杜權(quán) 俞文華 董曉巧 朱強(qiáng) 車志豪 王昊 楊定博 沈永鋒 江力

腦膠質(zhì)瘤組織時鐘基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)及意義

杜權(quán) 俞文華 董曉巧 朱強(qiáng) 車志豪 王昊 楊定博 沈永鋒 江力

目的 探討腦膠質(zhì)瘤組織中PER1、PER2、CRY1、CRY2、CLOCK、BMAL1和NPAS2時鐘基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)與腦膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。方法 采用甲基化特異性PCR檢測腦膠質(zhì)瘤組織及其癌旁正常組織（對照）PER1、CRY1、CRY2、CLOCK、BMAL1、NPAS2等時鐘基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)。結(jié)果 腦膠質(zhì)瘤組織與癌旁正常組織中PER1、CLOCK時鐘基因啟動子區(qū)均未有甲基化；腦膠質(zhì)瘤組織中NPAS2、PER2時鐘基因啟動子區(qū)甲基化頻率明顯高于癌旁正常組織（均P＜0.05）；兩種組織中CRY1、CRY2和BMAL1時鐘基因啟動子區(qū)甲基化頻率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均PP＞0.05）。不同級別腦膠質(zhì)瘤組織中PER1、CLOCK時鐘基因啟動子區(qū)均未有甲基化；高級別腦膠質(zhì)瘤（Ⅲ～Ⅳ級）組織中NPAS2時鐘基因啟動子區(qū)甲基化頻率高于低級別膠質(zhì)瘤（Ⅰ～Ⅱ級）組織（P＜0.05）；不同級別腦膠質(zhì)瘤組織中CRY1、CRY2、BMAL1和PER2時鐘基因啟動子區(qū)甲基化頻率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均PP＞0.05）。結(jié)論 NPAS2、PER2時鐘基因啟動子區(qū)甲基化頻率明顯增高；NPAS2時鐘基因啟動子區(qū)甲基化頻率越高，腦膠質(zhì)瘤的惡性程度越高。NPAS2、PER2時鐘基因啟動子區(qū)DNA甲基化修飾可能是腦膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制。

腦膠質(zhì)瘤 啟動子區(qū) 甲基化 時鐘基因

晝夜節(jié)律是自然界所有生物體具有的特征，晝夜節(jié)律系統(tǒng)受時鐘基因所編碼的蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，時鐘基因功能紊亂與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3]。而基因啟動子區(qū)甲基化可以改變目的基因的表達(dá)狀態(tài)，從而影響膠質(zhì)瘤的生長[4]。新近的研究已證實PER1、PER2、CRY1、CRY2、CLOCK、BMAL1 和 NPAS2 等時鐘基因啟動子區(qū)甲基化與胃癌、肝癌、乳癌等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5-7]。筆者就腦膠質(zhì)瘤以上時鐘基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)進(jìn)行了研究，并探討這些變化與腦膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2005年6月至2010年6月在本院神經(jīng)外科手術(shù)治療的102例初發(fā)腦膠質(zhì)瘤患者為研究對象。其中男63例，女39例；年齡≤60歲60例，＞60歲42例；WHO分級：Ⅰ～Ⅱ級49例，Ⅲ～Ⅳ級53例；腫瘤部位：幕上86例，幕下16例；腫瘤類型：星形細(xì)胞瘤68例，其他34例；腫瘤直徑：≤5cm 70例，＞5cm 32例；術(shù)前卡氏功能狀態(tài)評分（KPS）：≥80分42例，＜80分60例。其中腫瘤全部切除72例；術(shù)后化療56例，術(shù)后放療77例。所有患者為漢族人，均未合并其他惡性腫瘤，直系親屬均排除膠質(zhì)瘤病史。

1.2 方法 術(shù)中收集腦膠質(zhì)瘤組織及其癌旁正常組織（對照），采用甲基化特異性PCR檢測PER1、PER2、CRY1、CRY2、CLOCK、BMAL1 和 NPAS2 等時鐘基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)。使用DNA組織提取試劑盒（產(chǎn)品規(guī)格250次，批號Z3105，由美國Promega公司提供）提取腫瘤組織及正常腦組織的基因組DNA，使用甲基化特異性PCR試劑盒（產(chǎn)品規(guī)格60次，批號EM101，由美國Millipore公司提供）對基因組DNA進(jìn)行亞硫酸氫鈉修飾，修飾后的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，時鐘基因的引物參照文獻(xiàn)[8]，產(chǎn)物于4%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，在紫外儀下觀察并記錄結(jié)果。為了確定甲基化特異性和PCR特異性，以甲基轉(zhuǎn)移酶處理的基因組DNA作為陽性對照、未經(jīng)處理的基因組DNA作為陰性對照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦膠質(zhì)瘤組織與癌旁正常組織中時鐘基因啟動子區(qū)甲基化頻率的比較 腦膠質(zhì)瘤組織與癌旁正常組織中PER1、CLOCK時鐘基因啟動子區(qū)均未有甲基化；腦膠質(zhì)瘤組織中NPAS2、PER2時鐘基因啟動子區(qū)甲基化頻率明顯高于癌旁正常組織（均P＜0.05）；兩種組織中CRY1、CRY2和BMAL1時鐘基因啟動子區(qū)甲基化頻率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均PP＞0.05），見表1。

表1 腦膠質(zhì)瘤患者與癌旁正常組織中時鐘基因啟動子區(qū)甲基化頻率的比較[例（%）]

2.2 不同級別腦膠質(zhì)瘤組織中時鐘基因啟動子區(qū)甲基化頻率的比較 不同級別腦膠質(zhì)瘤組織中PER1、CLOCK時鐘基因啟動子區(qū)均未有甲基化；高級別腦膠質(zhì)瘤（Ⅲ～Ⅳ級）組織中NPAS2時鐘基因啟動子區(qū)甲基化頻率高于低級別膠質(zhì)瘤（Ⅰ～Ⅱ級）組織（P＜0.05）；不同級別腦膠質(zhì)瘤組織中CRY1、CRY2、BMAL1和PER2時鐘基因啟動子區(qū)甲基化頻率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均PP＞0.05），見表 2。

表2 不同級別腦膠質(zhì)瘤組織中時鐘基因啟動子區(qū)甲基化頻率的比較[例（%）]

3 討論

自然界所有動植物在白天、黑夜會呈現(xiàn)出不同的生理特征。晝夜節(jié)律系統(tǒng)調(diào)節(jié)人體24h有序的生理過程，從而保持機(jī)體與自然界和諧共存。晝夜節(jié)律系統(tǒng)由一系列時鐘基因表達(dá)的蛋白來調(diào)節(jié)，這些蛋白不僅是正常生理所必需的，也參與了激素分泌、細(xì)胞代謝、生長和凋亡等過程[1-3]。有研究認(rèn)為晝夜節(jié)律系統(tǒng)的紊亂與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切關(guān)系，而時鐘基因功能改變在其中發(fā)揮著重要作用[3]?；騿幼訁^(qū)甲基化是改變基因表達(dá)能力的重要方式[4]。PER1、PER2、CRY1、CRY2、CLOCK、BMAL1和NPAS2等時鐘基因啟動子區(qū)甲基化與一些惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。相關(guān)研究證實某些時鐘基因可能通過復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)系統(tǒng)，最終影響腫瘤的增生或凋亡[5-7]。

PER1、PER2均是抑癌基因。Xia等[9]研究結(jié)果顯示腦膠質(zhì)瘤組織中PER1、PER2時鐘基因啟動子區(qū)甲基化頻率較癌旁正常組織明顯降低，但與腦膠質(zhì)瘤組織的WHO分級無關(guān)。放療可以明顯增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞PER1、PER2表達(dá)；因此，PER1、PER2表達(dá)被認(rèn)為具有放療、增敏作用[10]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腦膠質(zhì)瘤組織及其癌旁正常組織中PER1時鐘基因啟動子區(qū)為非甲基化；而PER2時鐘基因啟動子區(qū)有低頻率甲基化，且腦膠質(zhì)瘤組織中PER2時鐘基因啟動子區(qū)甲基化頻率明顯高于癌旁正常組織，但與腫瘤惡性程度未見相關(guān)性。以上結(jié)果提示，基因啟動子區(qū)甲基化可能不是腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞PER1表達(dá)的表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制，同時腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞PER2表達(dá)也不完全受基因甲基化所控制。時鐘基因CRY1、CRY2的確切作用目前尚未明確。有研究結(jié)果顯示這2個基因的異常表達(dá)會影響時鐘基因PER1、PER2的功能。Luo等[11]研究結(jié)果顯示腦膠質(zhì)瘤組織中CRY1、CRY2表達(dá)較癌旁正常組織明顯下調(diào)，但與腦膠質(zhì)瘤WHO分級無關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，腦膠質(zhì)瘤組織及其癌旁正常組織中均有低頻率的CRY1、CRY2時鐘基因啟動子區(qū)甲基化，但兩種組織比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。因此，腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞CRY1、CRY2蛋白的表達(dá)也可能受到其他因素的影響。CLOCK、BMAL1時鐘基因是哺乳動物生命活動中重要的2個中央時鐘元件，它們在腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、生長代謝、治療等方面發(fā)揮著重要作用。人類腦膠質(zhì)瘤組織CLOCK時鐘基因表達(dá)明顯增高，而在高級別膠質(zhì)瘤組織中該基因的表達(dá)更為明顯[12]。體外抑制CLOCK時鐘基因表達(dá)可以促進(jìn)體外培養(yǎng)人類膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡[13]。而BMAL1時鐘基因的作用相反，它能夠抑制體外培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長，發(fā)揮腫瘤抑制因子的作用[14]。本研究結(jié)果顯示，腦膠質(zhì)瘤組織與癌旁正常組織中CLOCK時鐘基因啟動子區(qū)均未有甲基化；BMAL1時鐘基因啟動子區(qū)雖有甲基化，但兩種組織比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。這說明基因啟動子區(qū)甲基化可能不是腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞CLOCK、BMAL1表達(dá)的表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制。NPAS2是晝夜節(jié)律系統(tǒng)中重要的時鐘基因，是腫瘤抑制基因。NPAS2的表達(dá)與乳腺癌、肝癌、直腸癌、結(jié)腸癌的病理分級及預(yù)后密切相關(guān)[5-7]。高級別膠質(zhì)瘤NPAS2表達(dá)明顯下降，NPAS2高表達(dá)膠質(zhì)瘤患者生存期明顯延長[15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腦膠質(zhì)瘤組織及其癌旁正常組織中NPAS2時鐘基因啟動子區(qū)存有甲基化，而在腦膠質(zhì)瘤組織中甲基化頻率明顯升高；同時還發(fā)現(xiàn)，腦膠質(zhì)瘤組織WHO分級越高，NPAS2時鐘基因啟動子區(qū)甲基化頻率越高。以上研究結(jié)果說明，NPAS2基因啟動子區(qū)甲基化可能是腦膠質(zhì)瘤發(fā)生的原因之一。

綜上所述，腦膠質(zhì)瘤患者時鐘基因的異常表達(dá)可能與時鐘基因啟動子區(qū)甲基化的改變有關(guān)。NPAS2、PER2時鐘基因啟動子區(qū)甲基化頻率明顯增高；NPAS2時鐘基因啟動子區(qū)甲基化頻率越高，腦膠質(zhì)瘤的惡性程度越高。NPAS2、PER2時鐘基因啟動子區(qū)DNA甲基化修飾可能是腦膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制。

[1] Vinciguerra M,Mazzoccoli G,Piccoli C,et al.Exploitation of host clock gene machinery by hepatitis viruses B and C[J].World J Gastroenterol,2013,19(47):8902-8909.

[2] Partonen T.Clock gene variants in mood and anxiety disorders[J].J NeuralTransm(Vienna),2012,119(10):1133-1145.

[3] Yu E A,Weaver D R.Disrupting the circadian clock:gene-specific effects on aging,cancer,and other phenotypes[J].Aging(Albany NY),2011,3(5):479-493.

[4] Chen Y,Hu F,Zhou Y,et al.MGMT promoter methylation and glioblastoma prognosis:a systematic review and meta-analysis[J].Arch Med Res,2013,44(4):281-290.

[5] Xue X,Liu F,Han Y,et al.Silencing NPAS2 promotes cell growth and invasion in DLD-1 cells and correlated with poor prognosis of colorectal cancer[J].Biochem Biophys Res Commun,2014,450(2):1058-1062.

[6] Li H X,Fu X J,Yang K,et al.The clock gene PER1 suppresses expression of tumor-related genes in human oral squamous cell carcinoma[J].Oncotarget,2016,7(15):20574-20583.

[7] Jiang W,Zhao S,Jiang X,et al.The circadian clock gene Bmal1 acts as a potential anti-oncogene in pancreatic cancer by activating the p53 tumor suppressor pathway[J].Cancer Lett,2016,371(2):314-325.

[8] 林慶玲,蔡彥寧,丁暉,等.帕金森病患者時鐘基因啟動子區(qū)甲基化分析[J].首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2011,32(6):767-770.

[9] Xia H C,Niu Z F,Ma H,et al.Deregulated expression of the Per1 and Per2 in human gliomas[J].Can J NeurolSci,2010,37(3):365-370.

[10] Niu Z F,Li Y H,Fei Z,et al.Circadian genes Per1 and Per2 increase radiosensitivity of glioma in vivo[J].Oncotarget,2015,6(12):9951-9958.

[11] Luo Y,Wang F,Chen L A,et al.Deregulated expression of cry1 and cry2 in human gliomas[J].Asian Pac J Cancer Prev,2012,13(11):5725-5728.

[12] Chen Z,Liu P,Li C,et al.Deregulated expression of the clock genes in gliomas[J].TechnolCancer Res Treat,2013,12(1):91-97.

[13] Wang F,Li C,Yong L,et al.The circadian gene clock plays an important role in cell apoptosis and the DNA damage response in vitro[J].TechnolCancer Res Treat,2016,15(3):480-486.

[14] Jung C H,Kim E M,Park J K,et al.Bmal1 suppresses cancer cell invasion by blocking the phosphoinositide 3-kinase-Akt-MMP-2 signaling pathway[J].OncolRep,2013,29(6):2109-2113.

[15] Madden M H,Anic G M,Thompson R C,et al.Circadian pathway genes in relation to glioma risk and outcome[J].Cancer Causes Control,2014,25(1):25-32.

Methylation status of clock gene promoter region in glioma patients

DU Quan,YU Wenhua,DONG Xiaoqiao,et al.Department of

Neurosurgery,Hangzhou First People's Hospital,Nanjing Medical University,Hangzhou 310006,China

Objective To investigate the methylation status of PER1,PER2,CRY1,CRY2,CLOCK,BMAL1 and NPAS2 gene promoter regions in glioma tissues and its clinical significance. Methods The frequencies of methylation of PER1,PER2,CRY1,CRY2,CLOCK,BMAL1 and NPAS2 gene promoters were determined in glioma tissues and in surrounding non-glioma tissues (control group)were detected by methylation-specific PCR method. Results PER1 and CLOCK genes were devoid of methylation in promoter region.Differences in the promoter methylation frequencies of CRY1,CRY2 and BMAL1 genes between glioma and control group were not significant(PP＞0.05).Promoter methylation frequencies of NPAS2 and PER2 genes were significantly were elevated in glioma tissue compared to control group(P＜0.05),and moreover,promoter methylation frequency of NPAS2 was enhanced with increasing extent of malignancy(P＜0.05).Conclusion DNA-methylation modification in the promoter ofNPAS2 and PER2 genes may be an important mechanism underlying occurrence and development ofglioma.

Glioma PromoterMethylation Clock gene

2016-10-17）

（本文編輯：陳丹）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.19.2016-1656

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目（2014KYA168）

310006 杭州市第一人民醫(yī)院（南京醫(yī)科大學(xué)附屬杭州醫(yī)院）神經(jīng)外科

俞文華，E-mail：ywh699@126.com