、蛇蟲蛟傷、腮腺炎、扁桃腺炎，主要分布于云南西北部和西部，西藏東南部 [11]。課題組前期資源調(diào)查時發(fā)現(xiàn)，長柱重樓在云南怒江州和保山市一帶具有一定的野生分布和一定量的人工栽培。目前長柱重樓的化學(xué)成分鮮有報道，僅李朋等對7株長柱重樓進行了含量測定分析[12]。前期對15種重樓屬植物研究時發(fā)現(xiàn)，長柱重樓具有重樓代用品的開發(fā)潛力。為此，課題組多次從云南怒江州和保山市收集了多批次長柱重樓，進一步研究長柱重樓P. forrestii （Takht） H Li和滇重樓P. polyphylla var yunnanensis化學(xué)成分的相似性，并對77株長柱重樓中的重樓皂苷Ⅰ， Ⅱ， Ⅵ， Ⅶ， H， V， 薯蕷皂苷和纖細薯蕷皂苷等8種活性皂苷進行了含量測定研究，為長柱重樓的開發(fā)和質(zhì)量評價提供依據(jù)。endprint

1材料

液相為Waters Acquity HClass UPLC TM超高效液相色譜儀串聯(lián)外接柱溫箱（包括四元溶劑管理器、真空脫氣機、自動進樣器、外接柱溫箱、PDA檢測器、Empower 3工作站，美國Waters 公司），Mettler TOLEDO XS105DU分析天平（瑞士梅特勒公司），SB800 DTD超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司），電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）。

液質(zhì)聯(lián)用為Waters Acquity IClass UPLC TM串聯(lián)Waters Zevo G2S QTOF MS（美國Waters 公司），色譜柱為Waters Acquity HSS T3色譜柱（21 mm× 100 mm， 18 μm），流動相為01% 甲酸乙腈（A）水（B）梯度洗脫，流速05 mL·min-1，柱溫40 ℃。離子化模式為電噴霧正、負(fù)離子，毛細管電壓為2 000 V（負(fù)）和500 V（正），錐孔電壓為30 V，除溶劑氣體為氮氣，900 L·h-1，除溶劑溫度為450 ℃，離子源溫度為100 ℃，掃描范圍為m/z 50～1 500，碰撞氣體為氬氣。低能量掃描時trap電壓為6 eV，高能量掃描時trap電壓為50～70 eV（負(fù)）和45～60 eV（正）。準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)用leucine enkephalin作校正液。

甲醇（色譜純，UN 1230）和乙腈（色譜純，UN 1648）購自德國默克股份有限公司，乙醇（分析純，批號20160918）購自北京化工廠，超純水自制（Thermo Barnstead GenPure UV/UF）。

對照品重樓皂苷Ⅶ（純度925%，批號111593201303）、重樓皂苷Ⅵ（純度951%，批號111592201203）、重樓皂苷Ⅱ（純度934%，批號111591201103）和重樓皂苷Ⅰ（純度936%，批號111590201604）購自于中國食品藥品檢定研究院，重樓皂苷H（純度>98%，批號H036161001）、重樓皂苷Ⅴ（純度>98%，批號H036150215）、薯蕷皂苷（純度>98%，批號S048160408）、纖細薯蕷皂苷（純度>98%，批號X053151111）購于北京融誠鑫德科技發(fā)展有限公司。

長柱重樓釆自云南省怒江州和保山市，滇重樓釆自云南省文山市。長柱重樓與滇重樓的植物植物形態(tài)和根莖見圖1，長柱重樓樣品信息見表1，所有樣品經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)彭華勝教授鑒定為長柱重樓P. forrestii和滇重樓P. polyphylla var. yunnanensis。植物標(biāo)本存于中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心。

2方法和結(jié)果

21化學(xué)成分定性分析

應(yīng)用UPLCQTOFMS在上述色譜和質(zhì)譜條件下對滇重樓和長柱重樓進行分析。通過正、負(fù)準(zhǔn)分子離子峰的精確分子質(zhì)量確定化合物的相對分子質(zhì)量和可能的分子式，再通過高能量掃描時產(chǎn)生的碎片離子推測碎片的元素組成和結(jié)構(gòu)；最后通過和已有文獻中甾體皂苷的色譜行為和質(zhì)譜行為進行比對并結(jié)合文獻報道的成分，鑒定色譜峰可能的結(jié)構(gòu)。滇重樓和長柱重樓的基峰離子比較色譜圖見圖2。

22含量測定分析[16]

色譜條件為資生堂CAPCELL PAK ADME 色譜柱（46 mm×250 mm， 5 μm）；流動相乙腈（A） 水（B）梯度洗脫：0～9 min，35%～44% A；9～22 min，44% A；22～38 min，44%～47% A；38～39 min，47%～98% A；流速08 mL·min-1；檢測波長為203 nm；柱溫21 ℃；進樣量10 μL。重樓皂苷對照品和長柱重樓樣品的HPLC圖，見圖3。

23供試品溶液的制備

取長柱重樓藥材粉末約05 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70% 乙醇25 mL，稱重，加熱回流30 min，放冷，再稱重，用70% 乙醇補足失重后搖勻，12 000 r·min-1高速離心15 min后取上清液過022 μm濾膜，取續(xù)濾液即得供試樣品溶液。

24對照品溶液的制備

分別精密稱取重樓皂苷Ⅶ、H、Ⅵ、Ⅱ、Ⅰ、Ⅴ、薯蕷皂苷和纖細薯蕷皂苷，甲醇超聲溶解，配制成質(zhì)量濃度分別為0334，0348，0267，0327，0361，0340，0362，0381 g·L-1 的8種混合對照品母液，并逐級稀釋2倍，配成7個濃度。

25含量測定的方法學(xué)考察

251線性關(guān)系每個濃度混合對照品進樣10 μL，在上述21項色譜條件下分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，以各對照品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。以信噪比S/N=10為最低定量下限，信噪比S/N=3為最低檢測下限。結(jié)果表明8種重樓皂苷有良好的線性范圍和線性關(guān)系，見表3。

252精密度實驗取混合對照品溶液，在以上色譜條件下連續(xù)進樣6次，重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷H、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅱ、薯蕷皂苷、纖細薯蕷皂苷、重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅴ色譜峰峰面積的RSD（n=6）分別為070%，080%，080%，10%，090%，070%，080%，090%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

253樣品的重復(fù)性試驗取長柱重樓藥材粉末約05 g，平行6份，精密稱定，用以上供試品溶液制備方法制備供試品溶液，在以上色譜條件下分析，計算樣品中重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷H、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅱ、薯蕷皂苷、纖細薯蕷皂苷、重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅴ含量的RSD 分別為12%，095%，19%，22%，070%，054%，064%，14%，結(jié)果表明實驗重復(fù)性良好。

254穩(wěn)定性試驗取供試品溶液分別于0，2，4，8，16，24，48，72 h進樣測定，供試品溶液中8種重樓皂苷的色譜峰峰面積的RSD（n=8） 分別為010%，050%，13%，090%，12%，060%，050%，060%，結(jié)果表明供試品溶液在3 d內(nèi)穩(wěn)定性良好。endprint

255加樣回收率試驗取已知含量長柱重樓藥材粉末約025 g×9，精密稱定，按照相當(dāng)于藥材中重樓皂苷80%，100%，120% 的比例，分別精密加入混合對照品溶液25 mL， 同上供試品的制備方法，在上述的色譜條件下進行分析，計算重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷H、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅱ、薯蕷皂苷、纖細薯蕷皂苷、重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅴ的回收率，回收率=（C-A）/B×100%，A為所用重樓藥材中含被測成分的量，B為加入對照品量，C為混樣的實測值，試驗結(jié)果見表4。

3討論

從UPLCQTOF MS的分析結(jié)果看，長柱重樓和滇重樓的化學(xué)成分相似。長柱重樓含有滇重樓主要的色譜峰，但其薯蕷皂苷元糖苷的種類比滇重樓更復(fù)雜。從含量測定的整體結(jié)果看，長柱重樓中藥典規(guī)定的重樓皂苷Ⅰ， Ⅱ， Ⅵ， Ⅶ的總量平均量在123%，遠高于藥典規(guī)定的06%；另外重樓皂苷H， V， 薯蕷皂苷和纖細薯蕷皂苷的平均總量在193%，高于藥典4種皂苷的總含量；而8種皂苷總量平均在317%，這一結(jié)果也略高于李朋等[12]所測的平均含量，其中本研究增加了薯蕷皂苷含量的測定（平均量056%），而沒有測定皂苷D的量（平均量0005%）。從個體來看，長柱重樓中藥典4種皂苷最高量在330%，最低量在0068%，有22%的樣品不符合藥典的要求；8種皂苷最高量在618%，最低量在071%，相差近9倍。從甾體皂苷的類型上看，3個偏諾皂苷元類糖苷的平均量在020%，5個薯蕷皂苷元類糖苷的平均量在297%，后者是前者的14倍；偏諾皂苷元類糖苷量最高在115%，最低的不在檢測范圍。根據(jù)偏諾皂苷元類糖苷的止血活性強于薯蕷皂苷元類糖苷，偏諾皂苷元類糖苷的細胞毒活性弱于薯蕷皂苷元類糖苷的研究結(jié)果[1719]，推測長柱重樓的抗腫瘤的活性可能會更強。

在長柱重樓的采樣過程中發(fā)現(xiàn)長柱重樓具有一些不同的性狀變異表型，這些變異的長柱重樓的含量通常較低，比如1～15號和21～32號均為稍有表型變異的長柱重樓，27個樣品中有16個不符合藥典要求，不合格率在593%左右，而其它較為典型的長柱重樓只有一株不符合藥典要求。根據(jù)本研究結(jié)果和前人含量測定結(jié)果[2022]對比可知，相比重樓正品來源滇重樓和七葉一枝花，長柱重樓中的皂苷含量不低于兩者，甚至更高，因此值得對長柱重樓的化學(xué)成分進行深入研究并對其生物活性開展評價，并作為重樓的代用品進行深入研究與開發(fā)。

[致謝]長柱重樓采樣和鑒定過程中得到了云南彝道農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司和中國科學(xué)院昆明植物研究所李恒研究員的幫助和支持。

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[責(zé)任編輯丁廣治]endprint