岳竹君+王文娟+賈富霞

[摘要] 目的 觀察益髓生血顆粒對輻射損傷小鼠骨髓細(xì)胞CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α（C/EBPα）、粒-單系祖細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）、粒-單系祖細(xì)胞集落刺激因子受體α（GM-CSFRα）、轉(zhuǎn)錄因子MAFB mRNA表達(dá)的影響，探討該藥調(diào)控骨髓造血的作用機(jī)制。 方法 采用隨機(jī)數(shù)字表法將78只雄性昆明小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、粒系祖細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）組及益髓生血顆粒高、中、低劑量組。益髓生血顆粒高、中、低劑量組先預(yù)防給藥2 d，分別按12、6、3 g/（kg·d）灌胃。采用60Co-γ射線全身一次性照射造模。造模第2天，G-CSF組按30 μg/（kg·d）皮下注射G-CSF注射液，益髓生血顆粒高、中、低劑量組給藥方法同預(yù)防給藥，其余組均給予等量蒸餾水，連續(xù)14 d。進(jìn)行小鼠骨髓細(xì)胞計(jì)數(shù)；采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Q-PCR）檢測骨髓細(xì)胞C/EBPα、GM-CSF、GM-CSFRα、MAFB mRNA表達(dá)。 結(jié)果 益髓生血顆粒能明顯提高輻射損傷小鼠骨髓細(xì)胞計(jì)數(shù)（均P < 0.05），上調(diào)骨髓細(xì)胞GM-CSF、GM-CSFRα、MAFB mRNA表達(dá)（均P < 0.05），以低劑量組效果最佳。 結(jié)論 益髓生血顆?？纱龠M(jìn)骨髓造血，其機(jī)制與上調(diào)骨髓細(xì)胞GM-CSF、GM-CSFRα、MAFB mRNA表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 益髓生血顆粒；輻射損傷；CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α；粒-單系祖細(xì)胞集落刺激因子；粒-單系祖細(xì)胞集落刺激因子受體α；MAFB；基因表達(dá)

[中圖分類號] R818.02 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）09（a）-0017-06

[Abstract] Objective To study the influence of Yisui Shengxue Granules on CCAAT/enhancer binding protein α （C/EBPα）， granulocyte-macrophage colon stimulating factor （GM-CSF）， granulocyte-macrophage colon stimulating factor receptor alpha （GM-CSFRα） and transcription factor MAFB mRNA expression in bone marrow cells of mice irradiated by 60Co-γ rays， and to explore its mechanism of promoting bone marrow hematopoiesis. Methods Seventy-eight male Kunming mice were randomly divided into normal control group， model group， granulocyte-colony stimulating factor （G-CSF） group， low-dose， middle-dose and high-dose Yisui Shengxue Granules group. Two days before modeling， mice in low-dose， middle-dose and high-dose Yisui Shengxue Granules group received 12， 6， 3 g/（kg·d） Yisui Shengxue Granules ig respectively. On modeling day except normal control group， mice were established by 60Co-γ ray in other five groups. The 2nd day after modeling， mice in G-CSF group received 30 μg/（kg·d） G-CSF by injection， mice in normal control group and model group received the same volume distilled water， mice in low-dose， middle-dose and high-dose Yisui Shengxue Granules group received the same way as before modeling， the course lasted 14 days. Bone marrow cells were counted. The mRNA expression of C/EBPα， GM-CSF， GM-CSFRα and MAFB in BM cells was analyzed by real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction. Results The data showed that， Yisui Shengxue Granules could increase the count of bone marrow cells of mice irradiated by 60Co-γ rays （all P < 0.05）， and up-regulate the mRNA expression of GM-CSF， GM-CSFRα and MAFB in BM cells （all P < 0.05）. The effect of low-dose Yisui Shengxue Granules group was the best. Conclusion These results suggest that Yisui Shengxue Granules can promote bone marrow hematopoiesis， the mechanism may have some relation to up-regulating the mRNA expression of GM-CSF， GM-CSFRα and MAFB in BM cells.endprint

[Key words] Yisui Shengxue Granules； Radiation damage； CCAAT/enhancer binding protein α； Granulocyte-macrophage colon stimulating factor； Granulocyte-macrophage colon stimulating factor receptor alpha； MAFB； mRNA expression

益髓生血顆粒是基于中醫(yī)“腎藏精生髓、髓生血”理論而組方的中藥復(fù)方制劑，具有補(bǔ)腎健脾、益髓生血的功效。前期研究已證實(shí)該藥對各類貧血均具有一定的改善作用，能明顯促進(jìn)紅細(xì)胞、白細(xì)胞生成，有效提升血紅蛋白水平[1-3]。相關(guān)機(jī)制研究表明，該藥能明顯促進(jìn)骨髓造血，促進(jìn)紅系、粒系分化，調(diào)控細(xì)胞周期，并提升骨髓微環(huán)境中干細(xì)胞因子（SCF）、白細(xì)胞介素-3（IL-3）、粒-單系祖細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）、粒系祖細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）等造血生長因子含量[4-7]。為進(jìn)一步明確益髓生血顆粒促進(jìn)骨髓造血細(xì)胞向紅系、粒系分化的具體機(jī)制，本研究采用小鼠骨髓急性輻射損傷模型，以益髓生血顆粒進(jìn)行干預(yù)，通過觀察各組間骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)，檢測紅系、粒系分化相關(guān)因子的基因表達(dá)來明確該藥的具體作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

健康雄性昆明種小鼠，體重（20±2）g（4周齡），SPF級，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號SCXK（京）2009-0007。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物送達(dá)后于清潔級動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d，正常飼料喂養(yǎng)，自由攝食、飲水，飼養(yǎng)溫度（22±1）℃，濕度40%～70%，噪聲<60 dB，換氣次數(shù)10～20次/min，光照模擬晝夜交替，光照時(shí)間每天12 h。本研究已獲得單位倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 藥物與試劑

益髓生血顆粒（益髓生血顆粒），由山茱萸、制何首烏、熟地、補(bǔ)骨脂、炙黃芪、黨參、阿膠、當(dāng)歸、雞血藤、鱉甲、砂仁組成，藥物比例、制備工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)均參照專利No.CN200610078866.X，中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院大興制藥廠生產(chǎn)，12 g/袋，生藥含量23.6 g（批號20110506）；重組人粒細(xì)胞刺激因子（G-CSF）注射液，廈門特寶生物工程股份有限公司生產(chǎn)，75 μg/瓶（批號201111B45）；分析純氯仿、異丙醇、無水乙醇，均購自北京化學(xué)試劑公司；Trizol試劑，購自美國Invitrogen公司（批號14105）；Fermentas K1622 RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自美國MBI公司（批號00044977）；SYBR Green PCR Master Mix試劑盒，購自美國應(yīng)用生物公司（批號1201329）。

1.3 儀器

鈷-60（60Co）遠(yuǎn)距離治療機(jī)（中國核動(dòng)力院設(shè)備制造廠生產(chǎn)）；7900HT型熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；DU-600紫外分光光度計(jì)（BECKMAN公司）；高速冷凍離心機(jī)（BECKMAN公司）。

1.4 分組、造模與給藥

采用隨機(jī)數(shù)字表法將78只小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、G-CSF組和益髓生血顆粒高、中、低劑量組，每組13只。造模前，益髓生血顆粒高、中、低劑量組先預(yù)防給藥2 d，分別按12 g/（kg·d）（藥液濃度1.2 g/mL，為臨床成人日劑量的20倍）、6 g/（kg·d）（藥液濃度0.6 g/mL，為臨床成人日劑量的10倍）、3 g/（kg·d）（藥液濃度0.3 g/mL，為臨床成人日劑量的5倍）灌胃。造模當(dāng)日采用60Co-γ射線全身一次性照射造成小鼠骨髓急性損傷，照射劑量為3.5 Gy，劑量率為1.31 Gy/min。造模第2天，G-CSF組按30 μg/（kg·d）（注射容積10 mL/kg）皮下注射G-CSF注射液，益髓生血顆粒高、中、低劑量組給藥方法同預(yù)防給藥，其余各組給予等量蒸餾水，連續(xù)14 d。

1.5 骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)

頸椎脫臼處死小鼠，剝?nèi)⌒∈髢蓚?cè)股骨，用剪刀剪開股骨兩頭，暴露骨髓腔，用無菌注射器4號針頭吸取2 mL PBS液（0.1 mol/L，pH 7.4），反復(fù)沖洗骨髓腔，收集骨髓細(xì)胞。

將骨髓細(xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液，取10 μL單細(xì)胞懸液，加990 μL生理鹽水，吹打混勻。取10 μL混合液，從血細(xì)胞計(jì)數(shù)板邊緩緩滴入，使之充滿計(jì)數(shù)板和蓋片之間的空隙，注意不要出現(xiàn)氣泡。于10×10倍低倍鏡下分別計(jì)數(shù)4個(gè)大方格中細(xì)胞數(shù)。每毫升細(xì)胞數(shù)=（4大方格內(nèi)細(xì)胞數(shù)/4）×104×稀釋倍數(shù)100。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Q-PCR）檢測骨髓細(xì)胞CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α（C/EBPα）、GM-CSF、粒-單系祖細(xì)胞集落刺激因子受體α（GM-CSFRα）、轉(zhuǎn)錄因子MAFB mRNA表達(dá)

1.6.1 RNA提取 將骨髓細(xì)胞懸液以2500 r/min（r = 14 cm）離心10 min去上清，分別加入1 mL Trizol裂解細(xì)胞，吹打混勻后按照Trizol試劑說明書提取骨髓細(xì)胞總RNA。以紫外分光光度計(jì)及1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的含量、純度及完整性。

1.6.2 cDNA合成 按照Fermentas K1622 RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行cDNA合成。取總RNA樣品1～5 μg，用DEPC水稀釋成11 μL，加入OligoDT 1 μL，于65℃加熱變性5 min，快速在冰上冷卻，加入5×Reaction Buffer 4 μL、RNA Inhibitor 1 μL、10 mmol/L dNTPs 2 μL、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL，反應(yīng)總體積為20 μL，于42℃反應(yīng)60 min，70℃加熱10 min終止反應(yīng)。

1.6.3 Q-PCR反應(yīng) 按照SYBR Green PCR Master Mix試劑盒說明書，在7900HT型熒光定量PCR儀上進(jìn)行Q-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系：cDNA 1 μL，10 μmol/L上游引物1 μL，10 μmol/L下游引物1 μL，2×SYBR Green PCR Mix 10 μL，加DEPC水至總體積20 μL。引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成，引物序列見表1。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參基因。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性35 s，53℃退火35 s，72℃延伸50 s，共40個(gè)循環(huán)；72℃后延伸8 min。整個(gè)反應(yīng)過程中收集熒光信號，反應(yīng)結(jié)束后使用PCR儀自帶軟件分析PCR過程中每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)熒光信號到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，即循環(huán)閾值（Ct值）。做熔解曲線判斷PCR反應(yīng)的特異性，做擴(kuò)增曲線判斷PCR的擴(kuò)增效果。endprint

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布者，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。多組間差異的顯著性分析，符合正態(tài)分布者采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)推斷，非正態(tài)分布者采用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)推斷。組間比較，方差齊采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊采用Dunnett's T檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)

經(jīng)單因素方差分析及LSD檢驗(yàn)，結(jié)果顯示：造模小鼠骨髓有核細(xì)胞數(shù)均恢復(fù)至正常組水平，但益髓生血顆粒高、中、低劑量組骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于模型組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.01）。說明益髓生血顆粒能有效提高輻射損傷小鼠骨髓有核細(xì)胞數(shù)，對骨髓造血具有一定的促進(jìn)作用。各組小鼠骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)見表2。

2.2 骨髓細(xì)胞C/EBPα、GM-CSF、GM-CSFRα、MAFB mRNA表達(dá)水平

GAPDH、C/EBPα、MAFB的熔解曲線均為單一峰，并且沒有加寬和變形，說明為特異性片段擴(kuò)增；GM-CSF、GM-CSFRα的熔解曲線主峰后面出現(xiàn)小峰，經(jīng)瓊脂糖電泳證實(shí)是引物二聚體所致，與退火溫度偏低有關(guān)。各基因的擴(kuò)增曲線均指數(shù)擴(kuò)增期明顯，表現(xiàn)出較為理想的擴(kuò)增曲線，表明本研究數(shù)據(jù)足夠應(yīng)用于基因的相對定量分析。各基因的熔解曲線及擴(kuò)增曲線見圖1～5。

采用2-ΔΔCT法進(jìn)行基因的相對定量分析。經(jīng)單因素方差分析及LSD檢驗(yàn)，結(jié)果顯示：各組小鼠骨髓細(xì)胞C/EBPα mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P > 0.05）；益髓生血顆粒低劑量組小鼠骨髓細(xì)胞GM-CSF mRNA表達(dá)明顯高于正常組及模型組（均P < 0.05）；益髓生血顆粒低劑量組小鼠骨髓細(xì)胞GM-CSFRα mRNA表達(dá)明顯高于正常組（P < 0.05）；益髓生血顆粒高、中、低劑量組小鼠骨髓細(xì)胞MAFB mRNA表達(dá)明顯高于正常組及模型組（均P < 0.05）。見表3。

3 討論

骨髓是對輻射極為敏感的組織，機(jī)體短時(shí)間內(nèi)受到超過一定劑量的輻射照射可引發(fā)骨髓造血功能嚴(yán)重受損，造血細(xì)胞有絲分裂停止，細(xì)胞更新中斷，外周血中各類血細(xì)胞數(shù)量劇烈下降。其中輻射誘導(dǎo)的造血干、祖細(xì)胞凋亡主要引發(fā)急性骨髓抑制，而其誘導(dǎo)的造血干細(xì)胞衰老及分化則可引發(fā)長期骨髓抑制[8-9]。中醫(yī)根據(jù)骨髓抑制患者面色蒼白、神疲乏力、頭昏眩暈、心悸失眠、食欲不振等臨床表現(xiàn)，多將該病癥歸屬于“血虛”“虛勞”等范疇[10-11]。中醫(yī)理論認(rèn)為，血液的生成離不開后天之本脾和先天之本腎，其中脾為氣血化生之源，而腎藏精生髓，髓又可化血。因此要改善骨髓抑制，應(yīng)當(dāng)從脾腎入手，以補(bǔ)腎健脾、益髓生血為基本治法。

益髓生血顆粒就是基于上述治法組方而成的中藥制劑，方中山茱萸、制何首烏、熟地、補(bǔ)骨脂、鱉甲補(bǔ)腎益精生血，炙黃芪、黨參、砂仁、阿膠、當(dāng)歸、雞血藤健脾開胃養(yǎng)血活血。臨床研究證實(shí)該藥能有效改善腫瘤放化療引發(fā)的骨髓抑制[1]。實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，益髓生血顆?？娠@著升高輻射損傷小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞、血小板數(shù)及血紅蛋白水平[12-13]，可通過促進(jìn)骨髓細(xì)胞由G0/G1期進(jìn)入S期而明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖[6]，還能顯著增加骨髓造血微環(huán)境中造血生長因子GM-CSF、IL-3、SCF含量[7]，說明益髓生血顆?？捎行Ц纳戚椛鋼p傷引發(fā)的急性骨髓抑制，具有促進(jìn)骨髓造血的作用。

為進(jìn)一步探討益髓生血顆粒促進(jìn)骨髓造血的機(jī)制，本研究采用小鼠骨髓急性輻射損傷模型，首先觀察了益髓生血顆粒對輻射損傷小鼠骨髓有核細(xì)胞的影響。相關(guān)研究顯示，經(jīng)輻射照射后小鼠骨髓有核細(xì)胞數(shù)明顯下降[14]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過一段時(shí)間的恢復(fù)，輻射損傷小鼠骨髓有核細(xì)胞數(shù)已恢復(fù)至正常水平，但益髓生血顆粒組小鼠骨髓有核細(xì)胞數(shù)明顯高于模型小鼠（P < 0.01），說明益髓生血顆粒能有效提高輻射損傷小鼠骨髓有核細(xì)胞數(shù)，對骨髓造血具有明顯的促進(jìn)作用。本研究選取了對骨髓造血細(xì)胞增殖分化具有重要作用的4個(gè)相關(guān)因子C/EBPα、GM-CSF、GM-CSFR、MAFB，對其在骨髓細(xì)胞中的基因表達(dá)水平進(jìn)行研究，其中C/EBPα在造血系統(tǒng)中只表達(dá)于髓系細(xì)胞，主要在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控粒系和單核系的分化[15-16]。GM-CSF是具有廣譜效應(yīng)的造血生長因子，對髓系造血祖細(xì)胞具有廣泛的促增殖活性，它通過與其高親和力受體GM-CSFR結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，二者結(jié)合后尤其對粒-單系血細(xì)胞具有重要調(diào)控作用[17-19]。MAFB可影響髓系前體細(xì)胞的增殖和分化[20]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，益髓生血顆粒對C/EBPα mRNA表達(dá)水平無明顯作用（P > 0.05），而對GM-CSF、GM-CSFRα、MAFB mRNA表達(dá)具有上調(diào)作用（均P < 0.05）。

綜上所述，本研究提示益髓生血顆粒能顯著促進(jìn)輻射損傷小鼠骨髓造血，其作用機(jī)制與上調(diào)骨髓細(xì)胞GM-CSF、GM-CSFRα、MAFB的mRNA表達(dá)和促進(jìn)髓系增殖分化有密切關(guān)系。

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（收稿日期：2017-05-04 本文編輯：張瑜杰）endprint