朱雅琳 馬龍 帕麗達(dá)·阿布利孜

830054烏魯木齊，新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科

普萘洛爾及異丙腎上腺素對(duì)嬰兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞β2腎上腺素受體表達(dá)的影響

朱雅琳 馬龍 帕麗達(dá)·阿布利孜

830054烏魯木齊，新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科

目的探討β2腎上腺素受體在嬰兒血管瘤發(fā)病機(jī)制中的作用。方法嬰兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞分為普萘洛爾組及異丙腎上腺素組。普萘洛爾組再分為10、15、20 μg/ml組、空白組及二甲基亞砜（DMSO）組5組，異丙腎上腺素組再分為5、10、20 μg/ml組、空白組4組。血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞與這些組作用24 h、48 h，用酶聯(lián)免疫吸附法分別測(cè)定每濃度細(xì)胞培養(yǎng)上清液中β2腎上腺素受體的表達(dá)。結(jié)果 作用24 h后，15 μg/ml、20 μg/ml組普萘洛爾與空白組和DMSO組比較，β2腎上腺素受體的表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。48 h后，普萘洛爾組各濃度培養(yǎng)的細(xì)胞，β2腎上腺素受體表達(dá)較空白組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。而異丙腎上腺素組，作用24 h后，10 μg/ml、20 μg/ml組的異丙腎上腺素較空白組β2腎上腺素受體的表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。48 h后，20 μg/ml組異丙腎上腺素培養(yǎng)的細(xì)胞上清液中的β2腎上腺素受體表達(dá)較空白組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。結(jié)論普萘洛爾對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的β2腎上腺素受體表達(dá)的影響下調(diào)，而異丙腎上腺素作用上調(diào)。

血管瘤；嬰兒；內(nèi)皮細(xì)胞；普萘洛爾；異丙腎上腺素；受體，腎上腺素能β2

自Léauté?Labrèze等［1］報(bào)道普萘洛爾治療嬰幼兒血管瘤的療效以來(lái)，大量的病例報(bào)告與研究發(fā)現(xiàn)，普萘洛爾對(duì)嬰兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞（IHEC）的治療起效快，常于給藥后24 h即可使瘤體顏色由紅變紫，組織軟化，大部分IHEC在48 h到1個(gè)月便可出現(xiàn)生長(zhǎng)停滯［2?3］，但其作用機(jī)制尚不明了。由于普萘洛爾為一種β受體拮抗劑，尤其是β2受體在血管瘤發(fā)病機(jī)制中的作用漸成為研究的熱點(diǎn)。本研究通過(guò)普萘洛爾和異丙腎上腺素作用于體外培養(yǎng)的血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞24 h、48 h，用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)β2腎上腺素受體的表達(dá)，從而探討β2腎上腺素受體在嬰兒血管瘤發(fā)病機(jī)制中的作用。

一、資料

1.樣本來(lái)源：血管瘤標(biāo)本來(lái)自臨床手術(shù)切除的血管瘤2例，通過(guò)組織病理診斷為增殖期血管瘤?；純焊改妇炇鹬橥鈺?shū)。

2.試劑與儀器：普萘洛爾（天津力生制藥股份有限公司），異丙腎上腺素（上海豐禾制藥有限公司）。EGM??2MV Bullet試劑盒（瑞士Lonza公司）。兔抗人血友病因子（von Willebrand factor，vwf）多克隆抗體、聚合辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記抗兔IgG、兔抗人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2抗體（VEGFR?2，武漢博士德生物工程有限公司）?？谷薈D31 FITC、鼠 抗 IgG1 K Isotype Control FITC（ 美 國(guó)eBioscience公司），AnnexinV?FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（上海BestBio貝博生物）。MACSQuant流式細(xì)胞儀（德國(guó)Miltenyi Biotec公司）。使用ELISA檢測(cè)β2腎上腺素受體的表達(dá)。

二、方法

1.血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)［4］：手術(shù)切除血管瘤標(biāo)本立即放入無(wú)血清培養(yǎng)基儲(chǔ)存，并迅速移至實(shí)驗(yàn)室超凈臺(tái)處理，然后加入EGM?2培養(yǎng)基并移入25 cm2培養(yǎng)瓶，放入37℃CO2培養(yǎng)箱。24 h后觀察細(xì)胞貼壁，換液。隨后每2～3天換液，細(xì)胞鋪滿(mǎn)瓶底70%～80%以上傳代，所有操作均在超凈臺(tái)完成，全程無(wú)菌操作。

2.含藥物培養(yǎng)基配置：用二甲基亞砜（DMSO）溶解普萘洛爾，然后用EGM?2培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋?zhuān)苽?0、15、20 μg/ml濃度普萘洛爾液；DMSO終濃度為0.16%。同時(shí)用EGM?2培養(yǎng)基稀釋異丙腎上腺素，配制濃度分別為5、10、20 μg/ml含異丙腎上腺素培養(yǎng)基備用。

3.血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞準(zhǔn)備：取前期［5］實(shí)驗(yàn)的原代培養(yǎng)及鑒定后的2～3代血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞，在6孔板中調(diào)整細(xì)胞濃度為3 × 105/ml，每孔2 ml。隨后將6孔板放置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)條件下24 h，鏡下觀察貼壁。隨后換液為含有藥物的培養(yǎng)基。將細(xì)胞分為兩組，用于普萘洛爾和異丙腎上腺素干預(yù)。普萘洛爾組再分空白組、10、15、20 μg/ml組、DMSO組，每組4個(gè)復(fù)孔取均值，分別使用含不同濃度普萘洛爾培養(yǎng)基作用及DMSO和空白培養(yǎng)基作用24 h和48 h。異丙腎上腺素組再分空白組、5、10、20 μg/ml組，每組4個(gè)復(fù)孔取均值，分別用不同濃度異丙腎上腺素培養(yǎng)基作用24 h和48 h，用ELISA分別檢測(cè)各組β2腎上腺素受體表達(dá)。

4.統(tǒng)計(jì)方法：采用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，符合條件使用方差分析進(jìn)行比較，檢驗(yàn)若有差異，則進(jìn)行兩兩比較，方差不齊則使用Dunnett?t檢驗(yàn)。

三、結(jié)果

1.血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞在各種濃度的普萘洛爾培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h、48 h后檢測(cè)β2腎上腺素受體的表達(dá)：作用24 h后，15 μg/ml和20 μg/ml普萘洛爾組較空白組和DMSO組β2腎上腺素受體的表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。48 h后，各濃度組普萘洛爾培養(yǎng)的細(xì)胞β2腎上腺素受體表達(dá)較空白組均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 普萘洛爾各濃度組作用24、48 hβ2腎上腺素受體含量（±s） pg/ml

表1 普萘洛爾各濃度組作用24、48 hβ2腎上腺素受體含量（±s） pg/ml

注：n=4。a：與空白組比較，P＜0.05

組別普萘洛爾組0（空白）10 μg/ml 15 μg/ml 20 μg/ml二甲基亞砜組24 h 48 h 54.13±6.407 41.45±3.618 36.93±4.402a 28.05±7.107a 52.260±3.894 99.03±7.684 81.05±15.38a 71.08±4.229a 67.16±1.444a 97.160±4.112

2.血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞在5、10、20 μg/ml的異丙腎上腺素培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h、48 h檢測(cè)β2腎上腺素受體的表達(dá)：作用24 h后，10 μg/ml和20 μg/ml異丙腎上腺素組較空白組β2腎上腺素受體的表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。48 h后，20 μg/ml組β2腎上腺素受體表達(dá)較空白組增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 異丙腎上腺素處理24、48 h細(xì)胞培養(yǎng)上清液β2腎上腺素受體含量（±s） pg/ml

表2 異丙腎上腺素處理24、48 h細(xì)胞培養(yǎng)上清液β2腎上腺素受體含量（±s） pg/ml

注：n=4。a：與空白組比較，P＜0.05；b：與5 μg/ml比較，P＜0.05；c：與10 μg/ml比較，P＜0.05

組別異丙腎上腺素濃度0（空白）5 μg/ml 10 μg/ml 20 μg/ml 24 h 48 h 52.260±3.894 65.830±6.208 72.650±1.937a 97.230±11.140abc 97.160±4.112 105.300±19.79 132.500±9.943 176.300±15.210abc

四、討論

Denoyelle等［6］在治療血管瘤時(shí)，將糖皮質(zhì)激素與普萘洛爾聯(lián)合應(yīng)用，比單獨(dú)糖皮質(zhì)激素療效更好。在治療嚴(yán)重危及生命的血管瘤患兒時(shí)，普萘洛爾以其不良反應(yīng)小、療效佳的優(yōu)點(diǎn)，臨床已廣泛使用。普萘洛爾是一種非選擇性β腎上腺素受體阻斷劑，可阻斷細(xì)胞膜上β1、β2腎上腺素受體結(jié)合，而對(duì)β3無(wú)作用。β1腎上腺素受體被激活后，與細(xì)胞膜上激活型G蛋白（Gs）耦連，使后者發(fā)生構(gòu)象改變并產(chǎn)生活性，在血管瘤內(nèi)，普萘洛爾通過(guò)抑制β2腎上腺素受體及信號(hào)通路，造成血管收縮，血管瘤內(nèi)供血減少，表現(xiàn)為鮮紅色的增殖期皮膚血管瘤顏色變淺，質(zhì)地變軟。這個(gè)理論可以解釋?zhuān)诜蛰谅鍫柡笱芰龌純翰∏槟軌虻玫窖杆俚母纳疲?］。有研究認(rèn)為［7］，普萘洛爾和β2腎上腺素受體抑制劑均能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，且作用明顯強(qiáng)于β1腎上腺素受體抑制劑。

本研究顯示，使用含有不同濃度的普萘洛爾和異丙腎上腺素的培養(yǎng)基作用于血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞24 h、48 h后，β2腎上腺素受體的表達(dá)受到一定影響。普萘洛爾作用于血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞后，β2腎上腺素受體的表達(dá)下調(diào)，但與藥物濃度和時(shí)間有關(guān)。而異丙腎上腺素的作用恰與普萘洛爾相反，刺激了β2腎上腺素受體的上調(diào)，說(shuō)明β受體阻斷劑對(duì)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞膜表面β2受體表達(dá)影響細(xì)胞增殖。結(jié)合以往研究，普萘洛爾作用于血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞之后，除阻斷受體及其下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，同時(shí)減少血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子2，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的分泌，抑制細(xì)胞增殖外，還下調(diào)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞β2腎上腺素受體的表達(dá)，減少β2腎上腺素受體激動(dòng)信號(hào)的傳入。從而進(jìn)一步抑制細(xì)胞的增殖和分化，而異丙腎上腺素的作用則正好相反。異丙腎上腺素和普萘洛爾對(duì)于β2腎上腺素受體的表達(dá)影響也呈現(xiàn)拮抗，是否與上述的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)，還是在信號(hào)通路之外或有其他的調(diào)節(jié)反饋系統(tǒng)尚不清楚，需要進(jìn)一步研究。

［2］Zheng M,Zhu W.Han Q,et a1.Emerging concepts and therapeutic implications of beta ?adrenergic receptor subtype signaling［J］.Pharmacol Ther,2005,108（3）:257 ?268.DOI:10.1016/j.pharmthera.2005.04.006.

［3］Hogeling M,Adams S,Wargon O.A randomized controlled trial of propranolol for infantile hemangiomas［J］.Pediatrics,2011,128（2）:e259?e266.DOI:10.1542/peds.2010?0029.

［4］聶晶,帕提古麗·買(mǎi)買(mǎi)提托合提,朱雅琳.異丙腎上腺素對(duì)嬰兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞影響的體外研究［J］.新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2015,38（7）:839?842.DOI:10.3969/j.issn.1009?5551.2015.07.010.

［5］Zhu Y,Tuerxun A,Hui Y,et al.Effects of propranolol and isoproterenol on infantile hemangioma endothelial cellsin vitro［J］.Exp Ther Med,2014,8（2）:647?651.

［6］Denoyelle F,Leboulanger N,Eajolras O,et al.Role of propranolol in the therapeutic strategy of infantile laryngotrachealhaemangioma［J］.Int J Pediatr Otorhinolaryngol,2009,73（8）:1168?1172.DOI:10.1016/j.ijporl.2009.04.025.

［7］Schuller HM.Neurotransmitter receptor?mediated signaling path?ways as modulators of carcinogenesis［J］.Prog Exp Tumor Res,2007,39:45?63.DOI:10.1159/0000100045.

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In vitroeffects of propranolol and isoproterenol on the expression of beta?2 adrenergic receptor on infantile hemangioma endothelial cells

Zhu Yalin,Ma Long,Paride Abliz
Department of Dermatology,First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,Urumqi 830054,China

Paride Abliz,Email:palidae@aliyun.com

ObjectiveTo explore the role of beta?2 adrenergic receptor in the pathogenesis of infantile hemangioma.MethodsIn vitrocultured infantile hemangioma endothelial cells were divided into propranolol and isoproterenol groups.The propranolol groups were further classified into 5 groups to be treated with propranolol solutions at concentrations of 10,15,20 μg/ml,EGM?2 medium（blank control group 1）,and EGM ?2 medium containing 0.16%DMSO （DMSO group） respectively,while the isoproterenol groups were classified into 4 groups to be treated with isoproterenol solutions at concentrations of 5,10,20 μg/ml and EGM?2 medium（blank control group 2）respectively.After 24?and 48?hour treatment,enzyme?linked immunosorbent assay（ELISA）was performed to measure the expression of beta?2 adrenergic receptor in cell culture supernatants in the above groups.ResultsAfter 24?hour treatment,15?μg/ml and 20?μg/ml propranolol groups showed significantly decreased expression of beta?2 adrenergic receptor compared with blank control group 1 and DMSO group（all P ＜ 0.05）.After 48?hour treatment,all the propranolol groups showed significantly decreased expression of beta?2 adrenergic receptor compared with the blank control group 1（allP＜ 0.05）.However,the expression of beta?2 adrenergic receptor was significantly higher in the 10?and 20?μg/ml isoproterenol groups than in the blank control group 2 after 24?hour treatment（allP＜ 0.05）,and higher in the 20?μg/ml isoproterenol group than in the blank control group 2 after 48?hour treatment（P＜ 0.05）.ConclusionPropranolol can down?regulate the expression of beta?2 adrenergic receptor on the surface of vascular endothelial cells,while isoproterenol can up?regulate its expression.

Hemangioma;Infant;Endothelial cells;Propranolol;Isoproterenol;Receptors,adre?nergic,beta?2

帕麗達(dá)·阿布利孜，Email：palidae@aliyun.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.09.014

2016?08?08）

（本文編輯：吳曉初）