惠海英，吳娜，宮艷艷，肖生祥

（1.陜西省人民醫(yī)院，西安710068；2.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院，西安710004）

·論著·

Caspase-3、Survivin在UVB誘導(dǎo)HaCaT凋亡細(xì)胞中的表達(dá)

惠海英1，吳娜1，宮艷艷1，肖生祥2

（1.陜西省人民醫(yī)院，西安710068；2.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院，西安710004）

目的探討Caspase-3、Survivin在UVB誘導(dǎo)HaCaT凋亡細(xì)胞中的作用。方法研究對(duì)象為人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、10、20、40、80 mJ/cm2中波紫外線組（UVB）。四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）比色法觀察增殖能力；流式細(xì)胞僅（FCM）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞凋亡；實(shí)時(shí)定量PCR、Western-blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的Survivin、Caspase-3表達(dá)水平。結(jié)果與正常對(duì)照組相比，NB-UVB照射組細(xì)胞增殖抑制作用及凋亡明顯增強(qiáng)（P＜0.05），并隨著照射劑量的增加，其細(xì)胞凋亡作用增加。同時(shí)與正常對(duì)照組相比，不同UVB照射劑量組Caspase-3表達(dá)均增強(qiáng)，其表達(dá)增強(qiáng)程度隨著照射劑量的增加而增加，與正常對(duì)照組相比，10 mJ/cm2照射組，細(xì)胞表達(dá)Survivin水平最高（P＜0.05），20 mJ/cm2組Survivin表達(dá)水平下降，稍低于對(duì)照組水平，40、80 mJ/cm2組Survivin進(jìn)一步下降，較對(duì)照組下降明顯（P＜0.05）。結(jié)論Survivin、Caspase-3參與了UVB誘導(dǎo)HaCaT凋亡細(xì)胞。Survivin表達(dá)水平與UVB輻射劑量有關(guān)。

HaCaT細(xì)胞；凋亡；中波紫外線；生存素；死亡蛋白酶-3

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

1.1.1 材料

1.1.1.1 細(xì)胞人永生化HaCaT細(xì)胞株為第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院皮膚科李承新教授饋贈(zèng)。

1.1.1.2 試劑DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)，噻唑蘭（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）（美國(guó)sigma公司）。Annexin V-FITC/PI雙染法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（美國(guó)BD公司）。Survivin、Caspase-3兔多克隆抗體（美國(guó)SANTA公司）。RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara公司）。PCR引物由上海華大生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.1.2 儀器電泳儀（美國(guó)Bio-RAD公司）、酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek公司）、電轉(zhuǎn)槽（美國(guó)Bio-RAD公司）、流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD-FACScalibur）、FluorChem FC2凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)Alpha Innotech公司）、7500型實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)儀（美國(guó)ABI公司）。SS-03B型光療儀（上海Sigma公司，波長(zhǎng)311 nm）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組本實(shí)驗(yàn)研究共分為5組（正常對(duì)照組，10 mJ/cm2、20 mJ/cm2、40 mJ/cm2和80 mJ/cm24個(gè)劑量組）。

1.2.2 細(xì)胞株培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞株常規(guī)方法復(fù)蘇后，用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的DMEM的低糖培養(yǎng)基，置5%CO2培養(yǎng)箱（37℃，相對(duì)濕度95%）培養(yǎng)，2～3 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制成4×104單細(xì)胞懸液，接種于6孔板后繼續(xù)培養(yǎng)24 h給藥。

1.2.3 UVB照射待細(xì)胞生長(zhǎng)至每孔融合80%～90%時(shí)，吸去培養(yǎng)基，加入2 mL磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffer solution，PBS），細(xì)胞暴露于UVB燈管下，照射距離約為10 cm，給予不同的輻射劑量（10、20、40、80 mJ/cm2）照射。紫外線照射后，吸去PBS，并在各孔中重新加入培養(yǎng)液繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.4 MTT法檢測(cè)HaCaT細(xì)胞增殖率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，0.25%胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為4.0×104/mL，以每孔100 μL接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后去原培養(yǎng)液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)組及正常對(duì)照組各100 μL，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加入MTT（5 ng/mL）20 μL。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，棄上清，加入DMSO 150 μL，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，用酶標(biāo)儀分別測(cè)定培養(yǎng)24、48、72 h吸光度（A570值），細(xì)胞增殖率＝（實(shí)驗(yàn)組平均A值/空白對(duì)照組平均A值）×100%。

1.2.5 流式細(xì)胞儀Annexin V-FITC/PI檢測(cè)HaCaT細(xì)胞早期及中晚期總凋亡率HaCaT細(xì)胞經(jīng)不同照射劑量的UVB照射后24 h，經(jīng)0.25%胰酶細(xì)胞消化液（Trypsin-EDTA）消化，1 500轉(zhuǎn)/min離心6 min，培養(yǎng)液棄去，PBS洗3次，收集的細(xì)胞經(jīng)70%的乙醇4℃固定2 h，14 000轉(zhuǎn)/min離心2 min，固定液棄去，PBS緩沖液（含5 mmol/L EDTA）500 μL進(jìn)行細(xì)胞重懸，以1×binding buffer制成單細(xì)胞懸液，置于流式管，每組設(shè)6個(gè)樣，加Annexin V-FITC 10 μL與PI 5 μL，混勻后室溫下避光孵育15 min，再加入1×binding buffer充分混合后于流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.2.6 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)HaCaT細(xì)胞Caspase-3、Survivin mRNA表達(dá)上一步孵育的細(xì)胞吸去培養(yǎng)液，經(jīng)0.25%胰蛋白酶液分別制成細(xì)胞懸液，分別裝入離心管，1 500轉(zhuǎn)/min離心，收集細(xì)胞，利用TaKaRa細(xì)胞總RNA抽提試劑盒提取各組細(xì)胞總RNA，采用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說(shuō)明書(shū)以RNA為模板反轉(zhuǎn)錄為CDNA，采用熒光定量PCR試劑盒按照說(shuō)明書(shū)以CDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，然后使用ABI 7500 PCR儀進(jìn)行熒光PCR。引物由上海華大生物公司合成，序列見(jiàn)表1。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，每循環(huán)中，94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸45 s，采集熒光信號(hào)；40循環(huán)結(jié)束后，經(jīng)94℃30 s、57℃30 s、72℃45 s，采集熔解曲線。使用7500型Real-time PCR儀分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。以β-actin為內(nèi)參基因，計(jì)算同一樣本中目的基因與內(nèi)參基因的含量比值，評(píng)價(jià)目的基因的表達(dá)水平。每個(gè)樣本取3個(gè)復(fù)孔，PCR重復(fù)3次。

表1 引物序列及產(chǎn)物大小

1.2.7 Western-blot檢測(cè)HaCaT細(xì)胞Caspase-3、Survivin蛋白表達(dá)HaCaT細(xì)胞經(jīng)不同照射劑量的UVB照射后48 h，以含0.1%DMSO的培養(yǎng)基為陰性對(duì)照組。Western blot檢測(cè)Caspase-3、Survivin蛋白表達(dá)水平，β肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參蛋白，按照如下步驟進(jìn)行操作：進(jìn)行處理后細(xì)胞收集，4℃預(yù)冷PBS液洗3次，加入細(xì)胞勻漿液（50 mmol/L This-HCl pH=7.4，1%Triton X-100，0.2 mmol/L蛋白酶抑制劑PMSF，1 mmol/L EDTA），4℃、12 000轉(zhuǎn)/min條件下離心10 min，吸取上清，收集蛋白，收集細(xì)胞后用2×上樣緩沖液處理，檢測(cè)總蛋白濃度，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行蛋白分離，上樣量（30 μg），濕轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜（NC），用50 g/L脫脂牛奶室溫封閉30 min，不同濃度稀釋一抗Caspase-3（1∶1 000）、Survivin（1∶500）、β-actin（1∶1 000）孵育，4℃過(guò)夜，辣根過(guò)氧化酶（HRP）標(biāo)記抗鼠/兔IgG二抗常溫孵育1 h，緩沖液TBST洗膜，化學(xué)發(fā)光試劑顯色、掃描并進(jìn)行吸光度分析、計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS19.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UVB照射對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖活性的影響與對(duì)照組相比，各UVB照射組照射可使細(xì)胞24 h后的增殖率均下降，隨著照射劑量的增加，其細(xì)胞增殖活性逐漸降低（*P<0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 不同處理組的細(xì)胞生長(zhǎng)增殖率

2.2 UVB照射對(duì)HaCaT凋亡細(xì)胞率的影響細(xì)胞處理24 h后，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組相比，各UVB照射組照射可使細(xì)胞凋亡增加，隨著照射劑量的增加，其細(xì)胞凋亡率也增加（*P<0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 不同處理組細(xì)胞凋亡率

2.3 UVB照射對(duì)HaCaT細(xì)胞Caspase-3、Survivin mRNA表達(dá)的影響細(xì)胞處理24 h后進(jìn)行檢測(cè)，與正常對(duì)照組相比，不同UVB照射劑量組Caspase-3 mRNA表達(dá)均增強(qiáng)，其表達(dá)增強(qiáng)程度隨著照射劑量的增加而增加，40、80 mJ/cm2照射組Caspase-3 mRNA明顯增加（*P<0.05）；與正常對(duì)照組相比，10 mJ/cm2照射組，細(xì)胞表達(dá)Survivin水平最高（＃P<0.05），20 mJ/cm2組Survivin下降，稍低于對(duì)照組水平（＃P>0.05），40、80 mJ/cm2組Survivin進(jìn)一步下降，較對(duì)照組下降明顯（＃P<0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 不同處理組Caspase-3、Survivin mRNA表達(dá)

2.4 UVB照射對(duì)HaCaT細(xì)胞Caspase-3、Survivin蛋白表達(dá)的影響細(xì)胞處理48 h后進(jìn)行檢測(cè)，與正常對(duì)照組相比，不同UVB照射劑量組Caspase-3蛋白表達(dá)均增強(qiáng)；而Survivin蛋白的表達(dá)以10 mJ/cm2照射組為最高（P<0.05），其后隨著照射劑量的增加，Survivin蛋白逐漸下降，見(jiàn)圖4。

圖4 Caspase-3、Survivin蛋白表達(dá)

3 討論

自然光中的紫外線輻射是誘發(fā)人類皮膚癌的重要環(huán)境因素。在美國(guó)每年大約有100萬(wàn)人被確診為皮膚癌，皮膚癌也是美國(guó)最常見(jiàn)的癌癥類型之一[3]。動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)證明了UV輻射不僅是腫瘤誘發(fā)劑而且還是腫瘤促進(jìn)劑，關(guān)于紫外線誘導(dǎo)腫瘤的確切機(jī)制仍不清楚，大量研究表明中波紫外線對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的DNA損傷，是誘發(fā)皮膚腫瘤的基礎(chǔ)。由于細(xì)胞凋亡與皮膚腫瘤發(fā)生的相關(guān)性，長(zhǎng)期或大量UVB輻射可誘導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。近年來(lái)紫外線誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡尤其是角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡引起了人們的關(guān)注[4]。

Caspase是執(zhí)行凋亡的主要酶類，被稱為死亡蛋白酶,是細(xì)胞凋亡的中樞效應(yīng)器，細(xì)胞凋亡后期的共同途徑由Caspase激活[5]。Caspase蛋白酶家族在細(xì)胞凋亡中的一個(gè)重要作用是使保護(hù)細(xì)胞遠(yuǎn)離凋亡的各種蛋白失活。Caspase-3處于Caspase蛋白酶系的核心地位，在Caspase酶系級(jí)聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。Caspase-3可能是整個(gè)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)之一，在幾乎所有的凋亡中被最后活化的Caspase分子，被認(rèn)為是凋亡的最終效應(yīng)蛋白。UVB輻射后產(chǎn)生的ROS可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子（Ca2＋），降低線粒體膜電位，激活半胱氨酸蛋白酶（Caspase）蛋白[6]，最終引起細(xì)胞凋亡。

Survivin是新近發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白（IAP）家族中新的一員，于1997年被Ambrosinin在人類基因組庫(kù)的雜交篩選分離出來(lái)，是到目前為止所發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的凋亡抑制因子[7]。Survivin具有調(diào)控細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的雙重功能。Survivin廣泛表達(dá)于人的胚胎組織和各種腫瘤組織,也表達(dá)于少數(shù)正常成人組織,包括人的皮膚組織。在人類皮膚KSCs及黑素細(xì)胞、成纖維細(xì)胞均有表達(dá)。在維持人類角質(zhì)形成細(xì)胞細(xì)胞周期變化及細(xì)胞增殖中起很重要的作用[8]。Survivin通過(guò)抑制其Caspase-3、Caspase-7活性而抑制細(xì)胞凋亡[9]。

筆者以人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT細(xì)胞作為研究對(duì)象，研究了UVB誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞增殖抑制作用及凋亡抑制蛋白Survivin和凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)情況。與正常對(duì)照組相比，NB-UVB照射組細(xì)胞增殖抑制作用及凋亡明顯增強(qiáng)，并隨著照射劑量的增加，其細(xì)胞抑制作用及凋亡增強(qiáng)。同時(shí)與正常對(duì)照組相比，不同NB-UVB照射劑量組Caspase-3表達(dá)均增強(qiáng)，其表達(dá)增強(qiáng)程度隨著照射劑量的增加而增加，與正常對(duì)照組相比，10 mJ/cm2UVB照射組，細(xì)胞表達(dá)Survivin水平最高，20 mJ/cm2組Survivin下降，40、80 mJ/cm2組Survivin進(jìn)一步大幅度下降，較對(duì)照組下降明顯。Survivin的表達(dá)水平先升后降，推測(cè)與其雙重作用即調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，穩(wěn)定細(xì)胞生長(zhǎng)，同時(shí)又抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。低劑量的UVB照射后，Survivin主要發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的作用，而高劑量的UVB照射后，Survivin主要發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡作用。以上結(jié)果表明Survivin、Caspase-3參與了UVB誘導(dǎo)HaCaT凋亡細(xì)胞。同時(shí)Survivin表達(dá)水平與UVB輻射劑量有關(guān)。

[1]Grant WB.Solar ultraviolet irradiance and cancer incidence and mortality[J].Adv Exp Med Biol,2014,810：52-68.

[2]Aoki-Yoshida A,Aoki R,Takayama Y.Protective effect of pyruvate against UVB-induced damage in HaCaT human keratinocytes[J].J Biosci Bioeng,2013,115：442-448.

[3]Haarmann-Stemmann T,Boege F,Krutmann J.Adaptive and maladaptive responses in skin：mild heat exposure protects against UVB-induced photoaging in mice[J].J Invest Dermatol,2013,133：868-871.

[4]Saegusa J,Hsu DK,Liu W,et al.Galectin-3 protects keratinocytes from UVB-induced apoptosis by enhancing AKT activation and suppressing ERK activation[J].J Invest Dermatol,2008,128：2403-2411.

[5]Kavurma MM,Khachigian LM.Signaling and transcriptional control of Fas ligand gene expression[J].Cell Death Differ,2003,10：36-44.

[6]Farrukh MR,Nissar UA,Afnan Q,et al.Oxidative stress mediated Ca（2＋）release manifests endoplasmic reticulum stress leading to unfolded protein response in UV-B irradiated human skin cells[J].J Dermatol Sci,2014,75：24-35.

[7]Katalinic A,Waldmann A,Weinstock MA,et al.Does skin cancer screening save lives：an observational study comparing trends in melanoma mortality in regions with and without screening[J].Cancer,2012,118：5395-5402.

[8]Dallaglio K,Marconi A,Pincelli C.Survivin：a dual player in healthy and diseased skin[J].J Invest Dermatol,2012,132：18-27.

[9]Huang KF,Zhang GD,Huang YQ,et al.Wogonin induces apoptosis and down-regulates survivin in human breast cancer MCF-7 cells by modulating PI3K-AKT pathway[J].Int Immunopharmacol,2012,12：334-341.

Role of Caspase-3 and Survivin in HaCaT Cells Apoptosis Induced by UVB Irradiation

Hui Haiying1,Wu Na1,Gong Yanyan2,Xiao Shengxiang3
1.Shaanxi Provincial People's Hospital,Xi'an 710068,China;2.The Second Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University,Xi'an 710004,China

ObjectiveIn order to evaluate the role of Caspase-3,Survivin in HaCaT cells apoptosis induced by NB-UVB irradiation.MethodsHaCaT cells were divided into five groups,blank control group,10,20,40,80 mJ/cm2UVB radiation groups.After the HaCaT cells were irradiated by UVB,the cell viability measured by MTT assay,and reverse transcription quantitative PCR,Western-blotting were used to detect the expression levels of antiapoptotic gene Surviving,proapoptotic gene caspease-3.ResultsCompared with the control group,the expression of Caspase-3 was significantly increased,but effect-dose relationship could not be seen.Meanwhile the expression of Survivin was markedly up regulated of 10 mJ/cm2UVB radiation group,from 10 mJ/cm2to 80 mJ/cm2UVB radiation group,the Survivin level gradually decreased.ConclusionCaspase-3 and Survivin play an important role in HaCaT cells apoptosis induced by NB-UVB irradiation.The expression level of Survivin is related to the dose of UVB radiation.

HaCaT;Apoptosis;Ultraviolet B;Survivin;Caspase-3

R392.11

A

1672－0709（2017）04-0294－04

近年來(lái),紫外線對(duì)人體的損傷已引起人們的廣泛關(guān)注，資料表明日光中的紫外線特別是中波紫外線（Ultraviolet B,UVB）與皮膚的光老化、光損傷和光致癌的發(fā)生密切相關(guān)，嚴(yán)重威脅著人類的身體健康[1-2]。大量研究表明UVB對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的DNA損傷，是誘發(fā)皮膚癌的基礎(chǔ)。長(zhǎng)期的紫外線輻射會(huì)引起皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞生物學(xué)特性改變，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)、活性及內(nèi)部各種大分子及DNA的損傷，從而引起皮膚表皮層結(jié)構(gòu)和功能變化。但UVB誘導(dǎo)人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞損傷的具體機(jī)制尚不明確，本研究通過(guò)UVB誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞損傷，建立UVB損傷皮膚細(xì)胞模型，選取凋亡蛋白Caspase－3及凋亡抑制蛋白Survivin，通過(guò)觀察HaCaT細(xì)胞增殖活性及凋亡情況，檢測(cè)凋亡抑制蛋白Survivin和凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)水平，以期深入研究UVB輻射損傷的機(jī)制。

陜西省中醫(yī)藥管理局（2015lc039）；陜西省社會(huì)發(fā)展科技攻關(guān)項(xiàng)目（2016sf-156）

惠海英，E-mail：haiyinghui@163.com

2017-01-25）