崔佳雯+++馬書(shū)杰++褚立希

[摘要] 目的 探討針刺百會(huì)穴結(jié)合游泳訓(xùn)練對(duì)大腦中動(dòng)脈缺血再灌注大鼠認(rèn)知功能的影響。 方法 將SD大鼠手術(shù)制成右側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型，將手術(shù)模型成功后的28只大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)定及水迷宮測(cè)試后按照隨機(jī)數(shù)字表分為模型組、針刺組、游泳組和針游結(jié)合組，每組7只；另設(shè)假手術(shù)組7只。假手術(shù)組及模型組不給予任何治療；針刺組給予百會(huì)穴針刺治療，1次/d；游泳組給予游泳訓(xùn)練，1次/d；針游結(jié)合組給予針刺百會(huì)穴結(jié)合游泳訓(xùn)練，1次/d。共治療6 d。每天治療前測(cè)量體重進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，治療6 d后進(jìn)行水迷宮測(cè)試其學(xué)習(xí)記憶能力，測(cè)試結(jié)束取腦，采用TUNEL染色觀察海馬區(qū)細(xì)胞凋亡情況。 結(jié)果 治療后針刺和游泳治療無(wú)明顯交互作用（P > 0.05），但針游結(jié)合組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分低于模型組（P < 0.05）；針游結(jié)合組大鼠水迷宮穿越平臺(tái)次數(shù)多于模型組（P < 0.05）。 結(jié)論 針刺結(jié)合游泳訓(xùn)練對(duì)于大腦中動(dòng)脈缺血再灌注大鼠認(rèn)知功能的影響可能優(yōu)于單純針刺或游泳，需要更深入的研究探索。

[關(guān)鍵詞] 大腦中動(dòng)脈缺血再灌注；大鼠；針刺；游泳訓(xùn)練；Morris水迷宮；海馬區(qū)；細(xì)胞凋亡

[中圖分類號(hào)] R743.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）09（b）-0025-04

The influence of acupuncture combined with swimming training for the cognitive function in middle cerebral artery ischemia-reperfusion rats

CUI Jiawen MA Shujie CHU Lixi

College of Rehabilitation Medicine， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 201203， China

[Abstract] Objective To observe the influence of acupuncture combined with swimming training for the cognitive function in middle cerebral artery ischemia-reperfusion rats. Methods SD rats were made into the model of right middle cerebral artery ischemia-reperfusion. After evaluation of neurological function test and water maze test operation， the 28 successful model rats were divided into model group， acupuncture group， swimming training group， and integrated acupuncture and swimming training group by random number table， with 7 rats in each group， 7 rats of sham-operation group were set separately. There was no treatment for sham-operation group and model group， the acupuncture group was given acupuncture therapy on GV 20， once per day， while the swimming training group was given swimming training， once per day， and integrated acupuncture and swimming training group was given integrated acupuncture therapy on GV 20 and swimming training， once per day. Total treatment time was 6 days. Each day before treatment， weight and neural functional test were evaluated. After treatment for 6 days， water maze test was detected for the ability of learning and remembering， after all treatment and evaluation， the brains were taken， then TUNEL staining was used to observe the cell apoptosis in hippocampus. Results After treatment， there was no interactive effect between acupuncture and swimming training （P > 0.05）， the neural function score of integrated acupuncture and swimming training group was lower than that of model group （P < 0.05）， the number of step through in water maze test of integrated acupuncture and swimming training group was more than that of model group （P < 0.05）. Conclusion The influence of acupuncture and swimming training for the cognitive function in middle cerebral artery ischemia-reperfusion rats may be better than acupuncture or swimming training only， more research needs to be done in the future.endprint

[Key words] Middle cerebral artery ischemia-reperfusion； Rats； Acupuncture； Swimming training； Morris water maze； Hippocampus； Cell apoptosis

研究表明，腦卒中后認(rèn)知功能障礙的發(fā)生率可達(dá)72.5%[1]。腦卒中患者的認(rèn)知功能可以提高患者的理解力和執(zhí)行力，從而提高康復(fù)效益[2]。因此腦卒中后的認(rèn)知功能損害越來(lái)越受到重視，同時(shí)也已成為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域當(dāng)前研究發(fā)展的重點(diǎn)[3]。Quaney等[4]研究表明有氧運(yùn)動(dòng)能提高腦卒中患者的信息處理速度、運(yùn)動(dòng)學(xué)習(xí)能力、內(nèi)隱記憶和運(yùn)動(dòng)功能。針灸可通過(guò)改善血液流變性障礙、調(diào)節(jié)中樞膽堿能遞質(zhì)、調(diào)節(jié)神經(jīng)肽、調(diào)節(jié)血管活性物質(zhì)功能、清除自由基、阻止細(xì)胞凋亡、保護(hù)神經(jīng)元等途徑改善患者認(rèn)知功能[5-7]。針刺配合康復(fù)訓(xùn)練能夠改善腦卒中后認(rèn)知障礙，降低血漿皮質(zhì)醇含量，且療效優(yōu)于尼莫地平治療[8]。本研究主要探討針刺結(jié)合有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)腦卒中大鼠認(rèn)知功能的影響，為更深入的認(rèn)知改善機(jī)制的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

選取健康雄性200～220 g SD大鼠，手術(shù)制成右側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型，將手術(shù)模型成功后的28只大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)定及水迷宮測(cè)試后，采用數(shù)字隨機(jī)法將其分為模型組、針刺組、游泳組和針游結(jié)合組，每組7只；另設(shè)假手術(shù)組7只。

模型組大鼠術(shù)后飼養(yǎng)于普通鼠籠，不予任何治療；游泳組于水迷宮評(píng)估后1 d開(kāi)始每天給予1次游泳訓(xùn)練；針刺組于水迷宮評(píng)估后1 d開(kāi)始每天給予1次百會(huì)穴針刺治療；針游結(jié)合組于水迷宮評(píng)估后1 d開(kāi)始每天針刺百會(huì)穴結(jié)合游泳訓(xùn)練1次，各組均治療6 d。

1.2 主要試劑及儀器

材料：云龍牌無(wú)菌針灸針0.25 mm×25 mm：吳江市云龍醫(yī)療器械有限公司。試劑：10%水合氯醛：上海國(guó)藥集團(tuán)（批號(hào)：20160427）；原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記染色（TUNEL）試劑盒：Roche公司（批號(hào)：11684817910）。儀器：Morris水迷宮（Morris-water-maze，MWM），包括水池和站臺(tái)、CCD攝像頭、視頻采集卡、MWM視頻分析軟件（貨號(hào)：DigBehv001動(dòng)物行為分析系統(tǒng)）：上海吉量軟件科技有限公司產(chǎn)品；正置顯微鏡：OLYMPUS公司（型號(hào)：CX41）；IMS圖像分析系統(tǒng)：基爾頓生物科技（上海）有限公司。

1.3 動(dòng)物模型制作

大鼠仰臥固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，10%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.35 mL/100 g），用改良的Zea Longa's線栓法[9]阻斷大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈制作大腦中動(dòng)脈缺血再灌注局灶性腦缺血模型，2 h后拔去線栓再灌注。模型制作24 h取腦，切片，以TTC染色證明造模方法的有效性[10]。將神經(jīng)功能評(píng)分為1、2、3分的大鼠納入實(shí)驗(yàn)研究，0、4分大鼠予以剔除。

1.4 神經(jīng)功能評(píng)分

參照Longa等[9]推薦的5分法對(duì)再灌注1 d的模型大鼠進(jìn)行評(píng)分：0分：無(wú)神經(jīng)損傷；1分：不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分：向栓塞對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：向栓塞對(duì)側(cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。

1.5 Morris水迷宮測(cè)試

于治療前后對(duì)各組大鼠進(jìn)行水迷宮測(cè)試[11]。MWM為直徑160 cm、高50 cm的圓形水池，池壁黑色，水深23 cm，水溫保持在（22±2）C°，在第Ⅳ象限距池壁35 cm處放置直徑為9 cm的圓形黑色站臺(tái)，站臺(tái)位于水面下2 cm，試驗(yàn)前水中加入適量碳素墨汁，使大鼠無(wú)法看到水面以下平臺(tái)。室內(nèi)溫度高于水溫5 C°以上，光照恒定，無(wú)光線直射池內(nèi)，分別予定位航行試驗(yàn)，記錄大鼠從入水至找到平臺(tái)所用時(shí)間（逃避潛伏期）；以及去掉平臺(tái)后的空間探索試驗(yàn)，記錄大鼠在原平臺(tái)處穿越次數(shù)。

1.6 針刺百會(huì)穴

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[12-13]選取百會(huì)。方法：百會(huì)穴向后斜刺2 mm，留針20 min，共治療6 d。

1.7 游泳訓(xùn)練

取一邊長(zhǎng)為1 m的正方體容器，水位50 cm，將游泳組及針游結(jié)合組大鼠置于其中游泳20 min，各治療6 d。

1.8 TUNEL染色

取材固定后，將其洗滌、脫水、透明、浸蠟包埋、切片后進(jìn)行TUNEL染色，具體流程如下：①脫蠟：65℃、30 min；二甲苯Ⅰ 10 min、二甲苯Ⅱ 10 min；②水化：將脫蠟后的切片經(jīng)100%乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇、雙蒸水各3 min；③消化：將玻片浸入胰蛋白酶內(nèi)消化40 min，PBS洗3 min×3次；④制備TUNEL反應(yīng)混合液；⑤加50 μL TUNEL反應(yīng)混合液于標(biāo)本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng)37℃反應(yīng)1 h；PBS洗3 min×3次；⑥加50 μL POD于標(biāo)本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應(yīng)37℃×30 min，PBS洗3 min×3次；⑦DAB染色3～10 min，自來(lái)水沖洗，蘇木精復(fù)染，1%鹽酸酒精分化，顯微鏡下觀察，控制染色程度；⑧脫水：75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、100%乙醇，逐級(jí)脫水，各3 min；⑨透明：二甲苯透明3 min×2次；⑩中性樹(shù)膠封片。最后通過(guò)200×顯微鏡采集分析樣本，計(jì)算凋亡率，被染為深棕色的為凋亡細(xì)胞，正常細(xì)胞很少能夠被染色。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0版統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組計(jì)量資料采用完全隨機(jī)方差分析，各組治療后各計(jì)量資料采用2×2析因設(shè)計(jì)的方差分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后動(dòng)物存亡數(shù)endprint

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，假手術(shù)組動(dòng)物7只，死亡0只；模型組動(dòng)物剩余6只，死亡1只；針刺組動(dòng)物5只，死亡2只；游泳組動(dòng)物6只，死亡1只；針游結(jié)合組動(dòng)物5只，死亡2只。

2.2 治療前假手術(shù)組和模型組各項(xiàng)指標(biāo)比較

治療前假手術(shù)組和模型組神經(jīng)功能評(píng)分、WMW逃避潛伏期和穿越平臺(tái)次數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），證明造模成功。見(jiàn)表1。

2.3 治療前各手術(shù)組各項(xiàng)指標(biāo)比較

治療前模型組、針刺組、游泳組及針游結(jié)合組神經(jīng)功能評(píng)分、WMW逃避潛伏期和穿越平臺(tái)次數(shù)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），提示各手術(shù)組治療前基線一致。見(jiàn)表2。

2.4 治療后各組間各項(xiàng)指標(biāo)比較

治療后，模型組（不使用針刺和游泳）樣本量為6只，針刺組（使用針刺不使用游泳）樣本量為5只，游泳組（不使用針刺使用游泳）樣本量為6只，針游結(jié)合組（使用針刺使用游泳）樣本量為5只。模型組、針刺組、游泳組及針游結(jié)合組神經(jīng)功能評(píng)分、WMW逃避潛伏期和穿越平臺(tái)次數(shù)比較，無(wú)交互影響。見(jiàn)表3～6。

2.5 治療后模型組和針游結(jié)合組各項(xiàng)指標(biāo)比較

模型組與針游結(jié)合組各項(xiàng)指標(biāo)比較，神經(jīng)功能評(píng)分及穿越平臺(tái)次數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），提示針游結(jié)合組治療后存在一定的陽(yáng)性趨勢(shì)。見(jiàn)表7。

2.6 治療后TUNEL染色所示各組海馬區(qū)細(xì)胞凋亡情況

治療后假手術(shù)組、模型組、針刺組、游泳組及針游結(jié)合組海馬區(qū)TUNEL染色后放大200倍的情況，被染為深棕色的為凋亡細(xì)胞，未被染色的為正常細(xì)胞，根據(jù)染色情況而計(jì)算出凋亡比率。見(jiàn)圖1（封三）。

3 討論

針刺治療可改善卒中后抑郁大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，提高卒中后抑郁大鼠模型海馬區(qū)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）水平[14]；電針對(duì)提高腦卒中后大鼠認(rèn)知功能和減少梗阻面積具有顯著療效[15]，其中電針百會(huì)、神庭穴等能通過(guò)調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞瘤-2基因以及相關(guān)X蛋白有顯著改善認(rèn)知的效果[16]。有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)提高腦卒中患者認(rèn)知能力，尤其對(duì)于記憶、注意和視覺(jué)空間認(rèn)知有一定的效果[17]；有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，中強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)于認(rèn)知測(cè)試有實(shí)際療效[18]。早期針灸聯(lián)合康復(fù)治療方案可提高老年腦卒中患者的治療效果，促進(jìn)患者認(rèn)知功能和日常生活能力的提高[19]；針灸結(jié)合康復(fù)治療對(duì)腦卒中后的認(rèn)知障礙有交互作用[20]。我們希望通過(guò)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的研究找到針刺結(jié)合有氧運(yùn)動(dòng)改善腦卒中患者認(rèn)知障礙的基本機(jī)制，為臨床治療提供可資參考的依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)雖然由于各組均有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的死亡而致樣本量不足，通過(guò)雙因素的方差分析沒(méi)有明顯差異，但各項(xiàng)指標(biāo)的均值還是存在著陽(yáng)性趨勢(shì)，說(shuō)明針游結(jié)合有較單純針刺及單純游泳更佳療效的趨勢(shì)。針游結(jié)合組和模型組間治療后神經(jīng)功能評(píng)分和穿越平臺(tái)次數(shù)有顯著差異，說(shuō)明針游結(jié)合確實(shí)具有一定療效，而其與單純針刺和單純游泳的療效對(duì)比仍需待進(jìn)一步研究探索。

本研究認(rèn)為針游結(jié)合組對(duì)于大腦中動(dòng)脈缺血再灌注大鼠認(rèn)知功能的影響可能優(yōu)于單純針刺或單純游泳組，此種方法可以在今后的實(shí)驗(yàn)中擴(kuò)大樣本量，繼續(xù)深入探索。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 凌小林.腦卒中后認(rèn)知功能障礙的研究進(jìn)展[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生，2013，51（17）：22-25.

[2] 張婷，高曉平.腦卒中后認(rèn)知功能障礙的康復(fù)治療予進(jìn)展[J].安徽醫(yī)藥，2013，17（8）：1414-1415.

[3] 張衛(wèi)，惲?xí)云?缺血性腦卒中與認(rèn)知功能障礙[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐，2011，17（6）：540-542.

[4] Quaney BM，Boyd LA，McDowd JM，et al. Aerobic exercise improves cognition and motor function post stroke [J]. Neurorehabil Neural Repair，2009，23（9）：879-885.

[5] 董萍，馮小閔，于濤，等.針灸治療血管性癡呆的機(jī)理研究進(jìn)展[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2011，29（6）：1252-1253.

[6] 何峰，史洪潤(rùn)，李振，等.針灸治療血管性癡呆的技術(shù)方法及其作用機(jī)制[J].中國(guó)臨床康復(fù)，2005，9（28）：160-162.

[7] Chou P，Chu H，Lin JG. Effects of electroacupuncture treatment on impaired cognition and quality of life in Taiwanese stroke patients [J]. J Altern Complement Med，2009， 15（10）：1067-1073.

[8] 唐強(qiáng)，朱路文，王艷.針灸配合康復(fù)訓(xùn)練干預(yù)腦卒中后認(rèn)知障礙療效觀察[J].上海針灸雜志，2012，31（8）：566-567.

[9] Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats [J]. Stroke，1989，20（1）：84-91.

[10] 張蕾，王磊，韓笑，等.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)缺血性腦卒中模型大鼠行為學(xué)影響的研究[J].南通大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2013，33（3）：161-165.

[11] Morris R. Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat [J]. J Neurosci Methods，1984，11（1）：47-60.endprint

[12] 華興邦，周浩良.大鼠穴位圖譜的研制[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，1991（1）：1-5.

[13] 駱仲達(dá).電針督脈對(duì)缺血性腦損傷大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響[J].安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，21（6）：27-30.

[14] 蔡麗，劉毅，陸小青.針刺對(duì)卒中后抑郁大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能及海馬CA3區(qū)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的影響[J].上海針灸雜志，2016，35（4）：462-465.

[15] Zhang Y，Lin R，Tao J，et al. Electroacupunctureimproves cognitiveabilityfollowing cerebral ischemia reperfusion injury via CaM-CMKIV-CREB signaling in the rat hippocampus [J]. Exp Ther Med，2016，12（2）：777-782.

[16] Liu F，Jiang YJ，Zhao HJ，et al. Electroacupuncture ameliorates cognitive impairment and regulates the expression of apoptosis-related genes Bcl-2 and Bax in rats with cerebral ischaemia-reperfusion injury [J]. Acupunct Med，2015，33（6）：478-484.

[17] Zheng G，Zhou W，Xia R，et al. Aerobic Exercises for Cognition Rehabilitation following Stroke：A Systematic Review [J]. J Stroke Cerebrovasc Dis，2016，25（11）：2780-2789.

[18] Hasan SM，Rancourt S，Austin MW，et al. Defining optimal aerobic exerciseparameters to affect complex motor and cognitiveoutcomes after stroke：a systematic review and synthesis [J]. Neural Plast，2016，2016（6）：2961573.

[19] 邱茜茜，王黎明，陳惠霞.早期針灸聯(lián)合康復(fù)治療對(duì)老年腦卒中患者認(rèn)知功能及日常生活能力的影響[J].河南醫(yī)學(xué)研究，2016，25（10）：1801-1802.

[20] Jiang C，Yang，Tao J，et al. Clinical efficacy of acupuncture treatment in combination with rehacomcognitive training for improving cognitivefunction in stroke：a 2×2 factorial designrandomizedcontrolled trial [J]. J Am Med Dir Assoc，2016，17（12）：1114-1122.

（收稿日期：2017-05-22 本文編輯：張瑜杰）endprint