肖澤彬 王 容 唐作華 馮曉源 錢 雯 熊 佶王 杰 吳靈捷 鐘玉鳳 王文韜

實驗研究

單眼致盲后大鼠視覺通路錳增強磁共振成像的實驗研究

肖澤彬1王 容1唐作華1馮曉源2錢 雯1熊 佶3王 杰4吳靈捷5鐘玉鳳6王文韜7

目的：探討單眼盲大鼠視覺通路錳增強磁共振成像（ME MRI）的形態(tài)學(xué)改變，并與病理結(jié)果相對照，探尋是否建立新的視覺代償通路及視覺與聽覺中樞是否有神經(jīng)纖維聯(lián)系。方法：14只健康新生雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠隨機分為雙眼盲組（Group A）與正常組（Group B）（每組n=7），采用右眼視神經(jīng)離斷法使大鼠致盲，盲后4個月分別經(jīng)兩組大鼠的左側(cè)玻璃體內(nèi)注入0．2M MnCl2，24h后比較MEMRI表現(xiàn)，并與病理結(jié)果相對照，以幫助確定視覺代償通路的產(chǎn)生。結(jié)果：MEMRI顯示單眼盲大鼠左側(cè)視覺通路代表結(jié)構(gòu)（視神經(jīng)、視束、外側(cè)膝狀體、上丘及視皮層）的對比度(CNR)明顯高于右側(cè)(P＜0．001)，而比正常大鼠的左眼的視覺通路信號稍差 (P＜0．05)。 MEMRI表現(xiàn)與病理結(jié)果具有較好一致性。結(jié)論：新生大鼠單眼致盲4個月后，ME MRI改變結(jié)合病理結(jié)果，提示雙側(cè)視覺通路有功能重組。

MnCl2；磁共振成像；視覺通路；錳離子增強磁共振成像；單眼盲

目前，探究單眼視覺障礙患者視覺中樞各結(jié)構(gòu)是否發(fā)生不可逆性改變已成為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的熱點問題，它關(guān)系到人工視覺和基因治療的可行性及治療靶點的選擇[1]。盡管目前有關(guān)單眼視覺障礙引起視皮層等視覺中樞改變的研究報道較多，但以往多關(guān)注單眼視覺剝奪引起視覺中樞的改變。而關(guān)于單眼致盲后的視覺障礙，仍以視覺誘發(fā)電位（VEP）、辣根過氧化物酶（HRP）、免疫熒光造影劑及磁共振波譜（MRS）等研究方法為主[2-3]。錳增強磁共振成像（manganese-enhanced MRI，ME MRI）能客觀、直接、完整地顯示神經(jīng)纖維和腦皮層形態(tài)[4]，近年來已被廣泛用于活體動物的視覺通路的成像研究。然而，利用ME MRI研究單眼致盲后雙側(cè)視覺通路改變至今鮮有文獻(xiàn)報道。本文利用MEMRI來研究單眼盲大鼠雙側(cè)視路的ME MRI表現(xiàn)，并與病理結(jié)果相對照，進(jìn)一步探尋單眼致盲后是否建立新的視覺代償通路及視覺與聽覺中樞是否有神經(jīng)纖維聯(lián)系。

方 法

1． 實驗動物與分組

本動物實驗通過研究生院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，選取復(fù)旦大學(xué)實驗動物科學(xué)部提供的14只健康雄性Sprague-Dawley（SD）新生大鼠（出生后約一周），平均體重250±30g。采用隨機數(shù)字表法隨機分為單眼盲組（Group A）和對照組（Group B）（每組n=7）。實驗前禁水、禁食約12h。體溫維持在38℃。大腿后上部肌群肌注氯胺酮和甲苯噻嗪混合液分別約0．1ml（視神經(jīng)離斷法）、0．3ml（玻璃體內(nèi)給藥）及0．4ml（MR檢查），俯臥位分別固定于自制模板及大鼠專用磁共振線圈。

2． 模型制備

采用視神經(jīng)離斷法，先剪開右側(cè)顳側(cè)球結(jié)膜，鈍性分離球筋膜組織直至清晰暴露球后視神經(jīng)?？p線在眼球正上方偏鼻側(cè)方的結(jié)膜，向鼻下方牽引，在其上方剪一切口，緊貼鞏膜向后尋找視神經(jīng)，離鞏膜0．5mm處剪斷視神經(jīng)，并將斷段取下，即可確定視神經(jīng)完全離斷，縫合結(jié)膜并予復(fù)位，結(jié)膜囊內(nèi)涂托百士眼膏。

3． 左眼玻璃體內(nèi)注射MnCl2過程

將已麻醉的單眼致盲4個月后的大鼠放在已消毒的鋪巾上，先用鹽酸奧布卡因表面麻醉，潔霉素滴眼液滴入眼內(nèi)幾滴，將一小段皮管（輸液皮條管煎成）放在左眼角膜中央，使水面成凹面向上。調(diào)整顯微鏡后，即可顯示視網(wǎng)膜、視乳頭及其周圍眼底血管，先用一次性1ml注射針經(jīng)角鞏膜緣外側(cè)約1～2mm處進(jìn)針，可以看到在視乳頭上方，扎入玻璃體內(nèi)（切忌深達(dá)視乳頭和血管表面，以防眼底出血），注入0．2M MnCl22μl+0．5μl氣泡（氣泡在大鼠玻璃體內(nèi)，使膠樣狀態(tài)的玻璃體變成透明狀態(tài)，錳離子分子容易彌散開，從而使視網(wǎng)膜易于吸收錳離子），注射速度約為0．1μl/min，約15～20 min后，注射完留針5min，緩慢拔針。模型建立成功標(biāo)致：給藥后24h行大鼠磁共振常規(guī)平掃T1WI掃描，大鼠右側(cè)上丘T1WI呈高信號，說明視覺通路模型建立成功，如未見高信號區(qū)，表示未成功。

4． 磁共振成像掃描技術(shù)

在 Siemens-Magnetom Verio 3．0T MR 掃 描儀上完成，梯度場45mT/m，最大切換率200T/m/s。信號采集線圈為大鼠專用線圈。肌注全麻，俯臥位放置于線圈內(nèi)，頭部位于線圈中央位置。薄布單覆蓋保暖，膠帶固定大鼠胸部以適當(dāng)限制呼吸運動。掃描序列及主要參數(shù)：三平面定位掃描后，行全腦T1WI軸位、T1WI 3D FLASH（fast low angle shot，F(xiàn)LASH）矢狀位掃描。主要掃描參數(shù)：T1WI采用自旋回波序列（spin echo，SE），TE/TR=13ms/400ms，F(xiàn)OV=78mm×78mm，層厚1．5mm，層間距0mm，矩陣256×256，激勵次數(shù)2次，翻轉(zhuǎn)角90°，掃描層數(shù)8層。T1WI 3D FLASH成 像， 采 用 GRE序 列，TE/TR=4．3ms/12ms，F(xiàn)OV=78mm×78mm， 層 厚 0．2mm， 矩 陣384×384，激勵次數(shù)12次，翻轉(zhuǎn)角25°，掃描層數(shù)112層。總掃描時間約40min。

5． 數(shù)據(jù)后處理

將所有數(shù)據(jù)全部傳送至西門子磁共振后處理工作中，并重建雙側(cè)視覺通路全程的多平面重組圖像、最大密度投影及薄層最大密度投影的圖像。

6．圖像分析

磁共振圖像分析在西門子后處理工作中完成。兩組大鼠經(jīng)ME MRI檢查后，分別測定各解剖結(jié)構(gòu)的信號強度值（signal intensity，SI）。視覺通路信號強度通過在左側(cè)視神經(jīng)、右側(cè)視束、右側(cè)外側(cè)膝狀體、右側(cè)上丘和右側(cè)視皮層等不同解剖部位的中央?yún)^(qū)勾畫感興趣區(qū)（region of interest，ROI）獲得，ROI大小約2～3mm2。通過磁共振自帶軟件分析，可直接測得ROI平均信號強度值及信號標(biāo)準(zhǔn)差值（standard deviation，SD）。通過下列公式定義參數(shù)CNR（contrast-to-noise ratio，CNR）=0．665（SMn-S0）/ SDair，其中SMn和S0分別表示注入MnCl2后強化的和正常大鼠未強化（同側(cè)）的視神經(jīng)、視束、外側(cè)膝狀體、上丘、視皮層等部位興趣區(qū)內(nèi)的SI值，SDair為空氣中感興趣區(qū)內(nèi)的兩次信號強度的SD平均值。

7． 病理學(xué)檢查

ME MRI檢查后的大鼠行多聚甲醛灌流并取腦固定。于10%中性甲醛固定液中兩次固定約2天至1周，經(jīng)軸位、冠狀位、矢狀位分別切取視神經(jīng)、視束、外側(cè)膝狀體、視皮層的標(biāo)本染色。經(jīng)大腦半球視覺通路代表區(qū)的矢狀位連續(xù)石蠟切片，厚度4μm，并行HE和快藍(lán)（LFB）染色。視覺通路定位參照Georg Paxinos&Charles Watson所著大鼠腦立體定位圖譜。顯微鏡下，觀察雙側(cè)視覺通路的大體改變情況，包括整個通路及各個重要解剖結(jié)構(gòu)的具體部位、形態(tài)、大小、范圍、粗細(xì)、色澤等特點，并比較雙側(cè)是否對稱。

8．統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 18．0統(tǒng)計軟件，致盲側(cè)與未致盲側(cè)、致盲側(cè)與正常大鼠視覺通路CNR差異采用單因素方差分析和post-hoc Bonferroni多重比較分析，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

單眼致盲后4個月，左眼注入0．2 M MnCl224h后，7例大鼠T1WI均顯示右側(cè)上丘信號增高，表明單眼致盲后4個月后ME MRI造模成功，造模成功率100%（7/7）。再行T1WI 3D FLASH掃描，經(jīng)過三維重建后處理，TSMIP通過旋轉(zhuǎn)均可立體觀察到完整的視覺通路。

表1 右眼致盲后，左側(cè)視覺通路分別與右側(cè)及左側(cè)正常視覺通路ME MEI對比度（CNR）比較

如表1所示，單眼致盲4個月后大鼠的致盲眼（右眼）與未盲眼（左眼）MEMRI顯示的視覺通路信號有明顯不同，左側(cè)視覺通路各代表結(jié)構(gòu)(包括視神經(jīng)、視束、外側(cè)膝狀體、上丘及視皮層)的對比度(CNR)明顯高于右側(cè)，即信號明顯較右側(cè)更亮，且差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．001)。未致盲眼與正常大鼠左眼ME MRI顯示的視覺通路信號稍有不同，即左側(cè)視覺通路各代表結(jié)構(gòu)的信號較正常稍差，此差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)。此外，本組研究發(fā)現(xiàn)一只單眼盲大鼠雙側(cè)視皮層及下丘信號略增高。

正常組及單眼盲組大體觀察顯示，單眼盲組右側(cè)視神經(jīng)已斷，斷端后神經(jīng)纖維紊亂或糾纏，似與周圍纖維糾纏在一起，為本身纖維紊亂或異常反應(yīng)增生所致。單眼盲組中有三只大鼠視束、外側(cè)膝狀體、上丘及視皮層萎縮變小。另外，單眼盲組左側(cè)視神經(jīng)及視交叉部分有扭曲增粗，外側(cè)膝狀體亦有增粗、扭曲，為注入 MnCl2 后引起水腫或代償所致可能（圖1）。

圖1 左眼玻璃體內(nèi)注入 0．2 M MnCl2。A．右眼致盲，左眼經(jīng)ME MRI顯示的視覺通路；B．正常大鼠經(jīng)ME MRI顯示雙側(cè)視覺通路的大體標(biāo)本；C．右眼致盲，經(jīng)ME MRI顯示雙側(cè)視覺通路的大體標(biāo)本。注：視神經(jīng)(綠箭)、視交叉(藍(lán)箭)、視束(黃箭)、LGN(黑箭)、上丘(白箭)、視放射(紅箭)及視皮層(紫箭)。

視覺通路 HE 及 LFB 染色顯示，與正常組相比，單眼盲組右側(cè)視神經(jīng)纖維已斷，殘余段萎縮變小并被肌肉替代，周圍或伴有增生纖維纏結(jié)，并見長條狀堆積排列的藍(lán)色(HE染色)或紫色(LFB染色)細(xì)胞核為少枝突膠質(zhì)細(xì)胞或星形細(xì)胞包裹神經(jīng)纖維。單眼盲組中，有三只大鼠左側(cè)視束、視交叉、外側(cè)膝狀體、上丘均較右側(cè)變細(xì)。此外，所有大鼠雙側(cè)聽皮層均大致對稱，未見與視皮層、上丘或外側(cè)膝狀體有神經(jīng)纖維聯(lián)系（圖2）。

圖2 A．雙側(cè)視束及 LGN 等 HE 染色；B．雙側(cè)視束及 LGN 等 LFB 染色；C．ME MRI 冠狀位顯示雙側(cè)視束及LGN等；D．大鼠雙側(cè)視束及 LGN 等冠狀位定位圖。注：右側(cè)視束(黃箭)、右側(cè)LGN(黑箭)、左側(cè)視束(橙箭)、左側(cè)LGN(綠箭)、視放射(紅箭)、聽皮層(淺綠箭)及海馬(藍(lán)箭)，LGN： 外側(cè)膝狀體。

討 論

1．錳增強磁共振成像在單眼盲視覺通路中的應(yīng)用價值

隨著人們對于生活質(zhì)量要求的不斷提高，對于青光眼等引起視神經(jīng)功能完全喪失后的單眼失明患者而言，探究視覺中樞各結(jié)構(gòu)是否發(fā)生不可逆性改變顯得尤為重要，亦為未來眼科學(xué)領(lǐng)域炙手可熱的發(fā)展趨勢之一[5]。目前，采用ME MRI方法關(guān)于單眼致盲方面的研究僅見最近Chan等[6]一篇報道，但Chan等[6]未對單眼致盲后的雙側(cè)視束及視皮層等結(jié)構(gòu)的改變情況進(jìn)行研究，我們在以往研究的基礎(chǔ)上，通過利用ME MRI分別比較單眼盲大鼠與正常大鼠的視覺通路的改變情況，且與病理檢查相結(jié)合，以探討單眼致盲后的外側(cè)膝狀體、上丘及視皮層等結(jié)構(gòu)的變化，研究皮層水平的神經(jīng)元是否發(fā)生了跨突觸變性、萎縮或死亡，以便今后為盲人進(jìn)行完整視覺通路的深入研究奠定基礎(chǔ)，指導(dǎo)臨床治療和手術(shù)方案的選擇。

2．單眼致盲后大鼠的雙側(cè)視覺中樞的ME MRI表現(xiàn)

ME MRI顯示致盲眼(右眼)與未盲眼(左眼)的視覺通路信號有明顯不同，左側(cè)視神經(jīng)、視束、外側(cè)膝狀體、上丘及視皮層的對比度(CNR)明顯高于右側(cè)，提示當(dāng)單眼致盲后未致盲眼一側(cè)的視覺通路有代償可能，而致盲眼一側(cè)的視路功能退化。同時，單眼致盲后的未致盲眼與正常大鼠的左眼的視覺通路信號稍有不同，前者的左側(cè)視覺通路各代表結(jié)構(gòu)的信號較正常稍差，提示未致盲眼一側(cè)的視覺通路功能亦有所下降。另外，我們尚發(fā)現(xiàn)一只單眼盲大鼠雙側(cè)視皮層亦略增高，此結(jié)果與Toldi等[7]采用電生理方應(yīng)的結(jié)果相一致，認(rèn)為可能由于雙側(cè)視皮層通過胼胝體相互連接和作用而引起[8]，雖然僅一只發(fā)現(xiàn)這一結(jié)果，但因與未致盲眼同側(cè)的視皮層信號本身就較低，而致盲眼側(cè)的信號更低，有時亦就難以觀察到，可以通過增加樣本量進(jìn)行深入研究來證實。此外，有一只大鼠雙側(cè)下丘信號均稍有增高，我們推測可能因為下丘與外側(cè)膝狀體及上丘有關(guān)聯(lián)[9]，因此，當(dāng)一側(cè)單眼致盲4個月后，可通過雙側(cè)外側(cè)膝狀體或上丘將MnCl2(亮信號)傳遞到下丘造成，至于視覺通路在下丘水平是否產(chǎn)生代償，尚須進(jìn)一步研究來驗證，但總體上，我們的MEMEI成像顯示視皮層與聽皮層未見明顯神經(jīng)纖維聯(lián)系。

3．單眼致盲后大鼠的雙側(cè)視覺中樞的病理學(xué)表現(xiàn)

右眼致盲后4個月，雙側(cè)視覺通路的大體觀察發(fā)現(xiàn)致盲眼斷端神經(jīng)纖維紊亂糾纏，可能為異常反應(yīng)增生引起[10]。左眼視神經(jīng)、視交叉及外側(cè)膝狀體均稍增粗或扭曲，可能為代償所致[11]。視覺通路HE及LFB染色鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：右眼視神經(jīng)殘余段萎縮變小并被肌肉替代，周圍或伴有增生纖維纏結(jié)，另見少枝突膠質(zhì)細(xì)胞或星形細(xì)胞包裹神經(jīng)纖維，說明神經(jīng)纖維本身及周圍支持細(xì)胞均有增生反應(yīng)，亦與本組大體解剖及MEMRI結(jié)果均一致。另外，我們發(fā)現(xiàn)三只單眼盲大鼠左側(cè)視束、視交叉、外側(cè)膝狀體及上丘較右側(cè)變細(xì)小，可能為左側(cè)萎縮造成[12]，亦可能為右側(cè)代償增粗或中毒水腫引起[13]。

綜上所述，本組ME MRI結(jié)果基本上均可被病理檢查所驗證，提示新生大鼠單眼致盲4個月后(關(guān)鍵期內(nèi))，致盲眼一側(cè)視覺通路以功能退化為主，而未致盲眼一側(cè)以功能代償為主，雙側(cè)視覺通路可能經(jīng)胼胝體產(chǎn)生相互連接或新突觸，即為一種適應(yīng)性改變。

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Manganese-enhanced MR imaging (MEMRI) in the Study of the Visual Pathway in Experimental Rat models with Monocular Blindness

XIAO Ze-bin1, WANG Rong1, TANG Zuo-hua1, FENG Xiao-yuan2, QIAN Wen1, WANG Jie3,WU Ling-jie4, ZHONG Yu-feng5, WANG Wen-tao6

The Grant of Science and Technology Commission of Shanghai Municipality NO. 09ZR1405600, 14411962000; The Funds for Key Basic Research of Science and Technology Commission of Shanghai Municipality NO. 09JC1403100.

Purpose:To investigate the changes of visual pathway of rats with grown blind eye by MEMRI, and to verify the changes by pathology results.Methods:The operation of optic nerve transection was performed to obtain monocular blindness (right eye) models in 14 newborn normal rats. Four months later (critical period), 0.2M MnCl2 was intravitreally injected into the left eyes, 24h later, MEMRI of visual pathway of right and left eyes were acquired and compared. We aimed to find if there was new visual compensatory pathway by comparing the MEMRI findings of visual pathway in the normal rats and pathology results in monocular blindness rats.Results:Four months after the blindness model was built, MEMRI demonstrated the CNR of visual pathway of the non-blind eye was much higher than that of blind eye (P＜0.001), the CNR of visual pathway of the non-blind eye was slightly lower than that of left eye in normal rat( P＜0.05), the CNR of the non-blind eye was slightly higher than that of right eye accompanied with atrophy in normal rat. The results of MEMRI of visual pathway were con firmed by the pathology results.Conclusion:Four months after the blindness model was built in new born rats, MEMRI and pathology results demonstrated that bilateral different structures of visual pathway of both blind and non-blind eyes were reorganized.

MnCl2; Magnetic resonance imaging; Visual pathway; MEMRI; Monocular blindness

R814.42

A

1006-5741（2017）-04-0385-05

中國醫(yī)學(xué)計算機成像雜志，2017，23：385-389

1復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院放射科

2復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院放射科

3復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院病理科

4復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院放療科

5復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院耳鼻喉科

6復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院放射科

7復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院中心實驗室

通信地址：上海市徐匯區(qū)汾陽路83號，上海市200031

唐作華 （ 電子郵箱：tzh518sunny@163.com）

共同通信作者：馮曉源（電子郵箱：cjr.fengxiaoyuan@vip.163.com）

上海市科委自然科學(xué)基金項目NO. 09ZR1405600，14411962000；上海市科委基礎(chǔ)重點項目NO. 09JC1403100。肖澤彬、王容為共同第一作者

Chin Comput Med Imag，2017，23：385-389

1Department of Radiology, Eye & ENT Hospital of Shanghai Medical School, Fudan University

2 Department of Radiology, Huashan Hospital of Shanghai Medical School,Fudan University

3 Department of Radiotherapy, Eye & ENT Hospital of Shanghai Medical School, Fudan University

4 Department of Otolaryngology, Eye & ENT Hospital of Shanghai Medical School, Fudan University

5 Department of Radiology, Jinshan Hospital of Shanghai Medical School,Fudan University

6 Central Laboratory, Eye & ENT Hospital of Shanghai Medical School,Fudan University

Address: No. 83, Fenyang Rd, Shanghai 200031,P.R.C.

Address Correspondence to TANG Zuo-hua(Email: tzh518sunny@163.com)

Address Co-Correspondence to FENG Xiao-yuan(cjr.fengxiaoyuan@vip.163.com)

2017.04.05;修回時間：2017.05.06)