李靜靜，楊會(huì)鴿，范菲，劉金寶

（1.西安市食品藥品檢驗(yàn)所,陜西西安，710054;2.黑龍江省醫(yī)院南崗院區(qū)，黑龍江哈爾濱，150001）

技術(shù)交流Technical Exchange

川芎血清藥物化學(xué)成分研究

李靜靜1，楊會(huì)鴿1，范菲1，劉金寶2

（1.西安市食品藥品檢驗(yàn)所,陜西西安，710054;2.黑龍江省醫(yī)院南崗院區(qū)，黑龍江哈爾濱，150001）

通過(guò)藥物化學(xué)手段研究川芎的血清移行成分，以期為本藥品的有效成分鑒定、提取及用藥提供指導(dǎo)。制備對(duì)照組溶液及川芎灌胃液，建立大鼠模型，灌胃后提取血清，建立HPLC指紋圖譜，并鑒定血中移行成分。本次共檢出11個(gè)成分，其中4個(gè)成分屬于血清，川芎提取液灌胃后從血中發(fā)現(xiàn)了7個(gè)入血成分，其中4個(gè)為代謝產(chǎn)物，3個(gè)為原型成分。川芎入血成分主要為川芎嗪和阿魏酸，可為闡明川芎藥理作用及其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

川芎；血清藥物化學(xué)；指紋圖譜；高效液相色譜

前言

川芎是傘形科植物，川芎的根莖部分，早在《左傳》已有記載，《神農(nóng)本草經(jīng)》始作為藥物應(yīng)用于臨床[1]。本品苦溫，味辛，多產(chǎn)于四川、云南等地，為“血中之氣藥”，有行氣活血、止痛燥濕等功效[2]。本品辛香走竄，兼活血化瘀之功，因而既可行氣，又擅活血，不但是治療頭痛的良藥，還可入血海而調(diào)經(jīng)，是婦科良藥[3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實(shí)，本品的活性成分主要為川芎嗪及阿魏酸[4]。由于中藥多為口服給藥，通過(guò)消化吸收入血而發(fā)揮藥效,因而真正進(jìn)入血清的藥物成分才是真正發(fā)揮藥效的物質(zhì)[5]。為深入探討川芎的有效成分，我們采用藥物化學(xué)的研究方法，對(duì)川芎口服后的血清成分進(jìn)行分析，以期對(duì)川芎的主要藥效物質(zhì)進(jìn)行初步揭示。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑及藥品

川芎嗪(批號(hào)200305)、阿魏酸對(duì)照品(批號(hào)200611)由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；乙腈、甲醇為色譜純，水為重蒸水，磷酸為分析純。川芎購(gòu)自同仁堂有限責(zé)任公司，經(jīng)本院專家鑒定，符合《中國(guó)藥典》（2010年版）[6]規(guī)定。

1.2 儀器

日本島津公司生產(chǎn)的LC-20AT高效液相色譜儀；美國(guó)OHAUS儀器有限公司生產(chǎn)的AR140·C型電子天平及LC solution工作站；昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)的KQ-500E超聲波清洗器；上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn)的DZF-6050型真空干燥箱。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 制備對(duì)照組溶液及川芎灌胃液

分別取適量川芎嗪和阿魏酸，以甲醇定容至10 mL，再予以超聲10min作為對(duì)照品。川芎與95%乙醇1∶10回流提取2h，過(guò)濾并濃縮至0.5g/mL，再取1mL加甲醇稀釋至10mL，過(guò)濾后76℃下干燥24h，得川芎浸膏，溶于100mL水中作為灌胃液。

1.3.2 制備血清

本研究所采用的SD大鼠購(gòu)于本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重（200±20）g，隨機(jī)分為兩組。觀察組予以2 mL川芎灌胃，1次/d，連續(xù)給藥7d；對(duì)照組給予等量蒸餾水灌胃。于末次給藥0.5，1h后從眼眶取血，37℃水浴靜置24h，離心20min，取上清液。血清加入甲醇，超聲20min，沉淀除去蛋白，離心后取上清液，過(guò)濾后供HPLC分析。

1.3.3 血清指紋圖譜測(cè)定

色譜柱：Kromasil C18色譜柱（4.6mm× 150mm，5μm）；流動(dòng)相：A（0.05%磷酸）-B（乙腈）梯度洗脫，具體見(jiàn)表1；流速0.8mL/min；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)203nm；進(jìn)樣量10μL。取供試品及對(duì)照品溶液，按照上述條件，注入液相色譜儀，得到色譜圖。

表1 梯度洗脫程序Table1 The gradient elution program

1.3.4 方法學(xué)考察

1.3.4.1 精密度

同一溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。

1.3.4.2 穩(wěn)定性

同一溶液分別于0h，2h，4h，8h，12h，24h進(jìn)樣，記錄色譜圖。

1.3.4.3 重復(fù)性

同一批血樣，制備6份供試液，進(jìn)樣，記錄色譜圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜圖

根據(jù)色譜條件所得的空白血樣、空白血樣+對(duì)照品、川芎血樣色譜圖見(jiàn)圖1、2、3、4、5。

圖1 空白血樣HPLCFig.1 The HPLC of blank blood sample

圖2 白血樣+對(duì)照品HPLC 1.川芎嗪;2.阿魏酸Fig.2 The HPLC of blank blood sample and reference substance 1.ligustrazine;2.ferulic acid

圖3 川芎血樣HPLC（30min取血）1.川芎嗪;2.阿魏酸Fig.3 The HPLC of blood sample of ligusticum wallichii（blood is taken at 30min）1.ligustrazine;2.ferulic acid

圖4 川芎血樣HPLC（60min取血）1.川芎嗪;2.阿魏酸Fig.4 The HPLC of blood sample of ligusticum wallichii（blood is taken at 60min）1.ligustrazine;2.ferulic acid

圖5 川芎提取液體外HPLC 1.川芎嗪;2.阿魏酸Fig.5 The external HPLC of the extraction liquid of ligusticum wallichii 1.ligustrazine;2.ferulic acid

2.2 方法學(xué)考察結(jié)果

同一溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果各共有特征色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均＜1%，相對(duì)峰面積的RSD均＜3%，表明供試品進(jìn)樣精密度良好；同一溶液分別于0h，2h，4h，8h，12h，24h進(jìn)樣，結(jié)果各共有特征色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜1%，相對(duì)峰面積的RSD＜3%，表明供試品穩(wěn)定性良好；同一批血樣，制備6份供試液，進(jìn)樣，結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜1%，相對(duì)峰面積的RSD＜3%，表明本測(cè)定方法重復(fù)性良好。

2.3 血清指紋圖譜

根據(jù)峰數(shù)、峰面積積分值等相關(guān)參數(shù)確定共有指紋峰，選取特征指紋峰群建立川芎血清指紋圖譜，通過(guò)對(duì)所得色譜圖進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，川芎血樣中有11個(gè)色譜峰，其中1、2、4號(hào)峰屬于血清，3、5號(hào)峰分別為川芎嗪與阿魏酸；6號(hào)峰為蛋白峰，系血清殘留成分；7號(hào)峰屬于未知的藥物成分；與空白+對(duì)照品血樣比較，8、9、10、11號(hào)峰是新出現(xiàn)的，推測(cè)為川芎的代謝產(chǎn)物。見(jiàn)圖6。

圖6 川芎的血清指紋圖譜Fig.6 The serum fingerprint of ligusticum wallichii

2.7 表觀血清指紋圖譜

基于上述結(jié)果，對(duì)川芎提取液HPLC指紋圖譜中與血清移行成分相關(guān)的特征指紋峰進(jìn)行標(biāo)定，獲得表觀血清指紋圖譜，見(jiàn)圖7。該圖譜可表達(dá)血中移行成分。

圖7 川芎HPLC表觀血清指紋圖譜Fig.7 The apparent serum fingerprint of ligusticum wallichii

3 結(jié)論

由于中藥材的藥效與產(chǎn)地、炮制方法等密切相關(guān)，因而其質(zhì)量控制是科研的重要環(huán)節(jié)，也是近年來(lái)研究的重點(diǎn)[7]。隨著血清藥物化學(xué)在中醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用，指紋圖譜質(zhì)控技術(shù)越來(lái)越受到學(xué)者們的重視，在中藥材的藥效評(píng)價(jià)方面占據(jù)了重要地位[8]。

本研究中，我們對(duì)川芎的血清藥物化學(xué)進(jìn)行了探討，通過(guò)對(duì)不同取血時(shí)間的血樣進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，30min色譜圖中多數(shù)成分的峰面積要大于1h血樣，因而，末次給藥后30min采集血樣為佳。本次共檢出11個(gè)成分，其中2個(gè)為已知的藥物有效成分，4個(gè)成分屬于血清，其余成分可能為代謝產(chǎn)物。川芎嗪、阿魏酸作為川芎的主要成分，均可從血清中檢出，說(shuō)明是藥物通過(guò)消化系統(tǒng)吸收入血的有效成分，可用于評(píng)價(jià)川芎的藥效，并可作為衡量藥物品質(zhì)的指標(biāo)。川芎的表觀血清HPLC指紋圖譜包含較多該藥材血中移行成分的信息，與既往單一成分指標(biāo)相比，能更好地控制中藥的質(zhì)量，也可避免直接用血清指紋圖譜作為評(píng)價(jià)指標(biāo)所帶來(lái)的操作不便、費(fèi)用高、耗時(shí)多等問(wèn)題[9～11]。

由于中藥材成分較為復(fù)雜，品種繁多，因而一直以來(lái)缺乏明確的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，這對(duì)規(guī)范中藥市場(chǎng)、中醫(yī)藥現(xiàn)代化及國(guó)際化都造成了一定程度的阻礙[12～13]。指紋圖譜可全面客觀地反應(yīng)藥材的化學(xué)成分，并分析探討其內(nèi)在特征，予以定量分析，這對(duì)于建立完善的中藥質(zhì)控體系至關(guān)重要。

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Study on Chemical Constituents of Serum from Ligusticum Wallichii

LI Jing-jing,1YANG Hui-ge1，F(xiàn)AN Fei1and LIU Jin-bao2
（1.Xi'an Institute for Food and Drug Control,Xi’an 710054,China;2.Nan gang Hospital.of Hij Province Hospital Department of Radiology,150001 China)

In order to provide guidance for the identification,extraction and administration of the active ingredients of ligusticum wallichii,its serum migration is studied by means of drug chemistry.The control group solution and the filling liquid of ligusticum wallichii are prepared,the rat model is established and the serum is extracted after intragastric administration.The HPLC fingerprints are built and the migration composites are identified.A total of 11 composites are identified,of which 4 are serum.After the intragastric administration of ligusticum wallichii,there are 7 blood samples are found from the blood,4 of them are metabolites and the other 3 are the prototype composites.It is indicated that the main composites which enter into the blood of ligusticum wallichii are composed of ligustrazine and ferulic acid,which can provide a basis for clarifying the pharmacological effects of ligusticum wallichii and its quality control.

Ligusticum wallichii;serum pharmacochemistry;fingerprint;high performance liquid chromatography

R 284.1

B

1001-0017（2017）04-0307-03

2017-03-12

李靜靜（1984-），女，陜西西安人，碩士，主管藥師，主要研究方向?yàn)樗幬锓治觥?/p>