王成德 李群 盧江龍 蔡霖 高志超 蘇志鵬

miR-181家族在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)及其臨床意義

王成德 李群 盧江龍 蔡霖 高志超 蘇志鵬

目的 探討miR-181家族在人多形性腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系。方法 采用莖環(huán)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）法檢測40例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中miR-181a、miR-181b、miR-181c、miR-181d的表達(dá)水平，并分析其與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤臨床病理特征的關(guān)系。采用慢病毒轉(zhuǎn)染上調(diào)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251 miR-181a的表達(dá)，分析miR-181a對(duì)U251克隆形成、細(xì)胞增殖和凋亡的影響。結(jié)果 miR-181a高表達(dá)的GBM患者生存預(yù)期明顯延長（P＜0.05）；且miR-181a表達(dá)水平越高，GBM瘤周水腫越明顯（P＜0.05）。O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）陽性組的GBM miR-181a表達(dá)明顯高于陰性組（P＜0.05）。上調(diào)miR-181a的表達(dá)后，U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞克隆形成數(shù)明顯少于對(duì)照組（P＜0.05），且細(xì)胞生長抑制在第5天最明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；對(duì)細(xì)胞凋亡起促進(jìn)作用（P＜0.05）。結(jié)論 miR-181a表達(dá)水平與GBM患者的臨床預(yù)后相關(guān)。miR-181a表達(dá)減少與GBM的發(fā)生密切相關(guān)。

miR-181 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤 MGMT

microRNA是一種內(nèi)源性、高度保守的微小RNA，不編碼任何蛋白質(zhì)，但能夠高效調(diào)控癌基因或抑癌基因的表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的調(diào)控作用[1]。腦多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（Glioblastoma，GBM）是最常見的星形細(xì)胞來源的大腦原發(fā)性惡性腫瘤[2]。盡管有現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的各種治療手段，但是GBM患者的預(yù)后仍然極差[3]。目前臨床上缺少準(zhǔn)確預(yù)測GBM患者生存預(yù)后的指標(biāo)。近年來，發(fā)現(xiàn)miR-181a、miR-181b能抑制GBM的生長[4]，miR-181a能提高GBM對(duì)放化療的敏感性[5-6]。本研究采用莖環(huán)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）和免疫組化方法檢測GBM組織標(biāo)本中miR-181家族及O6-甲基鳥嘌呤-DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）、Ki-67、p53等蛋白的表達(dá)水平，分析miR-181家族的表達(dá)與GBM臨床病理特征的關(guān)系；此外，通過慢病毒轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251來上調(diào)其表達(dá)，分析其對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響，以驗(yàn)證miR-181家族的功能效應(yīng)。

1 材料和方法

1.1 材料 人miR-181a轉(zhuǎn)染病毒LV-hsa-mir-181a-1（序號(hào) LVKL17475-1）及對(duì)照病毒（序號(hào) KL8781-1）由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司提供。U251購自中科院上海細(xì)胞庫；DMEM購自美國Gibco公司；FBS購自北京元亨圣馬生物科技公司；Trizol購自美國Invitrogen公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、SYBR Mastermix購自日本東洋紡（上海）生物科技有限公司；PCR Marker（100 bpDNAlad-der）購自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；Matrigel購自美國BD Bioscience公司；凋亡試劑盒購自美國eBioscience公司。PI購自美國Sigma公司，RNase A購自美國Fermentas公司。GIEMSA染色液購自上海鼎國生物技術(shù)有限公司。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。一抗特異性兔抗人多克隆抗體固定液購于美國Abcan公司，兔二抗、羊血清封閉液和DAB顯色液購置于北京中杉金橋生物公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集及處理 GBM組織標(biāo)本來源于溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科2008—2013年40例手術(shù)切除的腫瘤組織（腫瘤組織切除后立即予液氮冷凍備用），病理類型的判斷標(biāo)準(zhǔn)參照WHO腦膠質(zhì)瘤的病理學(xué)分類。術(shù)后對(duì)患者行標(biāo)準(zhǔn)化同步放化療加輔助化療?；颊咧心?20 例，女 20 例；年齡 14～75（53.15±14.97）歲。1.2.2 免疫組化染色 取出液氮冷凍腫瘤組織并置于冰凍切片機(jī)冷架上（溫度-18～22℃），解凍后投入冷凍的丙酮；取出在空氣中二次解凍；10%福爾馬林浸泡過夜，常規(guī)石蠟包埋。將石蠟塊作3μm連續(xù)切片，脫蠟，3%甲醇-過氧化氫浸泡，檸檬酸修復(fù)液抗原修復(fù)；一抗4℃過夜，二抗、三抗各孵育 30min；DAB顯色，蘇木精復(fù)染對(duì)比；脫水、樹膠封片等具體操作步驟按常規(guī)進(jìn)行。各步驟間用PBS緩沖液漂洗3×5min，用PBS作為一抗陰性對(duì)照。免疫組化染色后陽性細(xì)胞呈黃色、棕黃色或棕褐色。在高倍鏡（10×20）下，隨機(jī)選擇5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)1 000個(gè)細(xì)胞以上，計(jì)算腫瘤細(xì)胞陽性率。腫瘤細(xì)胞陽性率評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：陽性細(xì)胞＜5%為0分，5%～25%為1分，＞25%～50%為2分，＞50%為3分；陽性著色評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；以上兩種評(píng)分相加所得的總分：＜3分為陰性（-），3分為弱陽性（+），≥4分為強(qiáng)陽性（++）。

1.2.3 小RNA抽提 取液氮保存的GBM組織標(biāo)本，在液氮中碾碎至粉狀，按Trizol試劑說明書提取總RNA，DEPC處理水溶解。抽提的RNA溶液按DNase I說明書步驟進(jìn)一步純化。采用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)（美國Thermo公司）檢測RNA溶液吸光值（OD260、OD280），計(jì)算RNA濃度、純度，OD260/OD280＞1.8方可用于檢測。1.0%瓊脂糖變性凝膠電泳檢測RNA的完整性。

1.2.4 RT-qPCR GBM組織及細(xì)胞中miRNA-181的檢測：取GBM組織200mg，勻漿后根據(jù)Trizol試劑盒說明書提取腫瘤組織中總RNA。U251細(xì)胞中miRNA-181a/b/c/d按照mirVa-naTMRT-PCR miRNA檢測試劑盒操作。均采用U6作為內(nèi)參照。變性條件：93～94℃，1min；退火條件：40℃，30s；延伸條件：70℃，1min；共30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增完成后，在ABI 7300 System軟件上分析，用2-ΔΔCt方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 穩(wěn)定過表達(dá)miR-181a U251的建立 慢病毒載體質(zhì)粒LV-hsa-mir-181a-1（17475-1，導(dǎo)入基因片段序列為 hsa-mir-181a-1 序列，5′-AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU-3′），對(duì)照病毒 KL8781-1（導(dǎo)入基因片段序列為 5′-TTCTCCGAACGTGTCACGTTTC-3′），均由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司制備。載體質(zhì)粒含有綠色熒光蛋白（GFP）及嘌呤霉素抗性基因。96孔板中進(jìn)行感染，每孔接種細(xì)胞數(shù)為3.5×103，加入100μl完全培養(yǎng)基，感染細(xì)胞的病毒滴度為5×108TU/ml。分別于48、72、96、120h后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞發(fā)光情況，確定U251在感染72h后熒光達(dá)到最強(qiáng)。換用含抗生素（puromycin）的培養(yǎng)基篩選細(xì)胞。篩選2周后取一定量細(xì)胞，調(diào)整濃度為1.0×105個(gè)/ml，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測1.0×104個(gè)細(xì)胞中發(fā)光細(xì)胞數(shù)，確定發(fā)光效率。篩選培養(yǎng)期間根據(jù)細(xì)胞的生長狀況進(jìn)行傳代。實(shí)驗(yàn)分為3個(gè)組：實(shí)驗(yàn)組（OE組，U251+hsa-mir-181a-1基因mirco up病毒感染的細(xì)胞）、陰性對(duì)照組（NC組，U251+陰性對(duì)照病毒感染的細(xì)胞），另設(shè)置一組未經(jīng)病毒感染的空白對(duì)照組（CON組）。

1.2.6 MTT實(shí)驗(yàn) 取消化生長對(duì)數(shù)期的兩組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×104個(gè)/ml。按100μl/孔接種于96孔板，分別于接種后 24、48、72、96、124h 以每孔濃度 0.5mg/ml加入MTT溶液，培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4h后吸棄培養(yǎng)液。再每孔加入150μl二甲基亞砜（DMSO），37℃恒溫?fù)u床上低速震蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。置于酶聯(lián)免疫檢測儀490nm波長處測量各孔吸光值（OD490），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn) 取消化生長對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為0.8×103個(gè)/ml。取1ml細(xì)胞分別接種于6孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；每3d更換一次培養(yǎng)液。培養(yǎng)10d后，吸棄每孔培養(yǎng)液，0.5%結(jié)晶紫染色顯微鏡下計(jì)數(shù)克隆數(shù)。＞50個(gè)細(xì)胞的集落計(jì)數(shù)為1個(gè)克隆團(tuán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 培養(yǎng)細(xì)胞融合度達(dá)85%，消化細(xì)胞，完全培養(yǎng)基重懸成細(xì)胞懸液，與上清液細(xì)胞收集于同一個(gè)5ml離心管中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。1 300rmp離心5min，棄上清液，4℃預(yù)冷的 D-Hanks（pH7.2～7.4）洗滌細(xì)胞沉淀。1×染色緩沖液洗滌細(xì)胞沉淀1次，1 300rmp離心3min，收集細(xì)胞。200μl 1×染色緩沖液重懸細(xì)胞沉淀。加入10μl Annexin V-APC染色，室溫避光10～15min。根據(jù)細(xì)胞量，補(bǔ)加400～800μl 1×染色緩沖液，上機(jī)檢測。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用Graphpad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件。由于miR-181相對(duì)表達(dá)量不符合正態(tài)分布，予-lg轉(zhuǎn)化使數(shù)據(jù)近似正態(tài)分布，用表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。總生存期（OS）的統(tǒng)計(jì)以GBM患者手術(shù)時(shí)間當(dāng)日起至病死日期為止，以d為單位，數(shù)據(jù)用M（P25，P75）表示，組間比較采用log-rank檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膠質(zhì)瘤標(biāo)本中miR-181家族檢測特異性分析 miR-181a、miR-181b、miR-181c 及 miR-181d 的 RT-PCR產(chǎn)物的熔解曲線為單峰，見圖1（插頁）；說明莖環(huán)RT-qPCR可以特異檢測該4條microRNA。

2.2 熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率 在熒光顯微鏡觀察V-hsa-mir-181a-1（17475-1）及對(duì)照病毒 KL8781-1 感染U251的效率，結(jié)果顯示70%～80%的U251可見熒光，說明具有較高的感染效率，可以滿足后續(xù)試驗(yàn)要求，見圖 2（插頁）。

2.3 miR-181表達(dá)水平與GBM臨床特征的關(guān)系 分別按 miR-181a、miR-181b、miR-181c、miR-181d 相對(duì)表達(dá)量0.1、0.03、0.002和0.02為界限，將GBM患者分成高表達(dá)組、低表達(dá)組，miR-181a高表達(dá)組總生存期較低表達(dá)組明顯延長（P＜0.05），miR-181b、miR-181c、miR-181d高、低表達(dá)組總生存期比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均PP＞0.05），見表1和圖3。此外，miR-181a與GBM瘤周水腫程度有關(guān)，即輕微水腫患者的miR-181a相對(duì)表達(dá)量低于明顯水腫患者（P＜0.05），見表2。

表1 miR-181高、低表達(dá)組總生存期比較

2.4miR-181表達(dá)水平與GBM病理特征的關(guān)系 MGMT陰性組miR-181a、miR-181c表達(dá)水平均明顯低于MGMT陽性組（均P＜0.05），miR-181b、miR-181d表達(dá)水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均PP＞0.05）。miR-181a、miR-181b、miR-181c、miR-181d表達(dá)水平與p53免疫組化結(jié)果未見明顯關(guān)系（均PP＞0.05）。因研究納入的GBM標(biāo)本Ki-67（-）只有2例，故將Ki-67表達(dá)分為弱表達(dá)（-，+）與強(qiáng)表達(dá)（++）兩組進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn) miR-181a、miR-181b、miR-181c、miR-181d 表達(dá)水平與 Ki-67 免疫組化結(jié)果未見明顯關(guān)系（均PP＞0.05），見表3。

2.5 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果 各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞于接種后連續(xù)5d用MTT法檢測細(xì)胞增殖情況，所測得的OD值作細(xì)胞生長曲線，見圖4a。miR-181a高表達(dá)對(duì)U251的增殖產(chǎn)生抑制作用。OE組與NC組相比較，miR-181a抑制U251生長作用在第5天最為明顯，OD值分別為0.616±0.0061和0.832±0.0012，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=73.02，P＜0.05），見圖 4b。

2.6 克隆形成實(shí)驗(yàn) OE組克隆形成數(shù)為（36±3）個(gè)，明顯少于NC組的（54±8）個(gè)（兩組均種植1 000個(gè)細(xì)胞；t=3.87，P＜0.05），見圖 5。

2.7 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果 OE組細(xì)胞凋亡率為（8.99±0.43）%明顯高于 NC 組的（4.28±0.20）%（t=16.98，P＜0.05），見圖 6。

3 討論

microRNA作為癌基因和抑制癌基因?qū)δ[瘤的發(fā)生、發(fā)展過程進(jìn)行調(diào)控，目前已被廣泛認(rèn)同。miR-181家族在正常腦組織中呈現(xiàn)高表達(dá)[7]，而在GBM中低表達(dá)，miR-181a、miR-181b在人膠質(zhì)瘤細(xì)胞上具有腫瘤抑制作用，它們?cè)谀z質(zhì)瘤細(xì)胞系及WHO-Ⅱ-Ⅳ級(jí)的膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本中的表達(dá)均明顯降低；此外，miR-181a的表達(dá)與腫瘤級(jí)別呈負(fù)相關(guān)[4，8]。在GBM的治療方面，Chen等[5]研究表明miR-181a能通過靶向Bcl-2來提高膠質(zhì)瘤對(duì)放療的靈敏度。在GBM的化療方面，海兔素可使膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的miR-181的表達(dá)增高，進(jìn)而抑制其靶基因MEK1的表達(dá)，最終協(xié)同提高替莫唑胺化療的靈敏度[9-10]。同時(shí)，She等[6]認(rèn)為miR-181可通過Rap1B介導(dǎo)的細(xì)胞骨架重塑而增加GBM對(duì)替莫唑胺化療的靈敏度。關(guān)于miR-181對(duì)同步放化療的作用亦有文獻(xiàn)報(bào)道，miR-181b、miR-181c可作為GBM同步放化療靈敏度的預(yù)測指標(biāo)[11]。

圖3 miR-181表達(dá)與GBM患者總生存期的關(guān)系（a:mir-181a;b:mir-181b;c:mir-181c;d:mir-181d）

表2 miR-181表達(dá)水平與GBM臨床特征的關(guān)系

表3 miR-181表達(dá)水平與GBM病理特征的關(guān)系

筆者對(duì)GBM樣本進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示miR-181a表達(dá)與GBM患者的生存預(yù)后存在相關(guān)性。miR-181a表達(dá)水平越高，患者生存期越長。由于本研究納入病例均為WHOⅣ級(jí)的GBM患者，術(shù)后均按指南進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)放化療，故生存期延長的這部分患者可能與miR-181a高表達(dá)致腫瘤對(duì)放療及替莫唑胺化療的靈敏度增加有關(guān)。以上研究結(jié)果具與本文一致，提示miR-181a表達(dá)量可能成為臨床判斷GBM患者預(yù)后的指標(biāo)，并進(jìn)一步支持miR-181a高表達(dá)水平會(huì)給GBM患者帶來明顯生存受益的觀點(diǎn)。本研究數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)miR-181b、miR-181c、miR-181d與GBM患者預(yù)后差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是與miR-181b、miR-181c、miR-181d在 GBM 標(biāo)本中的相對(duì)表達(dá)量偏低以及入選病例數(shù)偏少等有關(guān)。

圖4 各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞經(jīng)MTT處理4h后在酶標(biāo)儀對(duì)波長490nm的光吸收率變化倍數(shù)的時(shí)間變化

圖5 培養(yǎng)板內(nèi)細(xì)胞克隆形成集落及100倍下單個(gè)集落明場合綠色熒光視野（a:NC組；b：OE組）

圖6 Annexin V-APC法流式細(xì)胞檢測散點(diǎn)圖（a：NC組；b：OE組）

本研究通過慢病毒轉(zhuǎn)染，使用miR-181a表達(dá)升高的U251細(xì)胞株，并通過MMT、細(xì)胞克隆形成和細(xì)胞凋亡等實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞功能改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)染miR-181a后，U251增殖和克隆形成能力均明顯減弱，凋亡發(fā)生率明顯增加。與GBM組織標(biāo)本中的miR-181a PCR實(shí)驗(yàn)相互印證，為后期分子生物學(xué)研究提供了理論基礎(chǔ)。Ouyang等[12]利用熒光素酶標(biāo)記法證實(shí)，miR-181能通過與目標(biāo)基因mRNA的3′UTRs區(qū)特異性結(jié)合調(diào)節(jié)Bcl-2家族中的Bcl-2、Bcl-2-L11/Bim和Mcl-1（野生型）的表達(dá)；進(jìn)一步用microRNA模擬物、microRNA抑制劑改變miR-181，發(fā)現(xiàn)miR-181對(duì)Bcl-2家族中的Bcl-2調(diào)控程度最高。Bcl-2能減少促凋亡因子（如細(xì)胞色素c等）從線粒體內(nèi)釋放，抑制Caspase的激動(dòng)，從而抑制凋亡的發(fā)生[13-14]；本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-181a增高可以正向調(diào)控凋亡的發(fā)生，間接印證了上述結(jié)論。相關(guān)文獻(xiàn)表明microRNA可直接靶向甲基轉(zhuǎn)移酶 DNMT，引起DNA甲基化改變而影響特定基因的表達(dá)[15-17]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在GBM中miR-181a的表達(dá)與MGMT蛋白呈正相關(guān)。因此，筆者推測MGMT并不是miR-181a的直接靶基因，miR-181a可能通過靶向甲基轉(zhuǎn)移酶而正向影響MGMT的蛋白表達(dá)。本研究還發(fā)現(xiàn)miR-181a與GBM瘤周水腫存在統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)系。Ma等[18]發(fā)現(xiàn)miR-181a能通過靶向KLF6增加血瘤屏障的通透性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)miR-181a的表達(dá)能抑制ZO-1、occludin和claudin-5蛋白的表達(dá)；而這些蛋白與內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接通透性密切相關(guān)[19-20]。以上研究發(fā)現(xiàn)的機(jī)制在一定程度上解釋了miR-181a可增加GBM瘤周水腫的原因。

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Expression of miR-181 family in glioblastoma and its clinical significance

WANG Chengde,LI Qun,LU Jianglong,et al.

Department of Neurosurgery，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Whenzhou 325000,China

Objective To investigate the expression of miR-181 family in multiform glioblastoma（GBM）and its correlation with clinicopathological characteristics of the tumor. Methods The expression of miR-181a,miR-181b,miR-181c and miR-181d was detected by loop RT-qPCR in tumor tissue specimens of 40 GBM patients.The relationship between miR-181 expression and clinicopathological characteristics was analyzed.The lentiviral vector carrying miR-181a was transfected into U251 cells,the proliferation clone-forming ability and apoptosis of miR-181a-transfected U251 cells were determined. Results The up-regulation of miR-181a expression was correlated with the survival of patients and peritumoral brain edema(P＜0.05).Expression of miR-181a was significantly higher in patients with O6-methylguanine-DNA methyltransferase(MGMT)positive than those with MGMT negative(P＜0.05).Cell studies indicated that the over-expression of miR-181a significantly inhibited the proliferation of U251 cells(P＜0.01),reduced clone-forming ability(P＜0.05),and increased apoptosis(P＜0.05). Conclusion The expression of MiR-181a may be associated with the prognosis of GBM,and down-expression of miR-181a may be involved in the development of GBM.

miR-181 Glioblastoma MGMT

2016-11-30）

（本文編輯：陳丹）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.18.2016-2010

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（LY16H160053）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012RCA042）；溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（Y20120008）

325000 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科

蘇志鵬，E-mail：drsuzhipeng@163.com