何 斌，陳彥伶，龍治海，嚴(yán)俊剛，趙鳳麒，夏 美，陳先均*

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所，四川 宜賓 644000；2.四川省生物資源保護(hù)與可持續(xù)利用實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041；3.貴州省石阡縣畜牧產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心，貴州 石阡 555100)

幾種抗凍劑對達(dá)氏鱘精子活力及運(yùn)動(dòng)時(shí)間的影響

何 斌1,2，陳彥伶1，龍治海1，嚴(yán)俊剛1，趙鳳麒1，夏 美3，陳先均1*

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所，四川 宜賓 644000；2.四川省生物資源保護(hù)與可持續(xù)利用實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041；3.貴州省石阡縣畜牧產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心，貴州 石阡 555100)

【目的】為了研究不同濃度抗凍劑對達(dá)氏鱘精子活力、運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命的影響，【方法】用0.7 %氯化鈉+0.02 %氯化鉀+3.5 %葡萄糖的稀釋液分別配制成4 %甲醇(Methanol)、8 %乙二醇( Ethylene Glycol)、12 % 1,3-丙二醇(1,3-Propanediol)、16 %丙三醇(Glycerol)、20 %二甲基甲酰胺(N,N-Dimethylformamide)和24 %二甲亞砜(Dimethyl Sulfoxide)的6種抗凍劑，在4 ℃保存達(dá)氏鱘精子16 h后進(jìn)行激活處理。【結(jié)果】結(jié)果表明：丙三醇、二甲基甲酰胺和二甲亞砜在濃度4 %～24 %時(shí)精子激活后有活力和壽命；甲醇、乙二醇和1,3-丙二醇在濃度4 %～16 %時(shí)精子激活后有活力和壽命，當(dāng)濃度為20 %和24 %時(shí)精子全部死亡。甲醇、乙二醇、1,3-丙二醇、丙三醇、二甲基甲酰胺和二甲亞砜濃度分別為8 %、8 %、12 %、4 %、4 %和8 %時(shí)，最高精子活力分別為81 %、32 %、76 %、64 %、72 %和67 %，最長精子激烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命分別為42 和205 s、16 和123 s、36 和127 s、25 和96 s、27和132 s、25和103 s。甲醇與其它幾種抗凍劑相比，在8 %甲醇中達(dá)氏鱘精子的激烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命最長，分別為42和205 s?！窘Y(jié)論】6種抗凍劑對達(dá)氏鱘精子有不同的毒性作用，保存后精子活力和壽命均降低。

達(dá)氏鱘；抗凍劑；精子活力；運(yùn)動(dòng)時(shí)間

【研究意義】達(dá)氏鱘(AcipenserdabryanusDumeril)，隸屬于鱘形目(Acipenseriformes)，鱘科(Acipenseridae)，鱘屬(AcipenserLinnaeus)，是一種較大型淡水定居性魚類，是我國特有種，達(dá)氏鱘的肉和卵味道鮮美，富含營養(yǎng)，尤其是魚卵可加工成魚子醬[1]。由于興修水利，過度捕撈等導(dǎo)致生態(tài)環(huán)境急劇變遷，達(dá)氏鱘野生種群資源日趨減少，達(dá)氏鱘的分布區(qū)逐漸縮小，于1988年被列為國家Ⅰ級保護(hù)動(dòng)物。

【前人研究進(jìn)展】目前，國內(nèi)外對中華鱘、西伯利亞鱘、史氏鱘、俄羅斯鱘等鱘魚類精子冷凍保存技術(shù)研究開展較多研究，已有較多報(bào)道[2-5]。達(dá)氏鱘的研究主要開展了生物學(xué)特性、人工繁育、分子生物等方面的研究[6-9]，有關(guān)抗凍劑對達(dá)氏鱘精子保存后活力和運(yùn)動(dòng)時(shí)間的研究未見報(bào)道。【本研究切入點(diǎn)】本試驗(yàn)通過在適宜的達(dá)氏鱘精子稀釋液中配制不同濃度的抗凍劑對精子活力、運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命的影響進(jìn)行了研究。【擬解決的關(guān)鍵問題】旨在進(jìn)一步了解達(dá)氏鱘精子的生物學(xué)特性，同時(shí)為達(dá)氏鱘精子的超低溫冷凍保存研究中尋找合適的抗凍劑和保存液提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 精子采集及預(yù)處理

2014年4-5月，對本所自己培育的性成熟達(dá)氏鱘雄魚進(jìn)行人工催熟催產(chǎn)。用干凈的干毛巾擦去體表和生殖孔周圍的水及雜物，用手輕輕擠壓腹部使精液自然流出，用干凈干燥的塑料封口袋收集無水、無血和無糞便的精液并充氧待檢，鏡檢精子活力，選取精子活力在95 % 以上的精液作為試驗(yàn)材料，將其放置于4 ℃的冰箱中備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 稀釋液的篩選 用氯化鈉、氯化鉀和葡萄糖分析純試劑配制不同單因子稀釋液，用不同濃度的單因子稀釋液抑制精子，當(dāng)某一濃度稀釋液能抑制精子，再用江水激活精子時(shí)精子活力強(qiáng)；根據(jù)單因子試驗(yàn)結(jié)果調(diào)整各單因子稀釋液濃度，配制氯化鈉+氯化鉀+葡萄糖的混合稀釋液，分別為配方0.6 %氯化鈉+ 0.015 %氯化鉀+ 2.5 %葡萄糖，0.7 %氯化鈉+ 0.02 %氯化鉀+ 3.5 %葡萄糖，0.8 %氯化鈉+ 0.025 %氯化鉀+ 4.5 %葡萄糖的3種混合稀釋液，配方編號分別為1，2和3組，直接用于江水激活的作為對照組，定位0組；用3種混合稀釋液和自然江水對達(dá)氏鱘精子進(jìn)行活力和壽命測定，記錄精子被完全抑制后再通過用江水激活的精子壽命和活力，每組濃度重復(fù)3次，篩選出適合達(dá)氏鱘精子的稀釋液。取3 尾達(dá)氏鱘親魚精子樣本重復(fù)以上步驟，取平均值。

1.2.2 抗凍劑的配制 根據(jù)1.2.1中試驗(yàn)篩選得出的混合稀釋液，用此稀釋液分別配制4 %、8 %、12 % 、16 % 、20 % 和24 %的甲醇、乙二醇、二甲亞砜、1,3-丙二醇、丙三醇、二甲基甲酰胺不同濃度的最終抗凍劑，所用試劑均為分析純，試劑配好后放置在4 ℃的冰箱中備用。

1.2.3 精子活力及運(yùn)動(dòng)時(shí)間觀察 分別取4 %、8 %、12 % 、16 % 、20 % 和24 %的甲醇、乙二醇、二甲亞砜、1,3-丙二醇、丙三醇和二甲基甲酰胺抗凍劑與精液以1︰1在1.8 mL冷凍管中混合，將混合液置于4 ℃冰箱放置16 h后分別觀察精子活力和運(yùn)動(dòng)時(shí)間。進(jìn)行觀察時(shí)，從冰箱中取出盛有精液混合液的冷凍管，用解剖針沾取少量的精液混合液到載玻片上，將精液混合液涂勻，放在顯微鏡下，用滴管取江水，滴加在精液混合液上，立即觀察精子的活力和運(yùn)動(dòng)情況。用秒表分別記錄精子的激烈運(yùn)動(dòng)、緩慢運(yùn)動(dòng)、擺尾運(yùn)動(dòng)的時(shí)間，每個(gè)濃度重復(fù)3次。取3 尾親魚精子樣本重復(fù)以上步驟，取平均值。

1.2.4 精子運(yùn)動(dòng)階段的劃分 根據(jù)達(dá)氏鱘精子在水中的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，參照四川省長江水產(chǎn)資源調(diào)查組[10]將鱘魚精子的運(yùn)動(dòng)劃分為激烈運(yùn)動(dòng)、緩慢運(yùn)動(dòng)和原地?cái)[動(dòng)3個(gè)連續(xù)的階段。精子壽命為這3個(gè)階段時(shí)間的總和。各階段之間的界限，以視野中70 %以上的精子從當(dāng)前運(yùn)動(dòng)轉(zhuǎn)入后一運(yùn)動(dòng)，即認(rèn)為精子運(yùn)動(dòng)時(shí)間結(jié)束，當(dāng)90 %以上的精子停止顫動(dòng)，即認(rèn)為精子死亡。以精液與激活液接觸的瞬間開始計(jì)算精子運(yùn)動(dòng)的時(shí)間。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)的處理和作圖均采用“SPSS version 19.0”軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 稀釋液對精子活力和壽命的影響

從表1可知，不同的稀釋液對達(dá)氏鱘精子活力及壽命影響不同，3組稀釋液中精子活力和壽命都低于對照組，2組稀釋液中精子活力和壽命最高，分別為89 %和391 s，3組稀釋液中精子活力和壽命最低，分別為83 %和324 s。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果最適合達(dá)氏鱘精子的稀釋液為2組，配方為0.7 %氯化鈉+0.02 %氯化鉀+3.5 %葡萄糖。

2.2 抗凍劑對精子活力的影響

2.2.1 甲醇對精子活力的影響 從表2可看出，當(dāng)甲醇濃度為4 %時(shí)，精子活力為69 %，隨著甲醇濃度的增加，達(dá)氏鱘精子活力先升高后降低，當(dāng)濃度為8 %時(shí)精子活力最高，為 81 %；當(dāng)濃度繼續(xù)增加，精子活力開始下降，當(dāng)濃度增加到16 %時(shí)，精子活力降低為53 %；當(dāng)濃度增加到20 %時(shí)，精子全部死亡，精子活力為0。

表1 不同稀釋液對精子活力及壽命的影響Table 1 Efects of the different sperm diluents on the sperm motility and life-span

表2 不同抗凍劑對精子活力的影響Table 2 Effects of the different cryoprotectants on the sperm motility

2.2.2 乙二醇對精子活力影響 當(dāng)乙二醇濃度為4 %時(shí)，精子活力為21 %，隨著乙二醇濃度的增加，達(dá)氏鱘精子活力先升高后降低，當(dāng)濃度為8 %時(shí)精子活力最高，為 32 %；當(dāng)濃度繼續(xù)增加，精子活力開始下降，當(dāng)濃度增加到16 %時(shí)，精子活力降低為7 %；當(dāng)濃度增加到20 %時(shí)，精子活力降低為0，精子全部死亡。

2.2.3 二甲亞砜對精子活力影響 當(dāng)二甲亞砜濃度為4 %時(shí)，精子活力為52 %，隨著二甲亞砜濃度的增加，達(dá)氏鱘精子活力先升高后降低，當(dāng)濃度為8 %時(shí)精子活力最高，為 67 %；當(dāng)濃度繼續(xù)增加，精子活力開始下降，當(dāng)濃度增加至24 %時(shí)，精子活力降低為11 %。

2.2.4 1,3-丙二醇對精子活力影響 當(dāng)1,3-丙二醇濃度為4 %時(shí)，精子活力為52 %，隨著1,3-丙二醇濃度的增加，達(dá)氏鱘精子活力先升高后降低，當(dāng)濃度為12 %時(shí)精子活力最高，為 76 %；當(dāng)濃度繼續(xù)增加，精子活力開始下降，濃度16 %時(shí)精子活力降低為47 %，當(dāng)濃度增加至20 %時(shí)，精子全部死亡。

2.2.5 丙三醇對精子活力影響 當(dāng)丙三醇濃度為4 %時(shí)精子活力最高，為64 %，隨著丙三醇濃度的增加，達(dá)氏鱘精子活力下降；當(dāng)濃度增加到24 %時(shí)，精子活力降低為12 %。

圖1 甲醇濃度對精子運(yùn)動(dòng)時(shí)間的影響Fig.1 Effects of MeOH concentration on the sperm movement time

2.2.6 二甲基甲酰胺對精子活力影響 當(dāng)二甲基甲酰胺濃度為4 %時(shí)精子活力最高，為72 %；隨著二甲基甲酰胺濃度的增加，達(dá)氏鱘精子活力下降，當(dāng)濃度增加到24 %時(shí)，精子活力降低為24 %。

2.3 抗凍劑對精子運(yùn)動(dòng)時(shí)間的影響

2.3.1 甲醇對精子運(yùn)動(dòng)時(shí)間的影響 從圖1可見，溫度4 ℃時(shí)達(dá)氏鱘精子在不同濃度甲醇中保存16 h后用江水激活，隨著甲醇濃度的增加，達(dá)氏鱘精子激烈運(yùn)動(dòng)、緩慢運(yùn)動(dòng)和原地?cái)[動(dòng)時(shí)間以及壽命均先升高后降低。當(dāng)濃度為8 %時(shí)，激烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間、緩慢運(yùn)動(dòng)時(shí)間、原地?cái)[動(dòng)時(shí)間以及壽命最長，分別為42、40、123和205 s；當(dāng)濃度增加到20 %時(shí)，精子全部死亡，運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命為0。

2.3.2 乙二醇對精子運(yùn)動(dòng)時(shí)間影響 從圖2可見，溫度4 ℃時(shí)達(dá)氏鱘精子在不同濃度乙二醇中保存16 h后用江水激活，隨著乙二醇濃度的增加，達(dá)氏鱘精子激烈運(yùn)動(dòng)、緩慢運(yùn)動(dòng)和原地?cái)[動(dòng)時(shí)間以及壽命均先升高后降低。當(dāng)濃度為8 %時(shí)，激烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間、緩慢運(yùn)動(dòng)時(shí)間、原地?cái)[動(dòng)時(shí)間以及壽命最長，分別為16、29、78和123 s；當(dāng)濃度增加到20 %時(shí)，精子全部死亡，運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命為0。

圖2 乙二醇濃度對精子運(yùn)動(dòng)時(shí)間的影響Fig.2 Effects of EG concentration on the sperm movement time

圖3 二甲亞砜濃度對精子運(yùn)動(dòng)時(shí)間的影響Fig.3 Effects of DMSO concentration on the sperm movement time

2.3.3 二甲亞砜對精子運(yùn)動(dòng)時(shí)間影響 從圖3可見，溫度4 ℃時(shí)達(dá)氏鱘精子在不同濃度二甲亞砜中保存16 h后用江水激活，當(dāng)濃度為8 %時(shí)，激烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間、緩慢運(yùn)動(dòng)時(shí)間、原地?cái)[動(dòng)時(shí)間以及壽命最長，分別為25、23、55和103 s；達(dá)氏鱘精子激烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命隨著二甲亞砜濃度的增加先升高后降低，當(dāng)濃度8 %時(shí)激烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命最長，分別為25和103 s，當(dāng)濃度增加至24 %時(shí)激烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命分別降低為9和43 s。濃度8 %時(shí)精子緩慢運(yùn)動(dòng)時(shí)間最長，為23 s；二甲亞砜濃度4 %～12 %時(shí)緩慢運(yùn)動(dòng)時(shí)間先升高后降低，在濃度8 %時(shí)運(yùn)動(dòng)時(shí)間升高為23 s，濃度12 %時(shí)運(yùn)動(dòng)時(shí)間降低為18 s；濃度增加至16 %時(shí)緩慢運(yùn)動(dòng)時(shí)間再次升高為21 s；濃度增加至20 %時(shí)緩慢運(yùn)動(dòng)時(shí)間下降，濃度24 %時(shí)運(yùn)動(dòng)時(shí)間降低為12 s。二甲亞砜濃度4 %～16 %時(shí)原地?cái)[動(dòng)時(shí)間先升高后降低，濃度8 %時(shí)原地?cái)[動(dòng)時(shí)間最長，為55 s，濃度16 %時(shí)降低為39 s；在濃度20 %時(shí)原地?cái)[動(dòng)時(shí)間又升高為44 s，當(dāng)濃度增加至24 %時(shí)原地?cái)[動(dòng)時(shí)間則降低為22 s。

圖4 1,3-丙二醇濃度對精子活力的影響Fig.4 Effects of 1,3-Propanediol concentration on the sperm movement time

圖5 丙三醇濃度對精子活力的影響Fig.5 Effects of Glycerol concentration on the sperm movement time

2.3.4 1,3-丙二醇對精子運(yùn)動(dòng)時(shí)間影響 從圖4可見，溫度4 ℃時(shí)達(dá)氏鱘精子在不同濃度1,3-丙二醇中保存16 h后用江水激活，精子激烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間隨著1,3-丙二醇濃度增加先升高后降低，當(dāng)濃度為12 %時(shí)激烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間最長，為36 s，濃度16 %時(shí)運(yùn)動(dòng)時(shí)間降低為19 s，濃度增加至20 %時(shí)精子全部死亡。1,3-丙二醇濃度4 %～12 %時(shí)緩慢運(yùn)動(dòng)時(shí)間先降低后升高，在濃度8 %時(shí)運(yùn)動(dòng)時(shí)間降低為17 s，濃度12 %時(shí)緩慢運(yùn)動(dòng)時(shí)間最長，為26 s，濃度繼續(xù)增加后運(yùn)動(dòng)時(shí)間則降低，濃度16 %時(shí)運(yùn)動(dòng)時(shí)間再次降低為15 s，當(dāng)濃度增加至20 %時(shí)精子全部死亡。精子原地?cái)[動(dòng)時(shí)間隨著1,3-丙二醇濃度增加而降低，當(dāng)濃度4 %時(shí)原地?cái)[動(dòng)時(shí)間最長，為76 s；當(dāng)濃度增加至16 %時(shí)運(yùn)動(dòng)時(shí)間降低為30 s，濃度繼續(xù)增加至20 %時(shí)精子全部死亡。濃度12 %時(shí)精子壽命最長，為127 s；1,3-丙二醇濃度4 %～12 %時(shí)精子壽命先降低后升高，在濃度8 %時(shí)壽命降低為109 s，濃度12 %時(shí)壽命時(shí)間升高為127 s，濃度16 %時(shí)壽命再次降低為64 s，當(dāng)濃度繼續(xù)增加至20 %時(shí)精子全部死亡。

2.3.5 丙三醇對精子運(yùn)動(dòng)時(shí)間影響 從圖5可見，溫度4 ℃時(shí)達(dá)氏鱘精子在不同濃度丙三醇中保存16 h后用江水激活，精子激烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間隨著丙三醇濃度增加先降低后升高再降低，當(dāng)濃度4 %時(shí)運(yùn)動(dòng)時(shí)間最長，為25 s，在濃度8 %時(shí)運(yùn)動(dòng)時(shí)間降低為14 s，但是在濃度12 %時(shí)運(yùn)動(dòng)時(shí)間又升高為17 s，濃度增加到16 %時(shí)繼續(xù)增加濃度運(yùn)動(dòng)時(shí)間則降低，濃度24 %時(shí)運(yùn)動(dòng)時(shí)間降低為3 s。濃度8 %和16 %時(shí)精子緩慢運(yùn)動(dòng)時(shí)間最長，為21 s，濃度4 %～16 %時(shí)精子緩慢運(yùn)動(dòng)時(shí)間隨著濃度增加先升高后降低再升高，濃度8 %時(shí)運(yùn)動(dòng)時(shí)間升高為21 s，濃度12 %時(shí)運(yùn)動(dòng)時(shí)間則降低為18 s，濃度增加至16 %時(shí)時(shí)間又升高為21 s，當(dāng)濃度增加至20 %時(shí)，繼續(xù)增加濃度運(yùn)動(dòng)時(shí)間降低，濃度24 %時(shí)運(yùn)動(dòng)時(shí)間降低為8 s。原地?cái)[動(dòng)時(shí)間和壽命隨著丙三醇濃度增加而降低，濃度4 %時(shí)原地?cái)[動(dòng)時(shí)間和壽命最長，分別為54 和96 s，當(dāng)濃度增加至24 %時(shí)原地?cái)[動(dòng)時(shí)間和壽命最短，分別為20 和31 s。

圖6 二甲基甲酰胺濃度對精子運(yùn)動(dòng)時(shí)間的影響Fig.6 Effects of N,N-Dimethylformamide concentration on the sperm movement time

2.3.6 二甲基甲酰胺對精子運(yùn)動(dòng)時(shí)間影響 從圖6可見，溫度4 ℃時(shí)達(dá)氏鱘精子在不同濃度二甲基甲酰胺中保存16 h后用江水激活，精子激烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命隨著二甲基甲酰胺濃度增加而降低，當(dāng)濃度4 %時(shí)運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命最長，分別為27 和132 s，當(dāng)濃度增加至24 %時(shí)運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命分別降低為9和70 s。緩慢運(yùn)動(dòng)時(shí)間隨著二甲基甲酰胺濃度增加先升高后降低，濃度為12 %時(shí)緩慢運(yùn)動(dòng)時(shí)間最長，為45 s，繼續(xù)增加濃度運(yùn)動(dòng)時(shí)間則降低，當(dāng)濃度24 %時(shí)運(yùn)動(dòng)時(shí)間降為13 s。原地?cái)[動(dòng)時(shí)間隨著二甲基甲酰胺濃度增加總體是降低，當(dāng)濃度4 %時(shí)原地?cái)[動(dòng)時(shí)間最長，為71 s，濃度為8 %～16 %時(shí)原地?cái)[動(dòng)時(shí)間分別為61、58和62 s，原地?cái)[動(dòng)時(shí)間比較接近，當(dāng)濃度增加至20 %時(shí)原地?cái)[動(dòng)時(shí)間降低為52 s，濃度24 %時(shí)擺動(dòng)時(shí)間降低為48 s。

3 討 論

3.1 稀釋液對精子活力及運(yùn)動(dòng)時(shí)間影響

魚類精子在精巢和精漿中受到抑制不活動(dòng),若抑制條件被解除則會(huì)被激活激烈運(yùn)動(dòng)起來,激烈運(yùn)動(dòng)的精子如果處于抑制環(huán)境,其活動(dòng)又受到抑制,抑制條件被解除后將再次被重新激活,可以如此反復(fù)。添加稀釋液可以保持精細(xì)胞的活力,延長其保存時(shí)間[11]，不同魚類精子運(yùn)動(dòng)的誘導(dǎo)機(jī)制不盡相同，淡水魚類精子的激活是由淡水環(huán)境的低滲所誘發(fā)，而海水魚類精子運(yùn)動(dòng)則是由海水的高滲所刺激[12]。本試驗(yàn)中適量的Na+和K+能夠抑制達(dá)氏鱘精子并能被激活的結(jié)果，與Morisawa等研究的用不同滲透壓的NaCl、KCl和甘露醇溶液作精子激活試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)一些淡水硬骨魚類,如鯽、褐三齒雅羅魚的精子在高滲透壓溶液中,精子不活動(dòng),呈抑制狀態(tài),若加1滴去離子水,精子立刻被激活而運(yùn)動(dòng),而用低滲透壓溶液去稀釋精子,同樣能誘發(fā)精子從抑制到激活狀態(tài)[13]；與江世貴等通過對中華烏塘鱧精子激活的研究中認(rèn)為K+的存在能對中華烏塘鱧精子的活動(dòng)有抑制作用[14]；與劉鵬等研究結(jié)果顯示K+為2.7 mM時(shí)西伯利亞鱘精子活力被完全抑制[2]；與趙亞龍等的研究的大口胭脂魚精子在NaCl濃度達(dá)1.0 %時(shí),精子出現(xiàn)不活動(dòng)狀態(tài),但滴加1滴去離子水后,精子可被激活,出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)現(xiàn)象的研究成果[15]，基本一致。

3.2 抗凍劑對精子活力及運(yùn)動(dòng)時(shí)間的影響

幾種抗凍劑相比，在8 %的甲醇中達(dá)氏鱘精子的激烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命最長，可長達(dá)42和205 s，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它幾種抗凍劑中達(dá)氏鱘精子的激烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命。甲醇、乙二醇和1,3-丙二醇濃度增加至20 %時(shí)，達(dá)氏鱘精子的壽命急劇縮短，全部死亡無運(yùn)動(dòng)，但丙三醇、二甲基甲酰胺和二甲亞砜抗凍劑濃度增加至24 %時(shí)，達(dá)氏鱘精子激活后仍有一定活力和壽命。試驗(yàn)表明不同抗凍劑的不同濃度對達(dá)氏鱘精子的活力和運(yùn)動(dòng)時(shí)間影響各不相同，達(dá)氏鱘精子對高濃度甲醇、乙二醇和1,3-丙二醇的耐受力較差，高濃度時(shí)對精子毒性較大，致死時(shí)間短，達(dá)氏鱘精子對丙三醇、二甲基甲酰胺和二甲亞砜的耐受性較強(qiáng)。

試驗(yàn)中不加入稀釋液和抗凍劑的對照組精子即使在4 ℃條件下保存16 h，直接用自然江水激活后，精子活力和壽命較高，分別為89 %和317 s,表明達(dá)氏鱘精子沒有外界條件干預(yù)時(shí)精子活力和壽命均較高；加入不同濃度的抗凍劑4 ℃條件保存16 h后，即使用自然江水激活，精子活力和壽命不同程度地降低，在高濃度時(shí)甚至全部死亡，說明不同抗凍劑不同濃度對達(dá)氏鱘精子具有不同程度的毒性作用。這試驗(yàn)結(jié)果，與荊榮燕研究的抗凍劑的濃度越大，毒性就越強(qiáng)，精子活力就越低的結(jié)論[16]；與章龍珍等研究結(jié)果，二甲亞砜對魚類精子的抗凍保護(hù)效果最好,但不同魚類的最適濃度不盡相同，對精子具有不同毒性[17]；與閆秀明等研究結(jié)果，10 %二甲亞砜對黃鱔精子的抗凍保護(hù)作用最好，毒性作用最弱[18]；與劉本偉等研究結(jié)果,甲醇對魚類精子傷害較大,毒性較強(qiáng)[19]；與蘇新有研究結(jié)果，甘油對瑪麗魚的精子毒性影響較低，但其仍然可以在短時(shí)間內(nèi)造成精子的大量死亡的研究結(jié)果[20]基本相似。

3.3 達(dá)氏鱘精子超低溫保存液

本試驗(yàn)通過用0.7 %氯化鈉+0.02 %氯化鉀+3.5 %葡萄糖的混合稀釋液配制6種抗凍劑形成不同濃度的保存液，篩選適合達(dá)氏鱘精子保存的抗凍劑，以便配制超低溫保存液。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道:Glogowski.J，JAHN Ichen.H和Harvey .B研究表明甲醇相對二甲亞砜和甘油來說是低毒的,而且對許多細(xì)胞的保存效果比二甲亞砜和甘油好[21-23]。Lahnsterner.F等研究表明在許多淡水及洄游性魚類精子保存中,甲醇比二甲亞砜更適合作為超低溫冷凍的抗凍劑[24-25]。章龍珍等研究結(jié)果，俄羅斯鱘精子在10 %甲醇作為抗凍劑的保存液超低溫保存后，精子中SOD、CAT、GSH-PX活性較鮮精組顯著降低，較未添加保護(hù)液組顯著升高，GR活性則顯著高于鮮精組，但顯著低于未添加保護(hù)液組[3]。劉鵬等研究結(jié)果,西伯利亞鱘精子冷凍保存抗凍劑甲醇最佳濃度為18 %，精子活力達(dá)到(51.8±5.8) %[2]。蘇德斌等研究結(jié)果，8 %甲醇作為史氏鱘精子抗凍劑，二步法超低溫(-196 ℃)冷凍保存5 h后取出，解凍后激活率為(52.3±3.5) %[4]。歷萍研究結(jié)果，中華鱘精子在20 mM(Tris)，75 mM(Suerose)，0.5 mM(KCl)，pH 8.5的稀釋液中抗凍劑甲醇8 %時(shí)，彗尾DNA百分率均最小，而且C級和D級損傷的細(xì)胞相對較少(不超過30 %)，而且彗尾DNA百分率與解凍后精子的運(yùn)動(dòng)速率呈顯著負(fù)相關(guān)(Irl>0.8，P<0.05)[5]。本研究中采用的0.7 %氯化鈉+0.02 %氯化鉀+3.5 %葡萄糖的稀釋液與上述報(bào)道的精子稀釋液不同，但冷凍前達(dá)氏鱘精子在甲醇濃度8 %、1,3-丙二醇濃度12 %和二甲基甲酰胺濃度4 %中可以較長時(shí)間激烈運(yùn)動(dòng)且壽命相對較長，在甲醇濃度8 %時(shí)精子活力、激烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命最好。用一定濃度的這幾種抗凍劑進(jìn)行超低溫(-196 ℃)冷凍保存后，達(dá)氏鱘精子是否可以獲得較好的活力，較長激烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間和壽命，這還有待于以后更進(jìn)一步的開展研究。

3.4 超低溫冷凍保存原理及意義

精液的成分大部分是水，精液超低溫保存的關(guān)鍵主要取決于水的性質(zhì)。溫度低于精液冰點(diǎn)時(shí)水開始結(jié)冰，冰點(diǎn)至-60 ℃是形成有序狀態(tài)冰晶的溫度區(qū)。細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成會(huì)機(jī)械損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)；細(xì)胞外結(jié)冰會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞失水，使細(xì)胞變形、破裂死亡。當(dāng)溫度低于-60 ℃時(shí)，有序狀態(tài)的冰晶減少；當(dāng)溫度低于-130 ℃時(shí)，水分子停止運(yùn)動(dòng)，保持原來的無序狀態(tài)，形成堅(jiān)硬、均質(zhì)的四塊結(jié)構(gòu)，這種現(xiàn)象叫玻璃化[26]。玻璃化狀態(tài)的精子不會(huì)出現(xiàn)原生質(zhì)嚴(yán)重脫水的現(xiàn)象而使細(xì)胞保持完整結(jié)構(gòu)，精子解凍后即可恢復(fù)運(yùn)動(dòng)能力?？箖鰟┰隰~類精子的超低溫冷凍保存中必須加入，適當(dāng)抗凍劑的加入，可以有效減少精子冷凍過程中的冷凍損傷，有效地保護(hù)精子，達(dá)到長期冷凍保存的目的?？箖鰟┰谌芤褐幸捉Y(jié)合水分子，發(fā)生水合作用，使溶液的粘性增加，從而弱化水的結(jié)晶作用，減少冰晶的形成，達(dá)到保護(hù)凍存精子的目的[12]。常用的防凍劑主要包括兩大類:滲透性防凍劑和非滲透性防凍劑。滲透性防凍劑是一類含有-OH 基的小分子化合物，如丙三醇、二甲亞砜、乙二醇、1,3-丙二醇等，它們可以自由通過細(xì)胞膜;非滲透性防凍劑是一類不能透過細(xì)胞膜的大分子物質(zhì)，如卵黃、糖類、脂蛋白等，主要增加細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和緩解冷凍損傷。不同物種精子的抗凍劑選擇應(yīng)根據(jù)預(yù)試驗(yàn)、或逐個(gè)試驗(yàn)篩選其對該物種精子冷凍保護(hù)效果[27]。

精子在超低溫(-196 ℃)條件下，其運(yùn)動(dòng)和代謝活動(dòng)完全停止，精子處于假死狀態(tài)，但其結(jié)構(gòu)完整，生命以靜止?fàn)顟B(tài)保存下來。達(dá)氏鱘精液超低溫保存將在達(dá)氏鱘人工繁殖中雌雄親魚成熟不同步、擴(kuò)大苗種生產(chǎn)，避免近親交配，建立達(dá)氏鱘冷凍精子庫，穩(wěn)定遺傳性狀和種質(zhì)資源保等方面有著重要意義。低溫冷凍技術(shù)不僅能夠保護(hù)達(dá)氏鱘這一珍稀物種、提高其繁殖潛力和進(jìn)行異地或異時(shí)受精成為可能以外，還能為達(dá)氏鱘種質(zhì)資源保護(hù)和生物多樣性的保護(hù)開辟了新途徑，為達(dá)氏鱘的遺傳育種和現(xiàn)代生物技術(shù)的研究長期不間斷的提供生物材料等方面也具有重要的意義。

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EffectsofSomeDifferentCryoprotectantsonSpermMotilityandMovementTimeofAcipenserdabryanus

HE Bin1,2,CHEN Yan-ling1,LONG Zhi-hai1,YAN Jun-gang1,ZHAO Feng-qi1,XIA Mei3,CHEN Xian-jun1*

(1.Fisheries Institute Sichuan Academy of Agricultural Sciences,Sichuan Yibin 644000,China; 2.Sichuan Provincial Laboratory for Biotic Resource Protection and Sustainable Utilization,Sichuan Chengdu 610041,China; 3.Shiqian County of Guizhou Animal Husbandry Centre of Development,Guizhou Shiqian 555100,China.)

【Objective】The present paper was to study the effects of different concentrations of cryoprotectants on the sperm motility,life-span and movement time ofAcipenserdabryanus.【Method】Six kinds cryoprotectants of 4 %Methanol,8 %Ethyleneglycol,12 %Propanediol,6 %Glycerol,20 %N,N-Dimethylformamide and 24 %Dimethyl sulfoxide were respectively conducted with sperm diluents (0.7 % NaCl+0.02 % KCl+3.5 % Glu),and the sperm by cryoprotectants was preserved 16 hours at 4 ℃ and activated.【Result】The sperm ofAcipenserdabryanushad sperm motility and life-span with 4 %-24 % cryoprotectant(Glycerol,N,N-Dimethylformamide and Dimethyl Sulfoxide) and 4 %-16 % cryoprotectant(Methanol,Ethyleneglycol and Propanediol),but the all sperm was died with 20 %-24 % cryoprotectant(Methanol,Ethyleneglycol and Propanediol).The sperm motility was 82 %,32 %,76 %,64 %,72 % and 67 %,respectively when 8 % Methanol,8 % Ethyleneglycol,12 % Propanediol,4 % Glycerol,4 % N,N-Dimethylformamide and 8 % Dimethyl sulfoxide were applied,The drastic movement time and life-span of the sperm were the longest and respectively achieved 42 and 205 s,16 and 123 s,36 and 127 s,25 and 96 s,27 and 132 s,25 and 103 s.As compared with other cryoprotectants,the drastic movement time and life-span of the sperm were the longest and respectively achieved 42 and 205 s with 8 % Methanol.【Conclusion】Six kinds of cryoprotectants could produce toxicity on the sperm,and the motility and life-span of the sperm could be reduced after preserved by these cryoprotectants.

Acipenserdabryanus; Cryoprotectant; Sperm motility; Movement time

1001-4829(2017)4-0962-07

10.16213/j.cnki.scjas.2017.4.040

2015-07-15

四川省財(cái)政基因工程青年基金項(xiàng)目(2013QNJJ-015)

何 斌 (1978-)，男，四川宜賓人，助理研究員，主要研究方向?yàn)樗a(chǎn)健康增養(yǎng)殖及魚類資源生態(tài)，E-mail: shuichans123@126.com，*為通訊作者：陳先均，主要研究方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物人工繁育，E-mail: chen-xianjun@163.com。

S965.215

A

(責(zé)任編輯 陳 虹)