唐靚，羅濤，楊亞冬，張文元*（浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 保健食品研究所，浙江 杭州3003；浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，浙江 杭州3003）

四氯化碳皮下注射誘導(dǎo)兔肝纖維化模型

唐靚1，羅濤2，楊亞冬2，張文元2*（1浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 保健食品研究所，浙江 杭州310013；2浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，浙江 杭州310013）

目的采用四氯化碳 （CCl4）皮下注射誘導(dǎo)兔肝纖維化模型。方法36只新西蘭白兔隨機(jī)分組：實(shí)驗(yàn)組30只、對照組6只。實(shí)驗(yàn)組開始2周頸背部皮下注射50%CC l4橄欖油0.3m L／kg，隨后10周注射0.2m L／kg，每周各2次；對照組注射等量橄欖油。實(shí)驗(yàn)組及對照組分別于第4、8、12周末，檢測兔肝臟功能生化指標(biāo)的變化，以及肝臟大體和組織病理學(xué)變化，觀察肝纖維化的發(fā)展程度。結(jié)果造模期間實(shí)驗(yàn)組家兔死亡6只，動物死亡率20%，對照組家兔無死亡。實(shí)驗(yàn)組兔肝臟纖維化程度隨造模時間延長而逐漸加重，血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和γ－谷氨酰轉(zhuǎn)移酶均明顯升高，肝組織出現(xiàn)假小葉結(jié)構(gòu)，造模成功率為80%。對照組肝臟功能以及組織學(xué)結(jié)構(gòu)正常。結(jié)論長期持續(xù)給予四氯化碳可導(dǎo)致家兔的肝纖維化形成，成模率較高，并有較明顯的階段性變化，可進(jìn)一步用于相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。

新西蘭白兔；肝纖維化；動物模型；四氯化碳

0 前言

肝纖維化 （hepatic fibrosis）是肝臟受到各種外界損傷時的一種慢性修復(fù)反應(yīng)，是各種慢性肝病發(fā)展過程中肝內(nèi)纖維生成與降解失衡，造成肝臟內(nèi)纖維結(jié)締組織異常增生和膠原過度沉積［1］。肝纖維化是慢性肝病的重要病理特征，也是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)階段。肝纖維化可以經(jīng)過治療后逆轉(zhuǎn)，發(fā)展為肝硬化時則難以逆轉(zhuǎn)。阻斷甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化已成為慢性肝病治療中的一個關(guān)鍵問題［2］。因此，建立肝纖維化動物模型是開展肝纖維化診斷與防治研究的重要手段，也是進(jìn)行人體研究的前提［3］，以實(shí)現(xiàn)早期診斷，篩選有效的治療藥物防治肝纖維化。應(yīng)用四氯化碳 （carbon tetrachloride，CCl4）建立肝纖維化動物模型，是最經(jīng)典、最常用的方法，但缺點(diǎn)是CCl4連續(xù)多次給藥后動物死亡率較高。既往研究較多采用CCl4誘導(dǎo)大小鼠［4－5］等動物，但大小鼠肝臟體積小、血容量少，不利于生化指標(biāo)檢測及介入性治療［6］。兔肝臟大小適中，血容量大，本實(shí)驗(yàn)選用家兔造模。造模的難點(diǎn)是掌握合適的CCl4濃度和劑量，本實(shí)驗(yàn)擬尋找合適的CCl4濃度和劑量，建立兔肝纖維化模型，并對實(shí)驗(yàn)過程中肝功能和組織病理學(xué)的動態(tài)改變進(jìn)行觀察，分階段觀察造模過程中動物的肝臟功能和組織病理學(xué)變化。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

CCl4（分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司），自動生化分析儀 （日本日立公司）。新西蘭白兔，4月齡，體重2.1 kg左右，雄性，由浙江省實(shí)驗(yàn)動物中心提供及飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量合格證號：SCXK （浙）2013－0055號。

1.2 方法

1.2.1 肝纖維化模型的建立

健康新西蘭白兔36只，實(shí)驗(yàn)前血常規(guī)、肝功檢查均正常，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組30只、對照組6只，每籠單只飼養(yǎng)。取CCl4和橄欖油，按體積比1∶1配制，充分搖勻，制成濃度50%的CCl4。實(shí)驗(yàn)組開始2周于背中部以上頸部以下皮下注射50%CCl40.3mL／kg，一次性注射器注射，每周注射2次；隨后10周注射0.2mL／kg，每周注射 2次，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)動物實(shí)際狀態(tài)，適當(dāng)減少注射次數(shù)或劑量。對照組均注射等量橄欖油。基礎(chǔ)顆粒狀飼料與自來水喂食、飲用。飼養(yǎng)兔房符合建立兔肝纖維化模型的實(shí)驗(yàn)條件。

1.2.2 血生化指標(biāo)檢測

分別于第4、8和12周末，各組動物禁食12 h后取兔耳中央動脈血樣，離心后取上層血清，送肝功能檢測：谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase， ALT）、 谷 草 轉(zhuǎn) 氨 酶 （aspartate aminotransferase， AST）、 γ－谷氨酰轉(zhuǎn)移酶 （γ－glutam ltransferase， γGT）、 總蛋白 （total protein， TP）、 白蛋白 （albumin，ALB）、 球蛋白 （g lobulin，GLO）、 白球蛋白比值 （albumin／globulin，A／G）。檢測兔肝臟功能變化。

1.2.3 肝臟標(biāo)本大體觀察和病理學(xué)檢查

于造模第4、8周末，每個時間點(diǎn)各隨機(jī)處死實(shí)驗(yàn)組4只、對照組1只，并于第12周末將剩余的動物全部處死。大體觀察肝臟的顏色、質(zhì)地、體積和表面變化后，行組織病理切片檢查。適量新鮮肝臟用10%甲醛固定，石蠟包埋、切片，蘇木精－伊紅 （HE）染色和Masson染色。光鏡觀察肝臟組織病理學(xué)變化，以及肝纖維化的發(fā)展程度情況。2名病理學(xué)人員按Scheuer制定的肝纖維化分期評估方案，對肝纖維化程度進(jìn)行評價(jià) （分5期：S0～S4， 相應(yīng)計(jì)分0～4分）［7］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 兔常規(guī)大體觀察

正常對照組家兔狀態(tài)如常，造模期間無死亡，體重增加明顯 （表 1）。

實(shí)驗(yàn)組隨造模時間的延長，家兔的活動逐漸減少，狀態(tài)呆滯，毛發(fā)逐漸失去光澤，脫毛逐漸增多，飲食、飲水減少，體重?zé)o明顯增加，有些甚至降低 （表1）。實(shí)驗(yàn)組造模期間共24只家兔完成實(shí)驗(yàn)，6只死亡，病死率為20%。死亡大多發(fā)生在給藥后4周之前，6周之后基本上趨于穩(wěn)定。

表1 兩組實(shí)驗(yàn)兔的體重變化比較 （±s，kg）

表1 兩組實(shí)驗(yàn)兔的體重變化比較 （±s，kg）

注：與同期對照組相比，*P<0.05，#P<0.01。

組別 0 week 4 weeks 8 weeks 12 weeks實(shí)驗(yàn)組 2.18±0.25 2.29±0.35 2.34±0.39* 2.45±0.45#對照組 2.12±0.22 2.46±0.34 2.75±0.42 3.17±0.48

2.2 肝臟表面觀察

對照組肝臟表面呈現(xiàn)鮮紅色，表面無顆粒和結(jié)節(jié)，光滑柔軟，肝緣銳利，形態(tài)與大小均正常。實(shí)驗(yàn)組隨造模時間的延長，肝纖維化逐漸加重，肝緣逐漸變鈍，表面顆粒狀逐漸加重，被膜腫脹；4周時肝臟質(zhì)地稍韌，稍有變暗，表面有很輕微的顆粒狀改變；8周時肝臟呈暗紫色，表面有較輕微的顆粒狀改變；12周時肝臟呈灰褐色，表面有明顯的顆粒狀改變。

2.3 組織病理學(xué)觀察

HE、Masson染色顯示，對照組肝小葉結(jié)構(gòu)完整清楚，肝細(xì)胞排列整齊完整，肝細(xì)胞呈放射狀排列。

實(shí)驗(yàn)組隨造模時間延長，組織結(jié)構(gòu)破壞逐漸加重，肝內(nèi)膠原纖維和網(wǎng)狀纖維組織增生逐漸增多，肝細(xì)胞脂質(zhì)變性、壞死逐漸加重；誘導(dǎo)8周時匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤，肝小葉正常結(jié)構(gòu)減少，膠原纖維增生，呈早期纖維化癥狀 （圖1、圖2）；誘導(dǎo)12周后，肝小葉正常結(jié)構(gòu)消失，肝組織呈現(xiàn)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，肝細(xì)胞脂肪變性嚴(yán)重，肝細(xì)胞排列紊亂，間質(zhì)膠原纖維增生嚴(yán)重，假小葉結(jié)構(gòu)形成，匯管區(qū)及其竇周淤血現(xiàn)象嚴(yán)重，肝細(xì)胞呈現(xiàn)彌漫性壞死，呈重度肝纖維化癥狀 （圖3、圖4）。實(shí)驗(yàn)組的造模成功率為80%。

圖1 實(shí)驗(yàn)組造模8周肝組織HE染色 （×100）

圖2 實(shí)驗(yàn)組造模8周肝組織Masson 染色 （×100）

圖3 實(shí)驗(yàn)組造模12周肝組織HE染色 （×100）

圖4 實(shí)驗(yàn)組造模12周肝組織Masson染色 (×100)

不同時間點(diǎn)病理學(xué)檢查結(jié)果分期情況見表2。

表2 不同時間點(diǎn)的病理學(xué)檢查結(jié)果分期情況

表3 實(shí)驗(yàn)動物不同時間點(diǎn)動脈血清生化指標(biāo)變化

2.4 肝功能檢查脈血生化指標(biāo)的變化

實(shí)驗(yàn)動物不同時間點(diǎn)的血清生化指標(biāo)變化見表3。家兔血生化指標(biāo)隨著注藥時間的延長，谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、γ－谷氨酰轉(zhuǎn)移酶均明顯升高，白球蛋白比值逐漸下降，球蛋白逐漸升高。

3 討論

肝臟是營養(yǎng)代謝和解除機(jī)體外來有毒化學(xué)藥物、毒物的主要器官。肝臟的其他功能是幫助消化、生產(chǎn)無價(jià)的內(nèi)源激素、酶，以及禁食時生產(chǎn)葡萄糖等。近年來慢性肝臟疾病越來越多，醫(yī)學(xué)上治療這些疾病通常是困難的，效果有限。肝纖維化是慢性肝病的一個共性，如果損傷因素長期不能去除，就會發(fā)展成肝硬化，嚴(yán)重?fù)p傷肝臟功能，由于其較高的發(fā)病率和死亡率，被認(rèn)為是一個重要的醫(yī)學(xué)問題［8］。阻斷、逆轉(zhuǎn)肝纖維化已成為慢性肝病治療中的一個重要環(huán)節(jié)［9－10］。 因此，建立能全面、準(zhǔn)確地反映肝纖維化本質(zhì)的動物模型尤為重要。

CCl4是親肝毒物，是經(jīng)典的動物肝纖維化造模藥物。其特點(diǎn)為成模率高、費(fèi)用低廉、病理特征穩(wěn)定可靠、復(fù)制時間短、重復(fù)性好、方法簡便，目前作為肝纖維化造模的主要方法［11－12］。其缺點(diǎn)是CCl4連續(xù)多次給藥后動物死亡率高。本實(shí)驗(yàn)選用適量CCl4誘導(dǎo)家兔肝纖維化造模，皮下注射誘導(dǎo)12周，實(shí)驗(yàn)組的造模成功率為80%，動物死亡率為20%。死亡動物肝臟病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)其原因主要為急性肝壞死。

隨著造模時間的延長，實(shí)驗(yàn)組的白球蛋白比值逐漸下降，球蛋白逐漸升高，說明肝細(xì)胞發(fā)生病變，肝臟的代謝功能發(fā)生障礙，兔肝臟功能受損；ALT、AST、γGT顯著增高，表明CCl4可造成肝臟損害。誘導(dǎo)12周后，肝小葉正常結(jié)構(gòu)消失，肝組織呈現(xiàn)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，肝細(xì)胞脂肪變性嚴(yán)重，肝細(xì)胞排列紊亂，間質(zhì)膠原纖維增生嚴(yán)重，假小葉結(jié)構(gòu)形成，匯管區(qū)及其竇周淤血現(xiàn)象嚴(yán)重，肝細(xì)胞呈現(xiàn)彌漫性壞死，呈重度肝纖維化癥狀。本實(shí)驗(yàn)利用適量CCl4皮下注射成功誘導(dǎo)出兔肝纖維化模型，為以家兔為實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行肝纖維化的研究打下了基礎(chǔ)。

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Liver Fibrosis Model in Rabbit Induced by Subcutaneous Injection of Carbon Tetrachloride

TANG Liang1,LUO Tao2,YANG Yadong2,ZHANG Wenyuan2*
(1Institute of Health Food,Zhejiang Academy of Medical Sciences,Hangzhou 310013,China;2Institute of Bioengineering,Zhejiang Academy of Medical Sciences,Hangzhou 310013,China;*Corresponding author:ZHANG Wenyuan,E-mail:zhangwy61@163.com)

ObjectiveTo use subcutaneous injection of carbon tetrachloride(CCl4)to induce hepatic fibrosis model in rabbit.Methods36 New Zealand white rabbits were divided into the experimental group(n=30)and the control group(n=6)random ly.The rabbits of experimental group were treated by subcutaneous injection of 50%CCl40.3m L/kg in olive oil tw ice a week for the initial two weeks,then were treated by subcutaneous injection of 50%CCl40.2m L/kg in olive oil twice a week for the next10 weeks.The rabbits of control group were treated by same amount of olive oil.Rabbits' liver function,biochemical indicators,liver gross,his to pathological changes and hepatic fibrosis degree were detected in experimental group and control group at4th,8th,and 12thweek respectively.Results6 rabbits were dead in experimental group during the period of molding,and animal mortality rate was 20%.No dead case was found in control group.In experimental group,rabbits' liver fibrosis degree increased gradually with molding time extension.Serum alanine aminotransferase,aspertate aminotransferase,and gamma glutamyl transpeptidase increased significantly,while their liver tissue appeared false flocculus structure,and molding success rate was 80%.The liver function and histological structure of control group were normal.Conclusions Injecting CCl4for a long time may lead to the formation of liver fibrosis in rabbits,with significant difference in different time and high success rate.The model can be used further in related experiments.

New Zealand white rabbit;Liver fibrosis;Animal models;Carbon tetrachloride

R-332

A

10.3969/j.issn.1674-4659.2017.10.1358

2017－04－06

2017－06－26

浙江省科技計(jì)劃公益技術(shù)研究社會發(fā)展項(xiàng)目 （項(xiàng)目編號：2015C33109）；浙江省科研院所專項(xiàng) （項(xiàng)目編號：2016F10002）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目 （項(xiàng)目編號：2016KYB071，2017KY299）

唐靚 （1979－），男，浙江杭州人，碩士學(xué)位，助理研究員，主要從事生物技術(shù)工作。

*通訊作者：張文元 （1961－），男，碩士學(xué)位，研究員，研究方向：組織工程； E－mail： zhangwy61＠163.com。

（責(zé)任編輯：常海慶）