張少校，吳瑛

（1. 遼寧省盤錦市中心醫(yī)院VIP病房，遼寧 盤錦 124010； 2. 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科，沈陽(yáng) 110001）

骨形成蛋白2在腦多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)及臨床意義

張少校1，吳瑛2

（1. 遼寧省盤錦市中心醫(yī)院VIP病房，遼寧 盤錦 124010； 2. 中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科，沈陽(yáng) 110001）

目的分析人多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）中骨形成蛋白2 （BMP2）表達(dá)的預(yù)后意義和可能的相關(guān)信號(hào)機(jī)制。方法利用癌癥基因組圖譜（TCGA） 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取GBM標(biāo)本的RNASeqV2數(shù)據(jù)，從人類腫瘤相關(guān)基因表達(dá)匯編（GEO） 數(shù)據(jù)庫(kù)下載GBM樣本數(shù)據(jù)集GSE7696的表達(dá)譜數(shù)據(jù)。利用單因素Kaplan-Meier和多因素COX逐步回歸法確定BMP2表達(dá)與GBM患者預(yù)后的關(guān)系。利用基因集富集分析方法預(yù)測(cè)BMP2相關(guān)的基因通路。結(jié)果低表達(dá)BMP2是GBM術(shù)后患者預(yù)后不良的獨(dú)立因素。BMP2 低表達(dá)富集了干擾素α反應(yīng)的相關(guān)通路。結(jié)論GBM組織中BMP2低表達(dá)預(yù)示患者預(yù)后不良，其作用機(jī)制可能是干擾素α反應(yīng)基因異常。

骨形成蛋白2； 多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤； 癌癥基因組圖譜； 基因表達(dá)匯編

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：

多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）是惡性程度最高的顱內(nèi)惡性腫瘤，呈高度浸潤(rùn)性且血供豐富，還具有獨(dú)特的免疫體系和較強(qiáng)的逃避免疫監(jiān)視功能［1］，深入研究GBM發(fā)生發(fā)展的基因分子機(jī)制，對(duì)于改善GBM的診治以及患者的預(yù)后有重要的臨床意義。

骨形成蛋白家族（bone morphogenetic proteins，BMPs）屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族，BMPs在多種惡性腫瘤中表達(dá)并影響其發(fā)生、發(fā)展［2］。BMP2為活性較強(qiáng)的BMPs成員之一，與GBM關(guān)系密切，但作用機(jī)制不明［3］。本研究利用在線高通量數(shù)據(jù)，采用生物信息學(xué)分析方法探討B(tài)MP2在GBM組織中的表達(dá)及意義。

1 材料與方法

1.1 資料收集

本研究利用癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA） 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//tcga-data.nci.nih.gov/tcga/）下載并預(yù)處理GBM的RNASeqV2 數(shù)據(jù)（ level 3）。TCGA 數(shù)據(jù)集共納入有完整生存資料和mRNA表達(dá)譜的GBM患者152例（男98例、女54例，中位年齡60.5歲） 。利用美國(guó)國(guó)家生物信息技術(shù)中心（national center for biotechnology information，NCBI）的人類腫瘤相關(guān)基因表達(dá)匯編（gene expression omnibus，GEO） 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：：//www.ncb.nlm.nih.gov/geo）下載GBM樣本數(shù)據(jù)集GSE7696的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，僅保留原發(fā)GBM且臨床資料和生存信息完整的病例。GSE7696數(shù)據(jù)集共納入GBM術(shù)后患者70例 （男51例、女19 例，中位年齡52.2歲）。

1.2 TCGA數(shù)據(jù)集BMP2 表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

提取BMP2的表達(dá)數(shù)據(jù)。評(píng)估的終點(diǎn)指標(biāo)為患者的總生存。采用R的Maxstat函數(shù)包（常用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，可用于線性、非線性回歸、多因素、相關(guān)及時(shí)間序列分析［4］）確定區(qū)分BMP2表達(dá)水平分級(jí)的最佳界值［5］。根據(jù)該值，兩分BMP2的表達(dá)數(shù)據(jù)為“高表達(dá)”和“低表達(dá)”2組。R/survival函數(shù)包用于生存分析。Kaplan-Meier法用于繪制生存曲線，多因素COX逐步回歸法用于確定預(yù)后相關(guān)的獨(dú)立因素。P ＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 生存分析結(jié)果的外部驗(yàn)證

GSE7696數(shù)據(jù)集［6］以探針信號(hào)強(qiáng)度反映基因的相對(duì)表達(dá)量，若同一基因的多個(gè)探針信號(hào)強(qiáng)度不同，則取其中位數(shù)。由低到高對(duì)BMP2表達(dá)水平進(jìn)行排序，＜33%為低表達(dá)，33%～67%為中表達(dá)，＞67%為高表達(dá)。利用多因素COX逐步回歸法，以患者年齡、性別以及術(shù)后治療方案等指標(biāo)作為調(diào)整因素，研究BMP2表達(dá)是否是GBM術(shù)后患者的獨(dú)立預(yù)后因素。P ＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 BMP2基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）

GSEA將芯片表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行排序，然后與預(yù)先構(gòu)建好的功能基因集進(jìn)行比較，尋找這些基因在選定功能基因集中出現(xiàn)與否以及排序位置，分析是否具有共同的表達(dá)趨勢(shì)，以此來(lái)解讀數(shù)據(jù)中蘊(yùn)含的生物學(xué)信息［7］。本研究采用GSEA2.2.2 版軟件，根據(jù)TCGA 數(shù)據(jù)集BMP2 表達(dá)的中位值（ 原始讀長(zhǎng)為2.97） 將患者分為低表達(dá)和高表達(dá)2組，選用GSEA網(wǎng)站MsigDB 數(shù)據(jù)庫(kù)中的h.all.v5.2.symbols.gmt 數(shù)據(jù)集作為參照基因集，分析不同BMP2 表達(dá)對(duì)參照基因集各個(gè)通路的影響。進(jìn)行GSEA時(shí)，采用缺省加權(quán)富集統(tǒng)計(jì)以及1 000次的隨機(jī)組合次數(shù)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的富集基因集的確立標(biāo)準(zhǔn)是P ＜ 0.05以及錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR） ＜ 0.25 。

2 結(jié)果

2.1 利用TCGA數(shù)據(jù)集分析不同BMP2 表達(dá)與GBM患者生存的關(guān)系

根據(jù)R的Maxstat函數(shù)包確定BMP2表達(dá)水平分級(jí)的最佳界值為6.4（圖1），據(jù)此將GBM患者分為2個(gè)亞組，BMP2高表達(dá)組為21例，低表達(dá)組為131例。進(jìn)一步進(jìn)行生存分析，結(jié)果顯示，在TCGA 數(shù)據(jù)集中BMP2 低、高表達(dá)者的中位生存時(shí)間分別為34.0和42.5個(gè)月，二者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P = 0.018），見(jiàn)圖2 。

2.2 利用GSE7696 數(shù)據(jù)集進(jìn)行外部驗(yàn)證

在GSE7696數(shù)據(jù)集的70例患者中，BMP2低、中、高表達(dá)者分別為23、24和23例。以年齡、性別、術(shù)后輔助治療方案為調(diào)整因素，以BMP2表達(dá)水平為自變量，進(jìn)行多因素COX分析。結(jié)果顯示，BMP2是GBM術(shù)后患者的獨(dú)立預(yù)后因素，低表達(dá)BMP2提示患者預(yù)后不佳（HR = 1.441，P = 0.029），見(jiàn)表1。

圖1 利用R的maxstat函數(shù)包確定BMP2表達(dá)分級(jí)的最佳界值Fig.1 Cutoff for the significance of BMP2 expression calculated using the R maxstat package

2.3 BMP2 的功能基因集GSEA情況

根據(jù)本研究中富集基因集的確立標(biāo)準(zhǔn)，BMP2低表達(dá)樣本所富集的是干擾素α（interferon α，IFN-α）反應(yīng)上調(diào)的82個(gè)標(biāo)志性基因（P ＜ 0.01，F(xiàn)DR =0.000 4）。見(jiàn)圖3。

圖2 利用Kaplan-Meier法確定BMP2表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系Fig.2 Kaplan-Meier analysis showing the correlation between BMP2 expression and survival

3 討論

在目前發(fā)現(xiàn)的超過(guò)40種BMP中，BMP2為活性最高的多能細(xì)胞因子，可影響細(xì)胞的遷移、分化、增殖、凋亡以及基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，參與調(diào)控中胚層形成、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生等多種生理過(guò)程［8］，加速骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥等多種疾病的進(jìn)程［2-8］。BMP2 表達(dá)異常還影響肺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展或轉(zhuǎn)歸［9］，腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡與侵襲、轉(zhuǎn)移以及腫瘤血管新生相關(guān)途徑被確認(rèn)為主要相關(guān)作用機(jī)制［10］。與正常腦組織相比較，BMP2在膠質(zhì)瘤中表達(dá)量增高，且與惡性程度分級(jí)呈正相關(guān)［11］。進(jìn)一步研究［12］證實(shí)，BMP通過(guò)拮抗多種與維持GBM干細(xì)胞特征相關(guān)的因子而影響GBM的發(fā)生與發(fā)展。缺氧是促進(jìn)GBM的重要因素，而B(niǎo)MP2通過(guò)下調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子1α的穩(wěn)定性影響原代GBM細(xì)胞的穩(wěn)定性［13］，并增強(qiáng)GBM干細(xì)胞樣細(xì)胞對(duì)替莫唑胺的敏感性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［12］。但是，目前BMP2與GBM患者生存的關(guān)系及相關(guān)機(jī)制尚不明確。

表1 BMP2表達(dá)與患者生存關(guān)系的單因素和多因素分析Tab.1 Univariate and multivariate Cox regression analysis of the relationship between BMP2 expression and survival

圖3 GSEA確定BMP2 低表達(dá)富集到IFN-α反應(yīng)相關(guān)基因Fig.3 GSEA identified that IFN-αresponse-genes were enriched in samples with low BMP2 expression

本研究利用TCGA 和GEO 數(shù)據(jù)集，結(jié)合生物信息學(xué)分析，證實(shí)在GBM組織中，BMP2 高表達(dá)患者的生存期更長(zhǎng)，2個(gè)數(shù)據(jù)集的結(jié)果一致。因此，BMP2表達(dá)可作為評(píng)價(jià)GBM患者預(yù)后的指標(biāo)。

干擾素家族蛋白是由宿主細(xì)胞產(chǎn)生并釋放于機(jī)體內(nèi)，應(yīng)對(duì)多種病原，如病毒、細(xì)菌以及惡性腫瘤細(xì)胞等，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)的重要治療性細(xì)胞因子［14］，包括Ⅰ型和 Ⅱ型兩大類。作為Ⅰ型干擾素和重要的抗腫瘤性細(xì)胞因子，IFN-α已被廣泛用于慢性髓細(xì)胞白血病和多發(fā)性骨髓瘤等多種血液病以及淋巴瘤和胃腸道腫瘤等實(shí)體腫瘤的治療［15］。然而，IFN-α內(nèi)源性抵抗是導(dǎo)致多種惡性腫瘤免疫逃逸，影響患者預(yù)后和免疫治療療效的重要因素［15］。與多種惡性腫瘤相比，GBM對(duì)干擾素原發(fā)耐藥，但是機(jī)制不清。本研究GESA方法發(fā)現(xiàn)，BMP2低表達(dá)的樣本中富集了IFN-α作用后上調(diào)的基因，提示BMP2低表達(dá)可能與IFN-α的內(nèi)源性抵抗以及耐藥有關(guān)。BMP2基因可能對(duì)抗GBM細(xì)胞中IFN-α內(nèi)源性抵抗相關(guān)的標(biāo)志性基因的上調(diào)，降低腫瘤細(xì)胞的IFN-α抵抗和免疫逃逸過(guò)程。

GBM呈現(xiàn)高度浸潤(rùn)性，并有血腦屏障保護(hù)，進(jìn)行傳統(tǒng)的手術(shù)、放療或化療的療效差。免疫治療可作為GBM的第4種治療模式。然而，GBM的免疫逃逸生物學(xué)特性又是影響惡性腫瘤廣泛浸潤(rùn)、治療療效和患者預(yù)后的重要因素。因此，深入研究GBM的免疫逃逸機(jī)制，對(duì)增強(qiáng)免疫治療的療效、改善GBM患者的預(yù)后至關(guān)重要。下階段可以利用GBM臨床標(biāo)本，聯(lián)合檢測(cè)BMP2基因和IFN-α反應(yīng)性基因的表達(dá)，評(píng)估其預(yù)后價(jià)值并進(jìn)一步探討相關(guān)分子機(jī)制。

綜上所述，本研究利用TCGA及GEO數(shù)據(jù)庫(kù)推測(cè)出GBM組織BMP2低表達(dá)提示GBM患者預(yù)后不佳，IFN-α反應(yīng)相關(guān)基因的調(diào)節(jié)可能是BMP2在GBM中的作用機(jī)制。

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（編輯 于 溪）

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Analysis of the Clinical Significance of Bone Morphogenetic Protein 2 in Glioblastoma Multiforme

ZHANG Shaoxiao1，WU Ying2

（1. VIP Department，Liaoning Provincial Panjin City Centre Hospital，Panjin 124010，China； 2. General Practice Department，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo investigate the prognostic significance of bone morphogenetic protein 2 （BMP2） expression in glioblastoma multiforme （GBM） and related pathways.MethodsRNASeqV2 data and GSE7696 series matrix data were downloaded from The Cancer Genome Atlas （TCGA） and The Gene Expression Omnibus （GEO） database，respectively. The correlation between BMP2 expression and prognosis was evaluated using Kaplan-Meier and multivariate COX analysis. Gene set enrichment analysis （GSEA） was used to predict the functional gene sets and/or pathways modulated by BMP2.ResultsDecreased expression of BMP2 is an independent predictor of poor prognosis. Furthermore，genes that are upregulated in response to interferon-αproteins were enriched in samples with low BMP2 expression.ConclusionLow expression of BMP2 indicates poor prognosis in GBM patients. Genes that are upregulated in response to interferon-α proteins may also be implicated in prognosis.

bone morphogenetic protein 2； glioblastoma multiforme； the cancer genome atlas； gene expression omnibus

R739.4

A

0258-4646（2017）11-0976-04

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.11.004

國(guó)家自然科學(xué)基金（ 81302023，81201801）

張少校（1978-），男，副教授，碩士.

吳瑛，E-mail：1779716865@qq.com

2017-04-14