胡余敏 朱君飛

非小細(xì)胞肺癌組織中FOXC2和MMP-9的表達(dá)及臨床意義

胡余敏 朱君飛

目的 探討非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）組織中叉頭框蛋白C2（FOXC2）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）的表達(dá)特點(diǎn)及臨床意義。方法 采用免疫組化En vision二步法檢測(cè)70例NSCLC及其對(duì)應(yīng)癌旁組織中FOXC2、MMP-9蛋白表達(dá)情況，并分析NSCLC組織中FOXC2、MMP-9的蛋白表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系，以及FOXC2與MMP-9蛋白表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果 NSCLC組織中FOXC2、MMP-9蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為71.43%、75.71%，分別高于對(duì)應(yīng)癌旁組織的18.57%、15.71%（均P＜0.05）。NSCLC組織中FOXC2、MMP-9蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（均P＜0.05）。NSCLC組織中FOXC2與MMP-9蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（rs=0.674，P＜0.05）。結(jié)論 NSCLC組織中FOXC2、MMP-9蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)，其異常表達(dá)與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等相關(guān)；FOXC2與MMP-9蛋白表達(dá)呈正相關(guān)。

叉頭框蛋白C2 基質(zhì)金屬蛋白酶9 非小細(xì)胞肺癌

肺癌是全世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，在惡性腫瘤病死原因中居第一位[1]。其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占肺癌發(fā)病總數(shù)的80%[2]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesechyrnal transition，EMT）過(guò)程中上皮細(xì)胞之間的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，細(xì)胞間連接減少，從而失去正常的極性，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力提高，最終導(dǎo)致細(xì)胞表型改變[3]。叉頭框蛋白C2（FOXC2）屬于FOX蛋白家族成員，它是EMT中一個(gè)重要的調(diào)節(jié)子，在腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中常常被激活?；|(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）在EMT過(guò)程中通過(guò)降解細(xì)胞間連接來(lái)參與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的過(guò)程[4]。目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)聯(lián)合探討NSCLC組織中FOXC2、MMP-9蛋白表達(dá)特點(diǎn)及其臨床意義的相關(guān)報(bào)道。本研究擬采用免疫組化En vision二步法檢測(cè)NSCLC及其癌旁組織中FOXC2、MMP-9蛋白表達(dá)情況，分析兩者表達(dá)與NSCLC臨床病理因素的相關(guān)性，以初步探討FOXC2、MMP-9表達(dá)與NSCLC進(jìn)展的關(guān)系。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選擇2008年1月至2015年12月在臨海市第一人民醫(yī)院（10例）和臺(tái)州市中心醫(yī)院（60例）作手術(shù)切除的NSCLC標(biāo)本，所有患者臨床資料完整，均經(jīng)病理學(xué)檢查明確診斷，術(shù)前均未接受過(guò)放、化療。70例NSCLC患者中，男 42 例，女 28 例；年齡 48（30，80）歲；＜60 歲25例，≥60歲45例。參照2004年WHO肺腫瘤組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)：鱗癌30例，腺癌40例；高分化24例，中低分化46例。依據(jù)2010年國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期21例，Ⅱ期23例，Ⅲ期26例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：有31例，無(wú)39例。同時(shí)另取同期距離腫塊邊緣5cm外的對(duì)應(yīng)癌旁正常組織作為對(duì)照。

1.2 主要試劑 FOXC2兔抗人多克隆抗體（ab65141）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；MMP-9兔抗人單克隆抗體（ab76003）購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司；免疫組化檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟 所用標(biāo)本采用10%的中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片、染色。取石蠟組織常規(guī)連續(xù)切片，厚約4μm；采用免疫組化En vision二步法，按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照，用已知陽(yáng)性組織作陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定 FOXC2、MMP-9表達(dá)均定位于細(xì)胞質(zhì)，呈現(xiàn)淡黃色或棕黃色顆粒分布即為陽(yáng)性細(xì)胞。在光學(xué)顯微鏡下，觀察＞5個(gè)高倍視野、計(jì)數(shù)≥1 000個(gè)細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。若陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥10%為陽(yáng)性，＜10%為陰性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用 M（P25，P75）表示；計(jì)數(shù)資料用率比較，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析NSCLC組織中FOXC2與MMP-9蛋白表達(dá)的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC和癌旁正常組織中FOXC2、MMP-9蛋白表達(dá)的比較 FOXC2、MMP-9在細(xì)胞質(zhì)中的陽(yáng)性表達(dá)，見圖1。NSCLC組織中FOXC2、MMP-9蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為 71.43%（50/70）和 75.71%（53/70），分別高于對(duì)應(yīng)癌旁組織中的 18.57%（13/70） 和 15.71%（11/70），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=39.509、50.773，均P＜0.05）。

圖 1 NSCLC 組織中 FOXC2、MMP-9蛋白表達(dá)（a：FOXC2；b：MMP-9；En vision 二步法，×400）

2.2 NSCLC組織中FOXC2、MMP-9的蛋白表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系 隨著NSCLC患者臨床分期進(jìn)展、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生，F(xiàn)OXC2、MMP-9蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；NSCLC組織中FOXC2、MMP-9蛋白陽(yáng)性表達(dá)率在不同年齡、性別、組織學(xué)類型、分化程度的患者間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均PP＞0.05），見表1。

表1FOXC2和MMP-9表達(dá)與NSCLC臨床病理因素的關(guān)系[例（%）]

2.3 NSCLC組織中FOXC2與MMP-9蛋白表達(dá)的相關(guān)性 70例NSCLC標(biāo)本中，F(xiàn)OXC2和MMP-9表達(dá)共陽(yáng)性47例，共陰性14例；FOXC2與MMP-9蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（rs=0.674，P＜0.05），見表 2。

表2 NSCLC組織中FOXC2和MMP-9表達(dá)的相關(guān)性（例）

3 討論

FOX是一個(gè)擁有相似的DNA結(jié)合域的蛋白家族，對(duì)DNA的轉(zhuǎn)錄起著至關(guān)重要的作用。FOX2屬于FOX轉(zhuǎn)錄因子超家族成員之一，最早發(fā)現(xiàn)在大鼠腦組織有表達(dá)。FOXC2基因定位于人類染色體16q24，由一個(gè)編碼的外顯子構(gòu)成，其編碼的蛋白參與EMT的生物學(xué)過(guò)程，EMT在腫瘤演進(jìn)過(guò)程中由腫瘤細(xì)胞獲得[5]。近年來(lái)研究表明，F(xiàn)OXC2在大腸癌、鼻咽癌及食管癌等惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，其異常表達(dá)與腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[6-8]。Li等[9]報(bào)道FOXC2過(guò)表達(dá)與大腸癌的預(yù)后不良有關(guān)；進(jìn)一步作體外實(shí)驗(yàn)，通過(guò)短發(fā)夾RNA敲除FOXC2表達(dá)能明顯抑制大腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。本研究中70例NSCLC組織中FOXC2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為71.43%，明顯高于正常癌旁組織的18.57%；這表明FOXC2過(guò)表達(dá)與NSCLC的發(fā)生有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，隨著臨床分期進(jìn)展及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生，F(xiàn)OXC2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯升高；這表明FOXC2蛋白表達(dá)與臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXC2可通過(guò)促進(jìn)血管和淋巴管的生成或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT-MET轉(zhuǎn)化，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[10]。

MMPs是一組鋅離子具有跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)及分泌功能的中性肽鏈內(nèi)肽酶，可降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的多種蛋白質(zhì)、激活細(xì)胞因子、參與新生血管調(diào)節(jié)等，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。研究表明，基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的降解是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移發(fā)生的重要原因，MMPs家族通過(guò)對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，參與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程，從而導(dǎo)致腫瘤的惡性進(jìn)展和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[11]。MMP-9是其家族中的主要成員，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)MMP-9在多種惡性腫瘤中出現(xiàn)過(guò)表達(dá)，且與腫瘤的侵襲性相關(guān)[12-13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NSCLC組織中MMP-9蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為75.71%，明顯高于正常癌旁組織的15.71%，且MMP-9表達(dá)與患者臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。以上說(shuō)明MMP-9表達(dá)升高參與NSCLC發(fā)生、轉(zhuǎn)移過(guò)程，患者臨床分期高，預(yù)后差。Nishida等[8]對(duì)食管癌組織中FOXC2 mRNA和蛋白水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，食管癌組織中FOXC2高表達(dá)的患者，MMP2、MMP-9蛋白表達(dá)亦明顯升高，從而降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤的局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致惡性腫瘤患者預(yù)后差。本研究分析NSCLC組織中FOXC2與MMP-9的蛋白表達(dá)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)兩者存在正相關(guān)，是一對(duì)協(xié)同作用的因素；FOXC2通過(guò)上調(diào)MMP-9蛋白表達(dá)促進(jìn)NSCLC的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，NSCLC組織中FOXC2、MMP-9蛋白高表達(dá)患者易發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后不良；FOXC2與MMP-9的蛋白表達(dá)存在正相關(guān)。因此，聯(lián)合檢測(cè)NSCLC組織中FOXC2與MMP-9蛋白表達(dá)水平有利于評(píng)估腫瘤的轉(zhuǎn)移能力和預(yù)后。NSCLC組織中過(guò)表達(dá)的FOXC2如何通過(guò)信號(hào)通路上調(diào)MMP-9蛋白表達(dá)的作用機(jī)制需進(jìn)一步研究。

[1] Siegel R,Ma J,Zou Z,et al.Cancer statistics,2014[J].CA Cancer J Clin,2014,64(1):9-29.

[2] van Zandwijk N,Fong K M.Update in lung cancer:prologue to a modern review series[J].Respirology,2015,20(2):183-184.

[3] Mathias R A,Simpson R J.Towards understanding epithelial-mesenchymal transition:a proteomics perspective[J].Biochim Biophys Acta,2009,1794(9):1325-1331.

[4] 王秉文,朱蒙蒙,鄧偉國(guó).FOXC2在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中作用的研究進(jìn)展[J].中國(guó)婦幼保健,2014,29(30):5016-5018.

[5] Kalluri R.EMT:when epithelial cells decide to become mesenchymal-like cells[J].J Clin Invest,2009,119(6):1417-1419.

[6] Zhou Z,Zhang L,Xie B,et al.FOXC2 promotes chemoresistance in nasopharyngeal carcinomas via induction of epithelial mesenchymaltransition[J].Cancer Lett,2015,363(2):137-145.

[7]CuiYM,Jiao H L,Ye YP,et al.FOXC2 promotes colorectal cancer metastasis by directly targeting MET[J].Oncogene,2015,34(33):4379-4390.

[8] Nishida N,Mimori K,Yokobori T,et al.FOXC2 is a novel prognostic factor in human esophageal squamous cell carcinoma[J].Ann Surg Oncol,2011,18(2):535-542.

[9] Li Q,Wu J,Wei P,et al.Overexpression of forkhead Box C2 promotes tumormetastasis and indicates poor prognosis in colon cancer viaregulating epithelial-mesenchymal transition[J].Am J Cancer Res,2015,5(6):2022-2034.

[10] Cui Y M,Jiao H L,Ye Y P,et al.FOXC2 promotes colorectal cancer metastasis by directly targeting MET[J].Oncogene,2014,34(33):4379-4390.

[11] Heinke J,Kerber M,Rahner S,et al.Bone morphogenetic protein modulator BMPER is highly expressed in malignant tumors and controls invasive cellbehavior[J].Oncogene,2012,31(24):2919-2930.

[12] Kalhori V,Tornquist K.MMP-2 and MMP-9 participate in S1P-induced invasion of follicular ML-1 thyroid cancer cells[J].Mol CellEndocrinol,2015,404:113-122.

[13] Liu Z,Dou C,Jia Y,et al.RIG-I suppresses the migration and invasion of hepatocel1ularcarcinoma cells by regulating MMP-9[J].Int J Oncol,2015,46(4):1710-1720.

Expression of FOXC2 and MMP-9 in non-small cell lung cancer and its clinical significance

HU Yumin,ZHU Junfei.Department

of Respiratory Medicine,the First People's Hospital of Linhai,Linhai 317000,China

Objective To investigate the expression of Forkhead C2(FOXC2)and matrix metallo proteinase 9(MMP-9)in non-small cell lung cancer(NSCLC)and its clinical significance. Methods The expression of FOXC2 and MMP9 was detected in 70 cases of NSCLC and non-cancerous adjacent tissues by immunohistochemical En Vision method. Results The positive rates of FOXC2 and MMP-9 were significantly higher in cancer tissue than those in non-cancerous adjacent tissues(P＜0.05).The expression of FOXC2 and MMP-9 protein was correlated with clinical stage and lymph node metastasis(P＜0.05).There was a positive correlation between FOXC2 and MMP-9 expression in NSCLC(P＜0.05). Conclusion The expression of FOXC2 and MMP-9 is significantly increased in NSCLC,which is closely correlated with occurrence and malignant development of NSCLC.

FOXC2 MMP-9 Non-smallcelllung cancer

2016-07-18）

（本文編輯：陳丹）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.18.2017-384

317000 臨海市第一人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科（胡余敏）；臺(tái)州市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科（朱君飛）

胡余敏，E-mail：chenrx2014@126..com