時(shí)帥，竇建華，唐光波，趙爽，聶勇戰(zhàn)，鄭華川

（1. 錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)室，遼寧 錦州 121000； 2. 第四軍醫(yī)大學(xué)西京消化病醫(yī)院消化內(nèi)科，西安 710032）

結(jié)直腸癌中LAMP2a編碼蛋白的表達(dá)及臨床病理意義

時(shí)帥1，竇建華2，唐光波2，趙爽1，聶勇戰(zhàn)2，鄭華川1

（1. 錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)室，遼寧 錦州 121000； 2. 第四軍醫(yī)大學(xué)西京消化病醫(yī)院消化內(nèi)科，西安 710032）

目的闡明結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中溶酶體相關(guān)膜蛋白2a（LAMP2a）的表達(dá)及臨床病理意義。方法利用免疫組化檢測組織芯片上結(jié)直腸癌、正常黏膜和腺瘤中LAMP2a的表達(dá)水平，探討結(jié)腸直腸癌臨床病理特征與生存時(shí)間的關(guān)系。結(jié)果結(jié)直腸癌和腺瘤中LAMP2a表達(dá)高于正常黏膜（P ＜ 0.05），LAMP2a表達(dá)與結(jié)直腸癌TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)（P ＜ 0.05），與淋巴管浸潤、肝轉(zhuǎn)移、浸潤深度和分化程度不相關(guān)（P ＞ 0.05）。Kaplan-Meier分析顯示LAMP2a表達(dá)與結(jié)直腸癌預(yù)后良好不相關(guān)（P ＞0.05）。單因素生存分析顯示，淋巴管浸潤、血管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、肝轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和分化等與結(jié)直腸癌患者預(yù)后差相關(guān)（P ＜ 0.05）。Cox比例危險(xiǎn)回歸模型分析表明，浸潤深度和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是影響結(jié)直腸癌患者生存時(shí)間的重要因素（P ＜ 0.05）。結(jié)論LAMP2a表達(dá)參與結(jié)直腸癌發(fā)生和演進(jìn)過程，可能作為結(jié)直腸癌惡性生物學(xué)行為的分子標(biāo)志物。

結(jié)直腸癌； 溶酶體相關(guān)膜蛋白2a； 腫瘤發(fā)生； 演進(jìn)； 預(yù)后

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：

結(jié)直腸癌是最常見的胃腸道腫瘤之一，約1/5患者確診時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移，這些患者即使接受手術(shù)切除也有復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)［1］，因此，尋找反映結(jié)直腸癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移的早期診斷及預(yù)后評價(jià)的分子標(biāo)志物至關(guān)重要。溶酶體相關(guān)膜蛋白2a （lysosome associated membrane protein-2a，LAMP2a）編碼溶酶體相關(guān)糖蛋白，是一種自噬底物的伴侶蛋白受體。LAMP2a作為伴侶蛋白的自噬受體，在肺和肝中高表達(dá)［2-3］。LAMP2a下調(diào)會(huì)導(dǎo)致伴侶蛋白介導(dǎo)的自噬（chapertone mediated autophagy，CMA）停止。多種腫瘤中LAMP2a表達(dá)升高，表明LAMP2a可能有促進(jìn)腫瘤生長的作用［4］。本研究通過制備多克隆LAMP2a抗體，利用大樣本結(jié)直腸癌組織芯片標(biāo)本分析結(jié)直腸癌發(fā)生和演進(jìn)過程中LAMP2a表達(dá)情況，比較其表達(dá)與臨床病理、預(yù)后的關(guān)系，為結(jié)直腸癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移的早期診斷提供分子標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集日本神奈川縣立癌中心附屬醫(yī)院結(jié)直腸癌（n = 407）及鄰近正常黏膜（n = 407，距癌≥4 cm）石蠟標(biāo)本，部分芯片組織缺失。其中，男213例，女161例，年齡24～87歲，平均年齡62.1歲。本研究通過神奈川縣立癌中心和錦州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)審查，電話詢問和病例查詢獲取結(jié)直腸癌患者的生存信息。全部病例在活檢前均未化療、放療及生物治療。所有標(biāo)本病理醫(yī)生都根據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)對結(jié)直腸癌進(jìn)行組織學(xué)診斷，其中高分化153例，中分化168例，低分化28例。根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟對結(jié)直腸癌進(jìn)行TNM分期，其中Ⅰ～Ⅱ期183例，Ⅲ～Ⅳ期163例。部分侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織分型和TNM臨床分期等信息缺失。

1.2 組織芯片制備

對HE切片進(jìn)行鏡下形態(tài)學(xué)觀察，選取含有典型結(jié)直腸癌和癌旁組織形態(tài)特點(diǎn)的部位，然后確定取樣部位。使用組織芯片打孔儀（KIN-1，日本AZUMAYA公司）在每個(gè)蠟塊穿取組織，將其包埋在一起形成組織芯片。

1.3 免疫組化

將組織芯片蠟塊以4 μ m連續(xù)切片，切片用二甲苯脫蠟4次，梯度乙醇脫苯4次（95%、80%、70%，無水乙醇），切片過蒸餾水將其放置于抗原修復(fù)液中微波爐加熱修復(fù)15 min，之后用3%雙氧水消除內(nèi)源性過氧化物酶，用5%牛血清白蛋白封閉（BSA）。第四軍醫(yī)大學(xué)制備的Anti-LAMP2a抗體（1∶80）和購自萬類生物公司的HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶120）分別孵育15 min，所有反應(yīng)都在間歇照射微波爐中進(jìn)行，每次孵育后TBST漂洗，最后二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，Mayer’s蘇木素復(fù)染，脫水透明封片。去除一抗作為陰性對照。

1.4 判斷標(biāo)準(zhǔn)

LAMP2a蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中。由2名觀察員對染色進(jìn)行陽性判斷，最終雙方達(dá)成一致。陽性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0，陰性；1，1%～＜50%；2，50%～＜75%；3，≥75%。染色強(qiáng)度評分：1，弱；2，中；3，強(qiáng)。LAMP2a陽性表達(dá)和染色強(qiáng)度相乘為最終得分：-，0分；+，1～＜3分；++，3～＜6分；+++，6～＜10分。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，相關(guān)性檢驗(yàn)采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，生存分析采用Kaplan-Meier法，危險(xiǎn)因素分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸，P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌中LAMP2a蛋白的表達(dá)

免疫組化結(jié)果表明，LAMP2a定位于細(xì)胞質(zhì)中，在結(jié)直腸癌組織中呈高表達(dá)（圖1）。結(jié)直腸癌中LAMP2a表達(dá)強(qiáng)度高于正常黏膜和腺瘤，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05），結(jié)直腸癌和腺瘤中LAMP2a表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05）。見表1。

圖1 結(jié)直腸發(fā)生過程中LAMP2a蛋白表達(dá) ×200Fig.1 Expression of LAMP2a protein in colorectal carcinogenesis ×200

2.2 LAMP2a蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌病理特征和預(yù)后的關(guān)系

如表2所示，LAMP2a蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期呈負(fù)相關(guān)（P ＜ 0.05），而與患者腫瘤浸潤深度、血管侵襲、淋巴管浸潤和分化程度無相關(guān)性（P ＞ 0.05）。LAMP2a在年齡≥60歲人群中高表達(dá)（P ＜ 0.05）。隨訪374例結(jié)直腸癌患者，中位生存時(shí)間68.3個(gè)月，根據(jù)蛋白表達(dá)繪制出結(jié)直腸癌

患者的生存曲線（圖2），Kaplan-Meier分析顯示LAMP2a陽性表達(dá)與患者生存率無相關(guān)（P ＞ 0.05）。單因素和COX分析時(shí)，由于部分侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織分型和TNM臨床分期等信息缺失，僅對291例進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果顯示，淋巴管浸潤、血管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、肝轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和分化與結(jié)直腸癌患者預(yù)后相關(guān)（P ＜ 0.05，表3）；COX分析表明浸潤深度和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是影響結(jié)直腸癌患者生存時(shí)間的危險(xiǎn)因素（P ＜ 0.05），但年齡、性別、血管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移不是獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P ＞ 0.05，表4）。

表1 結(jié)直腸癌發(fā)生過程中LAMP2a蛋白表達(dá)Tab.1 LAMP2a expression in colorectal carcinogenesis

表2 LAMP2a表達(dá)水平與結(jié)直腸癌臨床病理特征之間的關(guān)系Tab.2 Relationship between LAMP2a expression and the clinicopathological characteristics of colorectal cancer

圖2 LAMP2a蛋白表達(dá)和結(jié)直腸癌患者預(yù)后關(guān)系Fig.2 Correlation between LAMP2a expression status and prognosis of patients with colorectal cancer

LAMP2a在維持溶酶體的完整性、pH和分解代謝中起著保護(hù)性作用，使溶酶體膜免于自身消化和細(xì)胞免于甲基化。SJDIN等［5］發(fā)現(xiàn)阿爾茲海默癥患者腦脊液中LAMP2a水平降低可以導(dǎo)致體內(nèi)溶酶體功能障礙。從功能上來說，LAMP2a是一種溶酶體的感受器，并且參與細(xì)胞黏附。LAMP2a會(huì)產(chǎn)生雜合性突變，缺失50%會(huì)導(dǎo)致女性患者出現(xiàn)溶酶體儲(chǔ)積癥（Danon?。?。研究中檢測了多種腫瘤中LAMP2a的表達(dá)情況，在肺癌、乳腺癌、胃癌中表達(dá)明顯上調(diào)。研究［6］發(fā)現(xiàn)，miR-487b-5p 通過 LAMP2a介導(dǎo)的自噬作用，可以降低肺癌細(xì)胞對于替莫唑胺的耐藥性。同時(shí)LAMP2a在腫瘤細(xì)胞膜表達(dá)增高（特別是在高轉(zhuǎn)移性的黑色素細(xì)胞瘤中），但在正常細(xì)胞膜表面很少檢測到［7］。研究［8］發(fā)現(xiàn)，LAMP2a在唾液腺囊性癌

3 討論

中表達(dá)明顯高于多形性腺瘤和正常唾液腺。本研究免疫組化和統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，結(jié)直腸癌和腺瘤中LAMP2a表達(dá)升高，提示其作為早期事件參與結(jié)直腸癌發(fā)生過程。

LAMP1、LAMP2與選擇性蛋白和半乳凝素相互作用可介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對細(xì)胞外基質(zhì)的黏附作用。已經(jīng)證明LAMP2的下調(diào)可以誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞對紫杉醇的化學(xué)敏感性［9］，并且可以抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中的細(xì)胞增殖［10］。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的周圍壞死區(qū)域中檢測到LAMP2的表達(dá)上調(diào)，表明在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中微環(huán)境變化可驅(qū)動(dòng)細(xì)胞的自我吞噬［11］。DAMAGHI等［12］證實(shí)腫瘤微環(huán)境中的慢性酸中毒可將溶酶體蛋白移位到細(xì)胞表面，LAMP2在質(zhì)膜中的過表達(dá)可以保護(hù)漿細(xì)胞不受酸性物質(zhì)的水解。細(xì)胞表面表達(dá)LAMP2和CD63可作為惡性腫瘤血栓形成前體內(nèi)血小板激活的標(biāo)志物。以上這些結(jié)果表明，LAMP2過表達(dá)有助于細(xì)胞黏附和轉(zhuǎn)移。有研究［13］發(fā)現(xiàn)，LAMP2a表達(dá)沉默后胃癌細(xì)胞生存能力下降，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞周期演進(jìn)蛋白E2F3、PCNA和CDKN1B表達(dá)下調(diào)，提示LAMP2a具有促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期演進(jìn)的作用。然后，本研究發(fā)現(xiàn)LAMP2a表達(dá)與結(jié)直腸癌TNM分期呈負(fù)相關(guān)，與其生物學(xué)功能相反。因此為了明確這個(gè)現(xiàn)象，增加結(jié)直腸癌標(biāo)本數(shù)來研究LAMP2a的臨床病理意義十分必要，此外也需要改變結(jié)直腸癌細(xì)胞中LAMP2a的表達(dá)水平，從而進(jìn)一步研究其對結(jié)直腸癌惡性生物學(xué)表型的影響。

此外，ZHOU等［4］報(bào)道LAMP2a與女性食管癌和胃癌患者不良預(yù)后呈正相關(guān)關(guān)系，多變量分析表明其可以作為預(yù)測食道癌和胃癌預(yù)后的獨(dú)立預(yù)后因素，而與TNM分期、組織分級(jí)等無關(guān)。本研究結(jié)果表明，LAMP2a表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的生存時(shí)間沒有相關(guān)性，這可能歸因于其與結(jié)直腸癌患者多數(shù)惡性病理生物學(xué)行為無關(guān)。單因素生存分析顯示淋巴管浸潤、血管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、肝轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和分化與結(jié)直腸癌患者不良預(yù)后呈正相關(guān)，多因素風(fēng)險(xiǎn)回歸分析提示浸潤深度和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是影響其生存時(shí)間的危險(xiǎn)因素。

綜上所述，LAMP2a在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中起一定作用，可能會(huì)成為結(jié)直腸癌患者早期診斷的生物標(biāo)志物。

表3 結(jié)直腸癌預(yù)后危險(xiǎn)因素的單因素分析Tab.3 Univariate analysis of prognostic risk factors in patients with colorectal cancer

表4 結(jié)直腸癌患者生存的臨床病理多因素分析Tab.4 Multivariate analysis of clinicopathological variables for the survival of patients with colorectal cancer

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（編輯 武玉欣）

Expression and Clinicopathological Significance of LAMP2a in Colorectal Cancer

SHI Shuai1，DOU Jianhua2，TANG Guangbo2，ZHAO Shuang1，NIE Yongzhan2，ZHENG Huachuan1

（1. Tumor Basic and Translational Laboratory，The First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University，Jinzhou 121000，China；2. Department of Digestive Medicine，Xijing Hospital of Digestive Diseases，The Fourth Military Medical University，Xi’an 710032，China）

ObjectiveTo investigate the clinicopathological and prognostic significance of lysosome-associated membrane protein-2a（LAMP2a） expression in the development of colorectal cancer.MethodsImmunohistochemistry was performed to detect the LAMP2a expression in colorectal cancer，normal mucosa，and adenoma tissues.ResultsLAMP2a expression in colorectal cancer and adenoma was higher than that in normal mucosa （P ＜ 0.05）. Further，LAMP2a expression in colorectal cancer was negatively correlated with TNM staging and lymph node metastasis （P ＜ 0.05）；however，the invasion and liver metastasis，depth of invasion and differentiation had no correlation with the lymph node （P ＞ 0.05）. Kaplan-Meier analysis showed that LAMP2a expression in colorectal cancer is not significantly correlated with good prognosis （P ＞ 0.05）. Univariate survival analysis showed that lymphatic invasion，vascular invasion，lymph node metastasis，TNM stage，liver metastasis，distant metastasis，and differentiation were correlated with poor prognosis of colorectal cancer （P ＜ 0.05）.The Cox proportional hazards regression model showed that the depth of invasion and distant metastasis were important factors affecting the survival period of patients with colorectal cancer （P ＜ 0.05）.ConclusionLAMP2a may play a role in the carcinogenesis and progression of colorectal cancer，and may be used as a molecular marker for the biological behavior of colorectal cancer.

colorectal cancer； lysosome associated membrane protein-2a； carcinogenesis； progression； prognosis

R735.3

A

0258-4646（2017）11-0970-06

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.11.003

國家自然科學(xué)基金（81472544；81672700）；遼寧省科技攻關(guān)項(xiàng)目（2015408001）；遼寧省百千萬人才項(xiàng)目（2015408001）

時(shí)帥（1990-），男，碩士研究生.

鄭華川，E-mail：zheng_huachuan@hotmail.com

2017-03-29