李 森， 牟俊潔， 劉武康

(上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093)

單增李斯特菌vip基因缺失菌株的構(gòu)建與篩選

李 森， 牟俊潔， 劉武康

(上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093)

單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)是廣泛存在于自然界及食物中的食源性致病菌，作為胞內(nèi)寄生菌，它可以引起強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫，是潛在的優(yōu)良疫苗載體。vip是單增李斯特菌的毒力基因，與其侵襲能力密切相關(guān)。因此構(gòu)建vip基因敲除株可為單增李斯特菌疫苗載體的研發(fā)打下重要基礎(chǔ)。從單增李斯特菌EGDe基因組中擴(kuò)增出vip基因上、下游序列，連接到穿梭載體pKSV7中得到敲除載體pKSV7-Δvip，將其以電穿孔的方式轉(zhuǎn)入單增李斯特菌后，通過同源重組利用氯霉素和溫度雙重壓力篩選得到vip基因的敲除突變株，并對(duì)敲除菌株的生長曲線進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)vip敲除對(duì)細(xì)菌的生長沒有顯著影響，為進(jìn)一步研究vip基因功能、單增李斯特的致病機(jī)制和疫苗載體的研發(fā)提供參考。

單增李斯特菌；vip基因敲除；突變株；同源重組

LI Sen, MU Jun-jie, LIU Wu-kang

(Schl.ofMed.Instrum. &FoodEngin.,ShanghaiUni.ofSci. &Techonol.,Shanghai200093)

單核細(xì)胞增多性李斯特菌簡稱單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes，LM),廣泛存在于自然界中，是一種人畜共患病的病原菌[1]，主要通過污染的食物引起人、畜的李斯特菌病，易感染者為新生兒、孕婦、40歲以上的成人和免疫功能缺陷者，死亡率高達(dá)30%以上[2]。單增李斯特菌對(duì)食品的污染與危害，已引起世界各國的普遍關(guān)注和高度重視，被世界衛(wèi)生組織列為四大食源性致病菌之一[3]。單增李斯特菌主要隨污染食物進(jìn)入腸道，侵襲腸道上皮細(xì)胞穿透腸道屏障后進(jìn)入血液循環(huán)引起其他器官的感染。研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)化素InlA和InlB是細(xì)菌進(jìn)入腸道細(xì)胞的關(guān)鍵因子[4]，ActA(actin-assembby inducing protein precursor)等對(duì)于單增李斯特菌在細(xì)胞與細(xì)胞間擴(kuò)散是必不可少的[5]。vip基因是單增李斯特菌的重要毒力基因，其表達(dá)的Vip蛋白可以被錨定在細(xì)菌的細(xì)胞壁上，介導(dǎo)單增李斯特菌對(duì)宿主細(xì)胞的侵襲[6]，但目前對(duì)于vip基因如何介導(dǎo)單增李斯特菌對(duì)宿主細(xì)胞侵襲的研究仍然十分有限。因此vip基因功能的研究有助于進(jìn)一步闡述單增李斯特菌的致病機(jī)理。單增李斯特菌是一種細(xì)胞內(nèi)寄生菌，進(jìn)入人體后主要寄生在巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞內(nèi)，可以引起有效的細(xì)胞免疫反應(yīng)[7]。并且單增李斯特菌獨(dú)特的生物學(xué)特點(diǎn)使其具備了作為疫苗載體的優(yōu)秀潛質(zhì)，如表面的肽聚糖、載脂蛋白等可以起到加強(qiáng)抗原提呈的作用[8-9]。如果將單增李斯特菌做減毒處理，將其作為載體轉(zhuǎn)入腫瘤抗原等制成腫瘤疫苗，就可以起到激發(fā)細(xì)胞免疫特異殺傷腫瘤細(xì)胞的作用[10]。如何獲得安全無害的減毒株是目前研究的重點(diǎn)之一。本研究擬通過同源重組的方法構(gòu)建單增李斯特菌vip基因敲除突變株，為進(jìn)一步研究vip基因的功能，闡述其在單增李斯特菌侵襲感染宿主細(xì)胞中的作用，及減毒疫苗載體的研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 單增李斯特菌EGDe(血清型為1/2a)；穿梭載體pKSV7；克隆載體pMD19-T(Takara 公司)。

1.1.2 主要試劑 rTaqDNA聚合酶、dNTP等(Takara公司)；基因組DNA提取試劑盒，DNA瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒，質(zhì)粒抽提試劑盒(天根生化科技有限公司)；限制性內(nèi)切酶SalI、HindIII、BamHI，T4 DNA連接酶(天根生物科技有限公司)；氨芐青霉素、氯霉素(上海勵(lì)瑞生物科技有限公司)；BHI培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)股份有限公司)。

1.1.3 引物及測(cè)序 引物根據(jù)NCBI序列(ID：987538)設(shè)計(jì)(表1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。本實(shí)驗(yàn)中的所有相關(guān)DNA測(cè)序工作均由華大基因完成。

1.1.4 主要儀器 PCR儀(Veriti，Applied Biosystem公司)；水平電泳儀(Bio-Rad公司)；全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)(G:Box，基因公司)；離心機(jī)(Eppendorf公司)；恒溫?fù)u床、恒溫培養(yǎng)箱(上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；電穿孔儀(Micropulser，Bio-Rad公司)等。

表1 實(shí)驗(yàn)中使用的PCR引物序列

1.2方法

1.2.1 PCR擴(kuò)增同源臂 將EGDe單克隆接種于BHI液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)16 h。取5 mL左右菌體離心后利用基因組抽提試劑盒抽提EGDe全基因組。取2 μL基因組DNA為模板，分別利用VIP-5F、VIP-5R和VIP-3F、VIP-3R引物擴(kuò)增vip基因上下游序列。利用SalI 將擴(kuò)增得到的兩個(gè)片段進(jìn)行單酶切并連接轉(zhuǎn)入克隆載體pMD-19T中得到pMD-19T-Δvip，送公司測(cè)序。

1.2.2 敲除載體pKSV7-Δvip的構(gòu)建 將測(cè)序正確的pMD-19T-Δvip進(jìn)行質(zhì)粒抽提，并以質(zhì)粒作為模板利用VIP-5F 和 VIP-3R擴(kuò)增Δvip片段，DNA凝膠回收試劑盒回收后，分別將Δvip片段和pKSV7穿梭載體進(jìn)行BamHI 和HindIII的雙酶切，用T4連接酶將二者連接得到pKSV7-Δvip敲除載體，涂氨芐青霉素抗性平板，對(duì)單克隆進(jìn)行PCR鑒定后將陽性克隆送公司測(cè)序。測(cè)序正確的克隆接種于液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒備用。

1.2.3 單增李斯特菌的電穿孔 將1 μg 左右的重組穿梭質(zhì)粒pKSV7-Δvip與200 μL單增李斯特菌感受態(tài)細(xì)胞混合均勻，轉(zhuǎn)移至電轉(zhuǎn)杯中冰浴10 min后用電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行電轉(zhuǎn)化(1 kV，5 ms)。電轉(zhuǎn)后立即加入1 mL新鮮的BHI培養(yǎng)基，用移液槍轉(zhuǎn)移到1.5 mL的EP管中，30 ℃搖床培養(yǎng)2 h后1 000 r/min離心5 min，涂含10 μg/mL氯霉素的BHI平板，置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至平板上長出單菌落。

1.2.4vip敲除菌株的篩選 挑取氯霉素平板上的克隆接種于BHI培養(yǎng)基中進(jìn)行震蕩培養(yǎng)，以菌液為模板，利用VIP-5F和VIP-3R做菌液PCR鑒定。得到陽性菌落后將其接種于含氯霉素(10 μg/mL)的BHI培養(yǎng)基中41 ℃振蕩培養(yǎng)，每12 h傳代1次。8～10代后將末次培養(yǎng)產(chǎn)物進(jìn)行平板劃線(含氯霉素10 μg/mL)。挑取平板上的克隆接種于無抗性BHI培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)，每12 h傳代1次。待6～8代抗性質(zhì)粒丟失后，將末次培養(yǎng)產(chǎn)物分別進(jìn)行氯霉素抗性板劃線和無抗性板劃線培養(yǎng)，得到在抗性板上不生長、在無抗性板上生長的克隆，即為vip敲除克隆。

1.2.5vip敲除菌株的鑒定 將上述克隆培養(yǎng)后進(jìn)行菌液PCR鑒定，以EGDe菌株作為陰性對(duì)照，以pksv7-Δvip載體作為陽性對(duì)照，為排除引物的污染將ddH2O作為引物的陰性對(duì)照。野生型擴(kuò)增片段為2 200 bp左右，敲除vip后擴(kuò)增片段為1 100 bp左右。

1.2.6 生長曲線測(cè)定 分別挑取EGDe和Δvip單個(gè)菌落接種于BHI液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床過夜培養(yǎng)16 h。取部分菌液按1∶100稀釋于新鮮培養(yǎng)基，將OD調(diào)至0.1左右。37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)1 h后，取200 μL菌液于分光光度計(jì)中測(cè)定OD600值，每1 h測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)量12 h，記錄細(xì)菌生長情況。

1.2.7 細(xì)菌RNA的抽提和RT-PCR 將EGDe和Δvip單個(gè)菌落接種于BHI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜后收集菌體于1.5 mL離心管中。加入1 mL預(yù)冷的苯酚乙醇(1∶9)重懸，冰浴30 min后5 000 r/min離心5 min，棄上清加入含50 U變?nèi)芫睾?.25 mg溶菌酶的裂解液超聲裂解30 min。再用RNA 提取試劑Trizol(Takara公司)繼續(xù)抽提RNA。將抽提的RNA反轉(zhuǎn)為cDNA 后利用VIP-KO-F和VIP-KO-R引物進(jìn)行PCR檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1目的基因片段的克隆

vip基因位于單增李斯特菌基因組344850～346049區(qū)段，根據(jù)其序列信息設(shè)計(jì)基因敲除構(gòu)建策略如圖1 所示。

圖1 單增李斯特菌vip基因敲除菌株構(gòu)建策略Fig.1 The construction of vip knockout Listeria monocytogenes

用引物分別擴(kuò)增上下游序列后得到與預(yù)期大小一致的條帶，上游為616 bp，下游為515 bp(圖2A)。將上下游片段經(jīng)酶切連接轉(zhuǎn)入pMD-19T載體后得到T-Δvip，菌液PCR鑒定結(jié)果如圖2B所示，抽提2號(hào)菌中的質(zhì)粒作為模板構(gòu)建穿梭載體。

2.2基因敲除穿梭載體的構(gòu)建

以T-Δvip質(zhì)粒為模板，用VIP-5F 和VIP-3R擴(kuò)增得到Δvip片段，連入穿梭載體pKSV7后得到pKSV7-Δvip，即重組穿梭載體。對(duì)該載體的酶切鑒定結(jié)果見圖3，4個(gè)克隆均為陽性，取1號(hào)克隆送測(cè)序，結(jié)果顯示序列同源性99%以上，為陽性克隆。

圖2 vip上下游同源臂片段的克隆與連接Fig.2 The construction of vip upstream and downstream fragmentsM：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)品；A：vip上下游片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果，1～8：不同PCR反應(yīng)管編號(hào)；B：vip上下游片段連接到pMD-19T載體后的菌液PCR鑒定結(jié)果，1～5：菌落編號(hào)M：DNA marker；A：the PCR results of vip upstream and downstream fragments，1-8：the number of PCR reaction tubes；B：the PCR results of bacterial clones after the ligation of vip upstream and downstream fragments with pMD-19T，1-5：the number of clones

圖3 pKSV7-Δvip敲除穿梭載體的酶切鑒定Fig.3 The verification of the shuttle vector pKSV7-Δvip by enzyme digestionM1、M2：不同的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)品；1～4：不同克隆菌落編號(hào)M1,M2:different DNA marker;1-4:the number of clones

2.3基因敲除菌株的篩選

將pKSV7-Δvip質(zhì)粒通過電穿孔轉(zhuǎn)入單增李斯特菌后，將含有重組載體的菌落進(jìn)行氯霉素和溫度篩選。菌落PCR鑒定結(jié)果如圖4 所示，只有2 200 bp左右片段為陰性克隆，只擴(kuò)增得到1 100 bp左右片段的為陽性克隆，顯示鑒定的9個(gè)克隆中除5號(hào)外均為陽性克隆。同時(shí)氯霉素抗性板培養(yǎng)結(jié)果顯示，8個(gè)克隆均不能在抗性板生長，為vip基因敲除 陽性克隆。

圖4 vip基因敲除菌株的PCR鑒定Fig.4 The verificati Identification of Δvip strains by PCRM：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)品；1～9：菌落編號(hào)；Vector：pKSV7-Δvip質(zhì)粒M：DNA marker；1-9：the number of clones；Vector：the pKSV7-Δvip plasmid

2.4vip基因敲除菌株的RT-PCR驗(yàn)證

為進(jìn)一步驗(yàn)證vip敲除菌株中vip基因的表達(dá)情況是否有改變，進(jìn)一步利用RT-PCR檢測(cè)了敲除菌株中vip的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果如圖5所示。在EGDe中可以檢測(cè)到vip基因的表達(dá)，而在敲除菌株1號(hào)和2號(hào)則檢測(cè)不到目的條帶(1號(hào)中條帶偏小為雜帶)。

圖5 vip敲除菌株的RT-PCR鑒定Fig.5 RT-PCR results of vip knockout strainsM：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)品；1～2：敲除菌株編號(hào)M：DNA marker；1-2：the number of mutant strains

2.5單增李斯特菌EGDe和Δvip的生長曲線測(cè)定

為進(jìn)一步研究vip基因的敲除是否對(duì)單增李斯特菌的生長活性產(chǎn)生影響，分別測(cè)定了野生型菌株和vip敲除菌株的生長曲線。結(jié)果顯示兩者的生長曲線無明顯區(qū)別(圖6)，提示vip基因的敲除不影響單增李斯特菌的生長活性。這一結(jié)果與Cabanes等[6]的發(fā)現(xiàn)并不一致，他們通過對(duì)EGDe (ATCC BAA-679)菌株中的vip敲除后發(fā)現(xiàn)敲除菌株在2～8 h內(nèi)的生長速率低于野生型菌株，但最后達(dá)到相同密度。這一結(jié)果的差異可能因?yàn)椴煌那贸呗栽斐?，Cabanes等完全敲除了vip基因的讀碼框，而我們的敲除策略中保留了C末端的30個(gè)氨基酸，這段氨基酸序列包含Vip蛋白的分選信號(hào)和膜定位信號(hào)。

圖6 vip敲除菌株的生長曲線Fig.6 The growth curve of vip knockout strains橫軸的0代表菌液稀釋后未培養(yǎng)前，1～12依次為培養(yǎng)1～12 h后0 point on axis represents the time point before culture, 1-12 represent the time point after culturing for 1-12 h

3 討 論

基因敲除不僅是研究基因功能的重要分子生物學(xué)手段，也是制備減毒疫苗的重要策略之一，對(duì)毒力基因的敲除可以大大加快減毒疫苗的研發(fā)速度。本研究構(gòu)建了既能在大腸埃希菌表達(dá)又能在單增李斯特菌表達(dá)的基因敲除穿梭載體，利用生物體內(nèi)的同源重組，在抗性和溫度的作用下篩選得到了單增李斯特菌的vip基因敲除菌株，并且發(fā)現(xiàn)vip基因的敲除對(duì)細(xì)菌的生長活性沒有明顯影響，為基因功能的研究和減毒疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

幾十年來，單增李斯特菌一直被作為一種研究病原菌-宿主免疫相互作用關(guān)系的重要的模式菌株。通過多年的研究，科學(xué)家對(duì)其基因組和基因的功能有了更為深入的了解，大量的毒力基因被發(fā)現(xiàn)。由于單增李斯特菌在激發(fā)天然免疫和T細(xì)胞免疫方面的優(yōu)勢(shì)，近年來科學(xué)家致力于將其作為腫瘤免疫治療的疫苗載體，通過基因重組等手段獲得減毒疫苗治療腫瘤。目前已有許多單增李斯特菌的腫瘤疫苗應(yīng)用于臨床I/II期研究。比如溶血毒素LLO是單增李斯特菌侵襲宿主、逃逸吞噬小體造成細(xì)胞間傳播的重要毒力因子[11]。目前已開發(fā)出多種LLO敲除的重組疫苗，如含有乳頭瘤病毒DNA的預(yù)防乳頭瘤的減毒疫苗，可以治療黑色素瘤的減毒疫苗。Advaxis公司開發(fā)的減毒活疫苗已進(jìn)入臨床實(shí)踐階段，他們將截?cái)嗟臒o溶血活性的LLO與乳頭瘤病毒E7蛋白融合制成疫苗，可以有效治療乳頭瘤病毒引起的宮頸癌等[12-13]。2015年，Lucia等研制的LLO相關(guān)的疫苗可以將黑色素瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化為樹突狀細(xì)胞，起到抗原提呈的作用，激發(fā)有效的細(xì)胞免疫，清除腫瘤細(xì)胞，同時(shí)一并清除細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌，無需額外使用抗生素[14]。目前，如何平衡毒力和有效激發(fā)免疫能力是疫苗研發(fā)的關(guān)鍵。除了LLO，其他毒力基因的敲除菌株如actA[15-16]、plcB[17]等也被作為潛在的疫苗載體得到研究。

表面蛋白是單增李斯特菌侵襲感染宿主細(xì)胞的重要毒力因子。在單增李斯特菌中存在40多種表面蛋白，其中有20多種只存在于具有侵襲感染能力的毒力株中，表明表面蛋白和細(xì)菌的侵襲密切相關(guān)[18]。vip基因編碼的Vip蛋白只在有毒力的單增李斯特菌株中表達(dá)，具有LPTGX序列，可以被Sortase酶錨定在細(xì)胞膜上[6]。研究發(fā)現(xiàn)Vip蛋白可以通過與細(xì)胞上的受體GP96作用，介導(dǎo)細(xì)菌對(duì)細(xì)胞的侵襲和感染，并在此過程中通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)干擾機(jī)體的免疫系統(tǒng)，使得細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)得以存活[19]，但是目前對(duì)其中具體的分子機(jī)制并不清楚。本研究構(gòu)建的vip敲除菌株雖未進(jìn)行毒力檢測(cè)，但可推測(cè)當(dāng)Vip蛋白缺失后細(xì)菌的侵襲能力會(huì)受到破壞，造成細(xì)菌毒力降低。另外，敲除vip基因會(huì)破壞Vip與GP96之間的相互作用，可能減弱細(xì)菌對(duì)宿主細(xì)胞免疫系統(tǒng)的干擾，誘發(fā)免疫激活?；谝陨贤茰y(cè)，vip敲除菌株將會(huì)是一種優(yōu)良的減毒疫苗載體。因此，本研究為單增李斯特菌減毒疫苗的研發(fā)提供了新的思路，對(duì)vip敲除菌株的侵襲能力及是否能有效激發(fā)細(xì)胞免疫的評(píng)價(jià)將是今后研究的重點(diǎn)。

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ConstructionandScreeningofvipGeneKnockoutListeriamonocytogenesStrains

Listeriamonocytogenes(LM) is a foodborne pathogen that widely exists in nature and foods. As an intracellular parasitic bacterium, it can cause striking cell immunity, and could be regarded as a potential vaccine vector. Genevipis an important virulence gene and closely related to the invasiveness of LM. Therefore, construction ofvipknockout LM strain will contribute to the R & D of LM vaccine. In this study, the upstream and downstream sequences of vip gene were amplified from LM-EGDe genome, and ligated into shuttle vector pKSV7 to get the knockout vector pKSV7-Δvip. Then the vector was electroperforated into LM. Under the double stresses of chloramphenicol and temperature, the knockout mutant strains by allelic recombination were obtained. Further study revealed no obvious changes on bacterial growth activity withoutvip. This study will contribute foundation for further study on the function ofvipgene as well as pathogenic mechanism and vaccine vector R & D of LM.

Listeriamonocytogenes(LM);vipgene knockout; mutant strain; homogenous recombination

上海理工大學(xué)博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目(1000308001)；上海理工大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(10-15-308-201)

李森 女，博士，講師。研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測(cè)，食源性致病菌致病機(jī)理研究等。E-mail：lisen1027@gmail.com

2016-09-02；

2016-10-27

Q933

A

1005-7021(2017)04-0016-07

10.3969/j.issn.1005-7021.2017.04.003

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《微生物學(xué)雜志》由中國微生物學(xué)會(huì)、遼寧省微生物學(xué)會(huì)、遼寧省微生物科學(xué)研究院主辦，為中國科技論文核心期刊、中國生物學(xué)核心期刊，被美國《化學(xué)文摘(CA)》、《英聯(lián)邦農(nóng)業(yè)文摘(CAB)》、《中國生物學(xué)文摘》、中國科學(xué)引文數(shù)據(jù)庫、CNKI中國期刊全文數(shù)據(jù)庫、中國核心期刊(遴選)數(shù)據(jù)庫等國內(nèi)外重要檢索刊物及數(shù)據(jù)庫摘引和收錄，是包括工業(yè)微生物學(xué)、農(nóng)業(yè)微生物學(xué)、醫(yī)學(xué)微生物學(xué)、獸醫(yī)微生物學(xué)、生物質(zhì)資源、食用菌學(xué)、生物工程學(xué)、加工技術(shù)及各相關(guān)領(lǐng)域的綜合性刊物，是國內(nèi)外科研人員、大中專院校師生、企業(yè)人士、醫(yī)生及生物學(xué)愛好者必讀的刊物。

《微生物學(xué)雜志》創(chuàng)刊于1978年，國內(nèi)外發(fā)行，雙月刊。發(fā)行面覆蓋國內(nèi)各地的圖書館、科研院所、高校、企業(yè)、醫(yī)院及港、澳、臺(tái)、北美、澳州、西歐、日本、東南亞等地。

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