常芬，肖貴華，李琪

(武漢市普仁醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，湖北 武漢 430081)

·論著·

上調(diào)microRNA-214表達(dá)對肺癌細(xì)胞凋亡及耐藥性的影響

常芬，肖貴華，李琪

(武漢市普仁醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，湖北 武漢 430081)

目的探究microRNA- 214過表達(dá)是否可以通過調(diào)節(jié)凋亡過程影響肺癌細(xì)胞的多藥耐藥性。方法選擇2種不同的人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株和人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株作為實(shí)驗(yàn)組，分別是H69細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組和H446細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組；A549細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組和H1299細(xì)胞組；選擇正常人肺上皮細(xì)胞(BEAs- 2B)作為對照組。Real- time PCR法進(jìn)行檢測肺癌細(xì)胞株內(nèi)miR- 214的表達(dá)量。上調(diào)miR- 214表達(dá)后給予不同的抗腫瘤藥物刺激，并MTT比色法檢測肺癌細(xì)胞株對藥物的敏感性；CCK- 8法檢測細(xì)胞存活率和TUNEL法流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡；Western blot法檢測肺癌細(xì)胞株中Bcl- 2和p53的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果Real- time PCR法檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中miR- 214表達(dá)量明顯低于對照組BEAs- 2B，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CCK- 8結(jié)果顯示，上調(diào)miR- 214表達(dá)后肺癌細(xì)胞的存活率顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；MTT法結(jié)果顯示，上調(diào)miR- 214表達(dá)后肺癌細(xì)胞對抗腫瘤藥物的敏感性顯著降低(P<0.05)；Western blot結(jié)果表明，上調(diào)miR- 214基因表達(dá)后肺癌細(xì)胞Bcl- 2和p53蛋白的異常表達(dá)，與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；結(jié)論上調(diào)miR- 214表達(dá)能夠顯著降低肺癌細(xì)胞的存活率并加速凋亡的發(fā)生；同時miR- 214過表達(dá)可以調(diào)控凋亡蛋白并降低肺癌細(xì)胞對藥物的敏感性。

小分子核糖核酸- 214； 肺癌； 凋亡； 多藥耐藥性

肺癌是對人類健康和生命危害最大的惡性腫瘤之一[1]。肺癌一般可分為兩大類：小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(non- small cell lung cancer,NSCLC)[2]。肺癌具有高侵襲性、高復(fù)發(fā)性及生長迅速的生物學(xué)特點(diǎn)，預(yù)后極差[2]，如何提高肺癌的治療效果已成為當(dāng)今的重要課題。近年來microRNAs已經(jīng)成為腫瘤生物治療領(lǐng)域的一個新亮點(diǎn)[3]，研究表明，miR- 214可參與多種途徑調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程，miR- 214可以調(diào)控細(xì)胞的凋亡通路，影響腫瘤細(xì)胞增殖，同時調(diào)控miR- 214也可以作為腫瘤抑制劑對細(xì)胞的對藥耐藥性產(chǎn)生影響[4]。多藥耐藥性的產(chǎn)生是由多種基因共同調(diào)控的復(fù)雜過程，其中細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl- 2、p53在此過程中起重要作用[5]。但miR- 214是否可以通過調(diào)節(jié)凋亡過程影響肺癌細(xì)胞的多藥耐藥性仍在探索階段。在本研究中，我們通過上調(diào)幾種肺癌細(xì)胞中miR- 214的表達(dá)，觀察miR- 214對肺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，闡明miR- 214在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及miR- 214對凋亡蛋白的調(diào)節(jié)作用治療腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

BEAs- 2B細(xì)胞、H69細(xì)胞、H446細(xì)胞、A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞，購自美國培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)，為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 藥品與試劑

阿霉素(ADM)、長春新堿(VCR)、吉西他濱(GEM)、依托泊苷(VP- 16)和順鉑(DDP)，均購于美國Sigma公司；miR- 214質(zhì)粒及RealTime- PCR配套引物，均購自廣州RiboBio公司；一抗Bcl- 2、p53單克隆抗體，購于美國Abcam公司；二抗，購自北京中杉金橋公司；CCK- 8試劑盒，購自日本同仁化學(xué)研究所；Real- Time PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)試劑盒，購自美國Promega公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 選擇正常人肺上皮細(xì)胞(BEAs- 2B)，作為對照組；分別選擇2種不同的人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株和人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株作為實(shí)驗(yàn)組，分別是H69細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組和H446細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組；A549細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組和H1299細(xì)胞組。細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI培養(yǎng)液中培養(yǎng)，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.3.2 Real- time PCR法檢測不同肺癌內(nèi)miR- 214的表達(dá)水平 Trizol法提取細(xì)胞內(nèi)總RNA。用含有g(shù)DNA Eraser的PrimeScriptRT試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用SYBR Premix Ex TaqII試劑盒進(jìn)行實(shí)時熒光定量Real- time PCR分析。每個實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。分析：通過計(jì)算循環(huán)閾值CT值來確定基因的表達(dá)量。公式:ΔΔCT=(CT.實(shí)驗(yàn)組的基因- CT.實(shí)驗(yàn)組管家基因)- (CT.對照組目的基因- CT.對照組管家基因)。目的mRNA的量=2-ΔΔCT。其引物序列為：

miR- 214 Forward 5′- GGACAGCAGGCGCAGACA- 3′，

Reverse:5′- CAGTGCAGGGTCCGAGGT- 3′，

β- actin Reverse:5′- TGTTGGCATAGAGGTCTTTACGG- 3′，

Reverse: 5′- TGGGTATGGAATCCTGTGGCA- 3′

1.3.3 細(xì)胞miR- 214 mimics質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 將細(xì)胞接種到六孔板中，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)40%左右時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將10 μl的LipofectaminTM2000和250 μl Opti- MEM混合，同時將5 μl的miR- 214 mimics與250 μl Opti- MEM混合孵育，靜置5 min后將兩者混合。細(xì)胞用PBS清洗一次并加入1.5 ml的Opti- MEM培養(yǎng)基。將轉(zhuǎn)染混合物靜置20 min后加滴加到六孔板中，置于上述條件培養(yǎng)。6 h后換含10%胎牛血清的RPMI培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，確保各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率高于80%，48 h后收集細(xì)胞。miR- 214 mimics質(zhì)粒序列為：

miR- 214 mimics Forward:5′- ACAGCAGGCACAGACAGGCAGU- 3′，

Reverse:5′- UGCCUGUCUGUGCCUGCUGUUU- 3′，

mimics control Forward:5′- UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3′，

Reverse:5′- ACGUGACACGUUCGGAGAATT- 3′，

1.3.4 CCK- 8法檢測細(xì)胞存活率 將miR- 214 mimics質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞后制備成細(xì)胞懸液，接種到96孔板中(100 μl/孔)，37 ℃、5% CO2條件下過夜培養(yǎng)。更換培養(yǎng)基后加入10 μl CCK8，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)2 h，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定OD值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.5 TUNEL流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 將miR- 214 mimics質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞后制備成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106接種于6孔板中培養(yǎng)，收集不同肺癌細(xì)胞用PBS洗滌2次，按試劑盒說明書說明分別加入FITc標(biāo)記的AnnexinV和PI，用流式細(xì)胞儀激發(fā)波長488 nm，收集波長630 nm檢測各組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，檢測各組細(xì)胞的凋亡百分比。

1.3.6 MTT比色法檢測細(xì)胞對藥物的敏感性 用MTT法檢測不同肺癌細(xì)胞對藥物的敏感性。阿霉素(ADM)、長春新堿(VCR)、依托泊苷(VP- 16)和順鉑(DDP)分別處理細(xì)胞48 h。PBS清洗細(xì)胞一次并加入MTT試劑37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去培養(yǎng)基并加入DMSO，用酶標(biāo)儀在540 nm波長處測定OD值，測定細(xì)胞對不同藥物的敏感程度(即細(xì)胞IC50)，每個實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.3.7 免疫印跡法檢測細(xì)胞中凋亡蛋白表達(dá)水平 收集對數(shù)生長期細(xì)胞，加入裂解液冰上裂解2 h。用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白濃度檢測，將各組蛋白濃度總量調(diào)整為30 μg·μl-1。將各組蛋白樣品加入到10% SDS聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜后按1∶1000 的稀釋比例加入一抗和二抗。用ECL顯色劑顯色，并對各泳道條帶進(jìn)行灰度掃描，計(jì)算蛋白的表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 肺癌細(xì)胞內(nèi)miR- 214的表達(dá)量

Real- time PCR法檢測發(fā)現(xiàn)，miR- 214在小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H69細(xì)胞、H446細(xì)胞及在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞的表達(dá)量明顯低于對照組BEAs- 2B細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖1。

2.2 肺癌細(xì)胞miR- 214過表達(dá)檢測細(xì)胞的存活率

CCK- 8法檢測細(xì)胞存活率顯示，與對照組的細(xì)胞

注：**與對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)

圖1不同肺癌細(xì)胞株中miR-214的表達(dá)量

Fig1ExpressionofmiR-214indifferentlungcancercells

存活率相比，上調(diào)miR- 214表達(dá)后小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株細(xì)胞存活率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖2。

注：**與對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)

圖2miR-214過表達(dá)降低肺癌細(xì)胞的細(xì)胞存活率

Fig2miR-214overexpressiondecreasescellviabilityoflungcancercells

2.3 肺癌細(xì)胞miR- 214過表達(dá)檢測細(xì)胞的凋亡率

細(xì)胞凋亡率結(jié)果顯示，與對照組相比，上調(diào)miR- 214表達(dá)后小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株細(xì)胞凋亡率明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖3。

注：**與對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)

圖3miR-214過表達(dá)上調(diào)肺癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率

Fig3miR-214overexpressionincreasescellapoptosisoflungcancercells

2.4 肺癌細(xì)胞miR- 214過表達(dá)后對藥物的敏感性降低

MTT比色法檢測上調(diào)miR- 214表達(dá)后肺癌細(xì)胞對藥物的敏感性。結(jié)果顯示miR- 214過表達(dá)后，與對照組相比，小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H69細(xì)胞、H446細(xì)胞及在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞對阿霉素(ADM)、長春新堿(VCR)、吉西他濱(GEM)、依托泊苷(VP- 16)和順鉑(DDP)藥物的敏感性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1miR-214過表達(dá)會降低肺癌細(xì)胞對藥物的敏感性

Tab1miR-214overexpressiondecreasesthedrugsensitivityinlungcancercells

DrugBEAs-2BH69H446A549H1299ADM0.598±0.1430.416±0.091**0.364±0.078**0.477±0.053*0.367±0.041**VCP1.753±0.1310.552±0.164**0.715±0.123**0.614±0.078**1.039±0.114*VP-162.512±0.2232.024±0.158*1.674±0.188**1.949±0.207*1.319±0.169**DDP1.154±0.2310.727±0.128*0.548±0.092**0.642±0.073**0.815±0.147*GEM0.831±0.1520.614±0.113*0.523±0.078**0.601±0.058**0.742±0.122*

注：*與對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；**與對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)

2.5 肺癌細(xì)胞miR- 214過表達(dá)后細(xì)胞中凋亡蛋白表達(dá)水平

Western blot技術(shù)檢測上調(diào)miR- 214表達(dá)后肺癌細(xì)胞中Bcl- 2、p53蛋白表達(dá)情況。結(jié)果表明miR- 214過表達(dá)后，小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H69細(xì)胞、H446細(xì)胞及在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞中的Bcl- 2表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；miR- 214過表達(dá)后，小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H69細(xì)胞、H446細(xì)胞及在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞中的p53表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

注：*與對照組control相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；**與對照組control相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)

圖4miR-214過表達(dá)會降低肺癌細(xì)胞中CPD的表達(dá)

Fig4miR-214overexpressiondecreasestheexpressionofBcl-2andincreasedtheexpressionofp53inlungcancercells

3 討 論

肺癌是對人類健康和生命危害最大的惡性腫瘤之一[1]。目前對于肺癌的治療方法為三種：手術(shù)切除、化學(xué)藥物治療(化療)和放射性治療(放療)，主要治療手段主要為藥物治療[2,6]。由于其極易發(fā)生腫瘤多藥耐藥性(multidrug resistance，MDR)，且肺癌具有高侵襲性、高復(fù)發(fā)性及生長迅速的生物學(xué)特點(diǎn)，容易導(dǎo)致化療失敗，臨床預(yù)后極差[2,7]。因此如何提高肺癌的治療效果及降低化療藥物的耐藥性是函待解決的重要問題。miR- 214已被發(fā)現(xiàn)可在多種腫瘤細(xì)胞種異常表達(dá)并調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡過程，包括胰腺癌、乳腺癌、胃癌和卵巢癌等[8- 11]。miR- 214作為腫瘤抑制因子其表達(dá)與惡性癌癥呈負(fù)相關(guān)性[12]，可對細(xì)胞的多藥耐藥性產(chǎn)生影響[6,13]。研究表明，miR- 214位于1號染色體的長臂上，它能調(diào)節(jié)抑癌基因 PTEN 并能調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡。PTEN的抑制可以激活 PI3K/AKT通路，從而增加使用藥物化療的腫瘤細(xì)胞的生存，而下調(diào)miR- 214 的表達(dá)可以減少腫瘤細(xì)胞的生存和誘導(dǎo)凋亡，但miR- 214是否可以通過調(diào)節(jié)凋亡過程影響肺癌細(xì)胞的多藥耐藥性仍在探索階段[6,13]。

本實(shí)驗(yàn)中，我們對肺癌細(xì)胞進(jìn)行miR- 214的過表達(dá)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，我們通過上調(diào)BEAs- 2B細(xì)胞、H69細(xì)胞、H446細(xì)胞、A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞中miR- 214的含量發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR- 214可以顯著降低肺癌細(xì)胞的細(xì)胞存活率，并促進(jìn)H69細(xì)胞、H446細(xì)胞、A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞的細(xì)胞凋亡發(fā)生。miR- 214基因過表達(dá)對肺癌增殖起到明顯的抑制作用，并可以顯著加速細(xì)胞凋亡的發(fā)生，說明miR- 214在肺癌細(xì)胞的存活和凋亡的調(diào)控過程中起到重要的作用，其表達(dá)水平的高低與小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌的增殖狀態(tài)密切相關(guān)，細(xì)胞內(nèi)miR- 214的異常表達(dá)可以作為臨床上診斷和判斷肺癌發(fā)生的指標(biāo)之一。同時，MTT比色法結(jié)果可知，miR- 214過表達(dá)可對細(xì)胞的多藥耐藥性能力起到明顯的抑制作用，說明肺癌細(xì)胞的多藥耐藥性受miR- 214基因的顯著調(diào)控。

現(xiàn)已證實(shí) ，Bcl- 2蛋白主要通過線粒體介導(dǎo)途徑引起細(xì)胞凋亡[14]，p53作為Bcl- 2的基因轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)控因子也參與了細(xì)胞凋亡的過程[15]。我們發(fā)現(xiàn)miR- 214基因過表達(dá)后，肺癌細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白Bcl- 2和p53的表達(dá)具有顯著的差異性。結(jié)果表明，Bcl- 2的蛋白含量明顯降低，p53的蛋白含量顯著上升，這說明了miR- 214過表達(dá)可以激活細(xì)胞的凋亡途徑，引起肺癌細(xì)胞的凋亡和壞死，對肺癌細(xì)胞的多藥耐藥性產(chǎn)生影響，起到主要的調(diào)控作用。

綜上所述，上調(diào)miR- 214基因的表達(dá)可對肺癌細(xì)胞的增殖及凋亡能力產(chǎn)生顯著的調(diào)控作用；并可以誘導(dǎo)凋亡蛋白發(fā)揮作用啟動細(xì)胞凋亡過程，調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞的多藥耐藥能力。但是miR- 214是否可以作為臨床治療肺癌的靶點(diǎn)，其具體參與機(jī)體調(diào)節(jié)肺癌的機(jī)制還需進(jìn)一步研究和探討。

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EffectsofmicroRNA-214up-regulationonapoptosisanddrugresistanceoflungcancercells

CHANGFen,XIAOGui-hua,LIQi

(DepartmentofRespiratoryMedicine,WuhanPurenHospital，Wuhan430081,China)

Objective: To investigate whether microRNA- 214 overexpression could affect multidrug resistance of lung cancer cells by regulating the process of apoptosis.MethodsHuman small cell lung cancer cell lines and human non- small cell lung cancer cell lines were selected for H69 cell group, H446 cell group, A549 cell group and H1299 cell group; Lung epithelial cells (BEAs- 2B) were served as control group. Real- time PCR was used to detect the expression of miR- 214. After up- regulated microRNA- 214 expression, MTT colorimetry was used to detect the sensitivity of lung cancer cells; CCK- 8 assay was used to detect cell viability; TUNEL assay was used to detect the levels of apoptosis by flow cytometry; the protein expression of Bcl- 2 and p53 were detected by Western blot.ResultsReal- time PCR showed that the expression of miR- 214 was significantly decreased in the lung cancer cell groups(P<0.05); CCK- 8 results showed that miR- 214 overexpression was significantly down- regulated the cell viability (P<0.05); miR- 214 overexpression was significantly decreased the drug sensitivity in lung cancer cells by MTT assay(P<0.05); compared with the control group, the protein expression of Bcl- 2 and p53 in lung cancer cells were significantly abnormally expressed (P<0.05).ConclusionUp- regulation of miR- 214 could decrease cell viability of the lung cancer and increase cell apoptosis, which may also regulate the apoptosis - related proteins and decrease the drug sensitivity in lung cancer cells.

MicroRNA- 214; lung cancer; apoptosis; multidrug resistance

2017- 05- 02

2017- 09- 12

常芬(1988-)，女，湖北武漢人，主治醫(yī)師， 主要研究方向：慢性阻塞性肺病、支氣管哮喘、肺癌等方面。E- mail：changfen1428@163.com

常芬，肖貴華，李琪.上調(diào)microRNA- 214表達(dá)對肺癌細(xì)胞凋亡及耐藥性的影響分析[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2017，36(5)：811- 815.

R734.2

A

1671- 6264(2017)05- 0811- 05

10.3969/j.issn.1671- 6264.2017.05.026

(本文編輯：孫茂民)