趙曉宇，程蓉蓉，歐陽(yáng)玲

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽(yáng) 110004）

長(zhǎng)鏈非編碼RNA HOTAIR對(duì)外陰鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

趙曉宇，程蓉蓉，歐陽(yáng)玲

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽(yáng) 110004）

目的探討長(zhǎng)鏈非編碼RNA （lncRNA） HOTAIR對(duì)外陰鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。方法采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)外陰鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞與正常表皮HaCaT細(xì)胞中HOTAIR的表達(dá)水平，轉(zhuǎn)染HOTAIR siRNA至A431細(xì)胞后采用CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞活性，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移情況，Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲情況。結(jié)果HOTAIR在A431細(xì)胞中的表達(dá)高于正常表皮HaCaT細(xì)胞；下調(diào)A431細(xì)胞中HOTAIR表達(dá)后，細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力均降低（P均＜0.05），而凋亡率增加（P ＜ 0.05）。結(jié)論lncRNA HOTAIR可能在調(diào)控外陰鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移及侵襲行為中起重要作用。

外陰鱗狀細(xì)胞癌； HOTAIR； siRNA； 生物學(xué)行為

外陰鱗狀細(xì)胞癌（簡(jiǎn)稱外陰鱗癌）是外陰癌最常見(jiàn)的病理類型，約占90%，晚期患者5年生存率不超過(guò)20%［1］。目前其治療強(qiáng)調(diào)個(gè)體化，更重視手術(shù)聯(lián)合放化療、靶向治療等綜合治療以改善患者生活質(zhì)量［2-3］。因此，探索治療外陰鱗癌的靶點(diǎn)有重要意義。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA （long non-coding RNAs，lncRNA） HOX基因轉(zhuǎn)錄反義基因間RNA （HOX transcript antisense intergenic RNA， HOTAIR）在多種疾病（腫瘤、心血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等）中存在差異表達(dá)，尤其是與腫瘤性疾病相關(guān)。本課題組前期研究［4］提示lncRNA HOTAIR在外陰鱗癌組織中表達(dá)失調(diào)，但HOTAIR是否對(duì)外陰鱗癌細(xì)胞的生物學(xué)行為起作用尚不清楚。本研究旨在探討lncRNA HOTAIR對(duì)外陰鱗癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，為外陰鱗癌的治療提供新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系來(lái)源：外陰鱗癌A431細(xì)胞購(gòu)自上海富衡生物有限公司；正常表皮HaCaT細(xì)胞購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要儀器及試劑：DMEM/高糖培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，胎牛血清購(gòu)自以色列Bioind公司，HOTAIR siRNA序列及陰性對(duì)照（negative control，NC）siRNA序列購(gòu)自蘇州吉瑪生物有限公司，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，總RNA提取試劑RNAiso plus、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Primescript RT reagent kit）及實(shí)時(shí)PCR試劑盒（SYBR Premix Ex Taq）均購(gòu)自日本TaKaRa公司，PCR引物購(gòu)自上海生工生物工程有限公司，CCK-8試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所，Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)ADL公司，Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Costar公司，Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：外陰鱗癌A431細(xì)胞及正常表皮HaCaT細(xì)胞用適量含10%胎牛血清、1%青—鏈霉素的DMEM/高糖培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 檢測(cè)2種細(xì)胞中HOTAIR的表達(dá)：按照說(shuō)明書(shū)TRIzol法提取2種細(xì)胞的總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)1 μ g總RNA在10 μ L體系中用gDNA Eraser去除基因組DNA，在20 μ L反應(yīng)體系中反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)實(shí)時(shí)PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)取適量cDNA產(chǎn)物在20 μ L反應(yīng)體系中用Roche480機(jī)器進(jìn)行擴(kuò)增并獲得HOTAIR的Ct值，以GAPDH的Ct值作內(nèi)參，應(yīng)用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A431細(xì)胞以4×105/孔接種于6孔板，待70%～80%融合時(shí)更換無(wú)血清培養(yǎng)基，按轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行HOTAIR siRNA序列轉(zhuǎn)染，分為空白對(duì)照組（A431組）、轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組（A431-NC組）及轉(zhuǎn)染HOTAIR siRNA實(shí)驗(yàn)組（A431-siHOTAIR組），轉(zhuǎn)染6 h后更換成完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48 h時(shí)提取各組細(xì)胞的RNA檢測(cè)HOTAIR的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A431細(xì)胞以1×104/孔接種于96孔板，按前述方法轉(zhuǎn)染各組細(xì)胞后，按CCK-8試劑盒說(shuō)明書(shū)分別在轉(zhuǎn)染0、24、48和72 h檢測(cè)各組細(xì)胞活性。以時(shí)間為橫軸，吸光度值（A值）為縱軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況：收集轉(zhuǎn)染48 h后的A431細(xì)胞，按Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀測(cè)定、CellQuest Pro軟件分析細(xì)胞凋亡，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.2.6 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力：取轉(zhuǎn)染24 h后的3組A431細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整密度為 5×105/mL。將3個(gè)Transwell小室放入24孔板中，每個(gè)小室加入對(duì)應(yīng)細(xì)胞懸液100 μ L（即5×104/孔），小室下室加入600 μ L 20%胎牛血清的DMEM/高糖培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱內(nèi)24 h后取出，棄去上室內(nèi)液體，PBS浸洗2次，預(yù)冷的甲醇固定30 min，倒置晾干后0.1%結(jié)晶紫染色30 min，PBS洗滌3次，拭去上室內(nèi)未遷移細(xì)胞、風(fēng)干。倒置顯微鏡下隨機(jī)取6個(gè)視野（×400）照相，計(jì)數(shù)每個(gè)視野的穿膜細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.2.7 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力：-20℃保存的Matrigel膠在4 ℃冰箱過(guò)夜融化。在冰上用預(yù)冷的槍頭將Matrigel膠與培養(yǎng)基按1∶5稀釋后，取60 μ L包被Transwell小室基底膜，37 ℃放置1.5 h待Matrigel膠凝固。細(xì)胞處理同遷移實(shí)驗(yàn)，24 h后固定、染色，拭去上室內(nèi)的Matrigel膠及未侵襲的細(xì)胞、風(fēng)干。倒置顯微鏡下隨機(jī)取6個(gè)視野（×400）照相，計(jì)數(shù)每個(gè)視野的穿膜細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以x-±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 A431細(xì)胞和HaCaT細(xì)胞中HOTAIR 的表達(dá)情況

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)2種細(xì)胞中HOTAIR的表達(dá)，結(jié)果顯示，HOTAIR在A431細(xì)胞中的表達(dá)水平為HaCaT細(xì)胞的（3.69±0.29）倍，顯著高于HaCaT細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.004）。選擇沉默A431細(xì)胞的HOTAIR表達(dá)進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 HOTAIR siRNA在A431細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)HOTAIR siRNA在A431細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果顯示，相對(duì)于A431組，A431-NC組和A431-siHOTAIR組的HOTAIR表達(dá)水平分別為0.99±0.03（P =0.648）和0.34±0.02（P ＜0.001）；A431-siHOTAIR組和A431-NC組間比較亦存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＜ 0.001）。提示特異性HOTAIR siRNA在A431細(xì)胞中下調(diào)HOTAIR表達(dá)效果顯著。

2.3 下調(diào)HOTAIR表達(dá)對(duì)A431細(xì)胞增殖的影響

轉(zhuǎn)染24 h時(shí)A431-siHOTAIR組與A431組和A431-NC組相比細(xì)胞活性變化不明顯，48 h開(kāi)始A431-si-HOTAIR組細(xì)胞活性明顯低于A431組和A431-NC組（P均＜0.05）；而A431組和A431-NC組比較，24、48和72 h的細(xì)胞活性均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＞0.05），見(jiàn)圖1。說(shuō)明HOTAIR下調(diào)抑制A431細(xì)胞增殖。

2.4 下調(diào)HOTAIR表達(dá)對(duì)A431細(xì)胞凋亡的影響

A431-siHOTAIR組、A431組及A431-NC組細(xì)胞早期凋亡率分別為（5.51±1.28）%、（3.05±0.27）%和（3.77±0.90）%，A431-siHOTAIR組與A431組及A431-NC組比較凋亡率增加（P = 0.020，P = 0.012），見(jiàn)圖2。提示HOTAIR下調(diào)促進(jìn)A431細(xì)胞凋亡。

2.5 下調(diào)HOTAIR表達(dá)對(duì)A431細(xì)胞遷移及侵襲的影響

圖1 CCK-8檢測(cè)HOTAIR siRNA轉(zhuǎn)染后A431細(xì)胞的增殖Fig.1 Effect of HOTAIR siRNA on A431 cell proliferation detected by CCK-8 assay

用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞的遷移、侵襲能力，結(jié)果顯示，與A431-NC組及A431組相比，A431-siHOTAIR組細(xì)胞遷移力和侵襲力明顯降低（P均＜0.05），而A431組與A431-NC組相比，細(xì)胞遷移力和侵襲力無(wú)明顯變化（P均＞0.05），見(jiàn)圖3、4。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HOTAIR siRNA對(duì)A431細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effect of HOTAIR siRNA on A431 cell apoptosis detected by flow cytometry

圖3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HOTAIR siRNA對(duì)A431細(xì)胞遷移能力的影響 ×400Fig.3 Transwell assay showing the effect of HOTAIR siRNA on A431 cell migration ability ×400

3 討論

圖4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HOTAIR siRNA對(duì)A431細(xì)胞侵襲能力的影響 ×400Fig.4 Transwell assay showing the effect of HOTAIR siRNA on A431 cell invasion ability ×400

外陰鱗癌較罕見(jiàn)，但惡性程度高，晚期患者5年生存率不超過(guò)20%［1］。在治療上以手術(shù)切除為主，傳統(tǒng)的根治性手術(shù)需切除廣泛外陰及腹股溝淋巴結(jié)，損傷范圍大，圍術(shù)期與術(shù)后近、遠(yuǎn)期并發(fā)癥均多。據(jù)報(bào)道，行根治術(shù)后有89%的患者發(fā)生不同程度的性功能障礙［5］，腹股溝淋巴結(jié)切除術(shù)后非性功能相關(guān)的近、遠(yuǎn)期并發(fā)癥發(fā)生率高達(dá)84%［6］。雖然婦產(chǎn)科醫(yī)生和學(xué)者們根據(jù)外陰癌病變特點(diǎn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移規(guī)律，在改進(jìn)手術(shù)方式方面做出了巨大努力，探索出多種改良型新手術(shù)方式，術(shù)后并發(fā)癥有所下降，但仍居高不下。因此，近年來(lái)外陰癌的治療傾向于縮小手術(shù)范圍，早期患者以局部手術(shù)為主，中晚期重視手術(shù)聯(lián)合放療、手術(shù)聯(lián)合化療、靶向治療等綜合治療及個(gè)體化治療的應(yīng)用，以提高患者治療后生活質(zhì)量［2-3］。也有學(xué)者開(kāi)始注重術(shù)前治療特別是術(shù)前同步放化療的研究。MICHELETTI等［7］提出，當(dāng)前浸潤(rùn)性外陰癌標(biāo)準(zhǔn)的根治性、致殘性手術(shù)正逐漸被保守和個(gè)體化治療所取代。

隨著基因組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，已發(fā)現(xiàn)外陰鱗癌內(nèi)上千種lncRNA、miRNA、mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)水平存在差異。lncRNA是一組轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的ncRNA，在表觀遺傳水平、轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后水平多個(gè)層面調(diào)控基因表達(dá)，參與細(xì)胞分化和個(gè)體發(fā)育等［8］。大量研究表明lncRNA在神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病和腫瘤等危害人類健康的重大疾病中扮演重要角色，尤與腫瘤性疾病相關(guān)，成為學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)；其中l(wèi)ncRNA HOTAIR是目前認(rèn)識(shí)較為深入的一種，研究［9］顯示其幾乎在機(jī)體各系統(tǒng)的腫瘤中都存在表達(dá)上調(diào)，并與腫瘤發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移、預(yù)后等密切相關(guān)，在調(diào)控腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為中發(fā)揮重要的促癌作用。本研究結(jié)果顯示，外陰鱗癌A431細(xì)胞中HOTAIR的表達(dá)水平顯著高于正常表皮HaCaT細(xì)胞，轉(zhuǎn)染HOTAIR siRNA后的A431細(xì)胞中HOTAIR表達(dá)顯著下調(diào)，明顯低于空白對(duì)照組及轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組，提示特異性HOTAIR siRNA能有效下調(diào)A431細(xì)胞HOTAIR的表達(dá)。

腫瘤的發(fā)生是細(xì)胞增殖與凋亡失衡的結(jié)果，癌基因常常通過(guò)直接或間接誘發(fā)細(xì)胞惡性增殖和（或）抵抗凋亡起促癌作用。QIU等［10］證實(shí)下調(diào)腫瘤細(xì)胞HOTAIR表達(dá)，CDK、Cyclin等多種細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)水平發(fā)生變化，同時(shí)促細(xì)胞凋亡基因caspase-3、casepase-9等表達(dá)水平升高，抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)水平下降。本研究采取CCK-8法檢測(cè)下調(diào)A431細(xì)胞HOTAIR表達(dá)水平后A431細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果顯示HOTAIR-siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞在48～72 h生長(zhǎng)速度低于空白對(duì)照組及轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示HOTAIR siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的凋亡率較對(duì)照組有所增加，提示HOTAIR表達(dá)下調(diào)能一定程度上抑制A431細(xì)胞增殖、促進(jìn)A431細(xì)胞凋亡。

侵襲與轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最本質(zhì)的特征，也往往預(yù)示腫瘤患者預(yù)后不良，嚴(yán)重危害人類生命健康。GUPTA等［11］發(fā)現(xiàn)HOTAIR表達(dá)水平在正常乳腺組織、乳腺癌原位癌和轉(zhuǎn)移性乳腺癌手術(shù)標(biāo)本中表達(dá)差異顯著。過(guò)表達(dá)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中HOTAIR表達(dá)可以增加裸鼠腫瘤肺轉(zhuǎn)移的機(jī)會(huì)，而HOTAIR在原位乳腺癌中的表達(dá)水平只有發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的組織中的十分之一。下調(diào)MDA-MB-231細(xì)胞中的HOTAIR表達(dá)明顯抑制腫瘤肺轉(zhuǎn)移的可能［11］。LIU等［12］報(bào)道下調(diào)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的HOTAIR表達(dá)后細(xì)胞MMP-2、MMP-9的表達(dá)受抑制，最終抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。HOTAIR還參與腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，沉默HOTAIR表達(dá)腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化受到抑制［12-13］。本研究中Transwell遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HOTAIR siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞穿過(guò)Transwell小室基底膜的細(xì)胞數(shù)明顯減少，表明HOTAIR可能促進(jìn)A431細(xì)胞的遷移、侵襲能力，沉默HOTIAR明顯降低A431細(xì)胞這方面能力。

綜上所述，lncRNA HOTAIR基因下調(diào)能夠抑制外陰鱗癌細(xì)胞A431的增殖、遷移和侵襲能力并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提示HOTAIR可能對(duì)外陰鱗癌發(fā)展起促進(jìn)作用，且在其浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中作用可能更為明顯。但HOTAIR影響外陰鱗癌細(xì)胞的生物學(xué)行為及其機(jī)制，還需要聯(lián)合其他細(xì)胞系進(jìn)行驗(yàn)證并深入研究。希望目前的研究為進(jìn)一步探究HOTAIR在外陰鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用提供參考，并為外陰鱗癌的靶向治療提供初步理論基礎(chǔ)。

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（編輯 陳 姜）

Effects of Long Non-coding RNA HOTAIR on the Biological Behaviors of Vulvar Squamous Cell Carcinoma A431 Cells

ZHAO Xiaoyu，CHENG Rongrong，OUYANG Ling
（Department of Obstetrics and Gynecology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo investigate the effects of long non-coding RNA （lncRNA） HOTAIR on the biological behavior of the vulvar squamous cell carcinoma A431 cells.MethodsThe expression level of HOTAIR in vulvar squamous cell carcinoma A431 cells and normal epidermis HaCaT cells were detected by real-time PCR. A431 cells were transfected with HOTAIR siRNA，then the proliferation，apoptosis，migration activities，and invasion activities were measured by CCK-8 assay，flow cytometry assay，transwell chamber migration test，and transwell chamber invasion test，respectively.ResultsAfter down-regulating the level of HOTAIR in A431 cells，the cell proliferation，migration，and invasion abilities were decreased （P ＜ 0.05），while the cell apoptosis rate was increased （P ＜ 0.05）.ConclusionlncRNA HOTAIR may play an important role in the proliferation，apoptosis，migration，and invasion in vulvar squamous cell carcinoma.

vulvar squamous cell carcinoma； HOTAIR； siRNA； biological behavior

R737.35

A

0258-4646（2017）11-0990-05

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.11.007

遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項(xiàng)目（L2015585）；沈陽(yáng)市科學(xué)技術(shù)計(jì)劃（P15-199-1-34）

趙曉宇（1987-），女，碩士研究生.

歐陽(yáng)玲，E-mail：ouyang1964@163.com

2017-04-05

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