賀 靜， 謝 靚， 曾玉倫， 陳淼芬， 蔣立文*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3.獸用中藥資源與中獸藥創(chuàng)制國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

454高通量技術(shù)比較兩種不同臭豆腐鹵水中微生物多樣性

賀 靜1,2， 謝 靚1,2， 曾玉倫1,2， 陳淼芬3， 蔣立文1,2*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3.獸用中藥資源與中獸藥創(chuàng)制國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

利用454高通量技術(shù)對(duì)兩種不同臭豆腐鹵水中微生物不同分類水平的多樣性進(jìn)行了評(píng)估和統(tǒng)計(jì)分析。經(jīng)過(guò)與SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比,發(fā)現(xiàn)了7個(gè)門(mén)、10個(gè)綱、17個(gè)目、26個(gè)科、24個(gè)菌屬。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)兩個(gè)樣品的微生物不同分類學(xué)差異顯著，主要集中在屬水平上，分布都非常不均一。在樣品A中厭氧球菌屬和卟啉單胞菌屬所占的比例最高，分別為40.22%、37.54%，成為優(yōu)勢(shì)菌屬。兩個(gè)樣品之間相同的微生物屬只有6個(gè)，比例差別極大。在樣品B中氨基桿菌屬的比例很大，為86.94%，占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。說(shuō)明鹵水原料來(lái)源不同對(duì)微生物的差異顯著，同時(shí)發(fā)現(xiàn)臭豆腐鹵水的發(fā)酵過(guò)程只與少數(shù)主要菌種有關(guān)。

臭豆腐鹵水; 微生物; 高通量技術(shù); 分析

臭豆腐是一種極具特色的臭味食品[1-2]。其特殊風(fēng)味的形成，主要是豆腐在鹵水制作過(guò)程中豆豉、冬筍、香菇等在自身內(nèi)源酶和微生物分泌酶系作用下形成大量包括吲哚、苯酚類風(fēng)味成分使得豆腐具有特殊的氣味。由于其發(fā)酵周期長(zhǎng)，不同品牌鹵水差異較大，因此研究鹵水制作過(guò)程中微生物多樣性和群落構(gòu)成具有重要意義，例如徐睿烜[3]、孫貴朋等[4]、何理等[5]利用傳統(tǒng)方法從臭豆腐鹵水中分離得到了優(yōu)勢(shì)微生物。但基于傳統(tǒng)分離培養(yǎng)得到的微生物只能代表目前培養(yǎng)條件可能獲得的微生物，無(wú)法預(yù)測(cè)所有微生物的信息。目前研究表明可培養(yǎng)微生物在整個(gè)微生物群落中不超過(guò)1%，所以結(jié)果具有一定的局限性[6]。相比之下，采用PCR-DGGE等分子生物學(xué)手段為研究微生物多樣性和群落結(jié)果帶來(lái)了革命性的突破[7-8]。454高通量測(cè)序技術(shù)是一種可以在一次測(cè)序試驗(yàn)中完成多個(gè)樣本的檢測(cè)，能獲得海量序列且靈敏度高，不僅能檢測(cè)出優(yōu)勢(shì)微生物，對(duì)于低豐度微生物也能檢出，能全面、準(zhǔn)確地揭示環(huán)境中微生物的多樣性[9-10]。高通量測(cè)序技術(shù)已被廣泛用于發(fā)酵食品中，如發(fā)酵蔬菜[11-12]、發(fā)酵乳[13-17]、酒精飲料[18]、發(fā)酵豆腐[19-20]等。454高通量測(cè)序技術(shù)研究避開(kāi)了微生物分離培養(yǎng)的過(guò)程，擴(kuò)展了微生物資源的利用空間，為微生物的研究提供了有效工具[21-22]。本研究通過(guò)454高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)兩種不同臭豆腐鹵水中微生物信息進(jìn)行比較，以探討微生物與臭豆腐鹵水風(fēng)味成分關(guān)系，為全面掌握臭豆腐鹵水中細(xì)菌的組成和改進(jìn)臭豆腐鹵水的制作工藝提供有效的參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 樣品來(lái)源 兩份臭豆腐鹵水樣品A(CDH_1)、B(CDQ_2)來(lái)自湖南兩個(gè)不同的臭豆腐生產(chǎn)企業(yè)。

1.1.2 試劑及儀器 電泳儀(DYY-12，北京六一儀器廠)；凝膠成像儀(GDS-8000，美國(guó)UVP 公司)； PCR儀(ABI GeneAmp?9700型)；454 Titanium FLX+測(cè)序儀，瑞士Roche；QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)，Promega公司；TransStart Fastpfu DNA Polymerase，TransGen AP221-02；AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒，AXYGEN公司。

1.2方法

1.2.1 PCR擴(kuò)增 采用破碎法提取兩份鹵水樣品中基因組DNA[11]，完成基因組DNA抽提后，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)抽提的基因組DNA并進(jìn)行DNA擴(kuò)增，454測(cè)序由上海美吉公司完成。DNA擴(kuò)增采用細(xì)菌 V1-V3 區(qū)通用引物。具體PCR擴(kuò)增引物，正向引物為27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCT-CAG-3′；反向引物為533R: 5′-TTACCGCGGCTGCTG-GCAC-3′(表1)。PCR擴(kuò)增程序：①95 ℃預(yù)變性2 min；②95 ℃變性30 s；③55 ℃退火30 s；④72 ℃延伸30 s；⑤重復(fù)②～④ 25次；⑤72 ℃延伸5 min。PCR 反應(yīng)產(chǎn)物用 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后用于測(cè)序，焦磷酸測(cè)序按照 454 Roche GS-FLX 的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行。

表1 PCR 反應(yīng)體系(20 μL)

1.2.2 數(shù)據(jù)分析 對(duì)454序列處理及后續(xù)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析采用一定的控制標(biāo)準(zhǔn)。為了得到每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類信息，采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，并在各個(gè)水平(門(mén)、綱、目、科、屬)統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品的群落組成，采用SILVA的核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比。同時(shí)對(duì)OTU數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步的分析，利用Rarefaction曲線、Rank-Abundance曲線進(jìn)行了多樣性評(píng)估；利用Venn、PCA圖進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1微生物在門(mén)的水平進(jìn)行分類及比較

由圖1和表2可知，從A(CDH_1)、B(CDQ_2)兩個(gè)樣品中共分離得到7個(gè)微生物菌門(mén)，其中都含有的有5個(gè)。在樣品A中厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、放線菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，所占比例分別為49.25%、38.08%、11.07%，都超過(guò)10%；在樣品B中互養(yǎng)菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，所占比例為87.21%。

2.2微生物在綱的水平進(jìn)行分類比較

由圖2和表3可知，樣品A中屬于厚壁菌門(mén)的梭菌綱、屬于擬桿菌門(mén)的擬桿菌綱、屬于放線菌門(mén)放線菌綱也是高居前3位，所占比例分別為42.90%、38.07%、11.07%。樣品B中屬于互養(yǎng)菌門(mén)的互養(yǎng)菌綱所占比例達(dá)到87.21%，成為優(yōu)勢(shì)菌綱。其他微生物菌綱，如屬于厚壁菌門(mén)芽胞桿菌菌綱、屬于變形菌門(mén)的γ-變形菌綱和α-變形菌綱在兩個(gè)樣品中所占的比例都相對(duì)較低。同時(shí)發(fā)現(xiàn)屬于擬桿菌門(mén)的黃桿菌綱只在樣品A鹵水中少量出現(xiàn)了，樣品B鹵水中沒(méi)有出現(xiàn)。

圖1 不同鹵水樣品門(mén)分類Fig.1 Phyla classification of different brine

序號(hào)類別名稱樣品A/%樣品B/%1厚壁菌門(mén)(Firmicutes)49．253．632擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)38．084．003放線菌門(mén)(Actinbacteria)11．070．314互養(yǎng)菌門(mén)(Synergistetes)0．4987．215變形菌門(mén)(Proteobacteria)0．203．546其他(Others)-0．237無(wú)類別的(Unclassified)0．911．07

圖2 不同鹵水樣品綱分類Fig.2 Class classification of different brine

序號(hào)類別名稱樣品A/%樣品B/%1梭菌綱(Clostridia)42．901．472擬桿菌綱(Bacteroidia)38．074．003放線菌綱(Actinobacteria)11．070．274芽胞桿菌綱(Bacilli)6．241．315互養(yǎng)菌綱(Synergistia)0．4987．216γ?變形菌綱(Gammaproteobacteria)0．090．377α?變形菌綱(Alphaproteobacteria)0．052．248黃桿菌綱(Flavobacteria)0．01-9其他(Others)0．101．9710無(wú)類別的(Unclassified)0．991．17

2.3微生物在目的水平進(jìn)行分類比較

由圖3和表4可知，兩個(gè)樣品中共24個(gè)微生物菌綱，相同的只占9種，在樣品A中分列前3位的是屬于梭菌綱的梭菌目、屬于擬桿菌綱的擬桿菌目、屬于放線菌綱的放線菌目，所占比例分別為42.89%、38.07%、10.09%。在樣品B中屬于互養(yǎng)菌綱的互養(yǎng)菌目的比例為87.21%，所占比例最高。其他微生物菌目，如黃桿菌目、棒狀桿菌目、鹽厭氧菌目、海洋螺菌目都只在樣品A鹵水中出現(xiàn),但是所占比例極少；芽胞桿菌目、鞘脂單胞菌目、微球菌目只在樣品B鹵水中出現(xiàn)，所占比例也是極少的。兩個(gè)樣品微生物菌群變化不明顯。

圖3 不同鹵水樣品目分類Fig.3 Order classification of different brine

序號(hào)類別名稱樣品A/%樣品B/%1梭菌目(Clostridiales)42．891．472擬桿菌目(Bacteroidales)38．074．003放線菌目(Actinomycetales)10．09-4乳桿菌目(Lactobacillales)6．240．985互養(yǎng)菌目(Synergistales)0．4987．216黃色單胞菌目(Xanthomonadales)0．062．247根瘤菌目(Rhizobiales)0．030．248柄桿菌目(Caulobacterales)0．010．019黃桿菌目(Flavobacteriales)0．01-10棒狀桿菌目(Corynebacteriales)0．01-11鹽厭氧菌目(Halanaerobiales)0．01-12海洋螺菌目(Oceanospirillales)0．01-13芽胞桿菌目(Bacillales)-0．3314鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales)-0．0415微球菌目(Micrococcales)-0．2716其他(Others)0．122．0517無(wú)類別的(Unclassified)1．151．17

2.4微生物在科的水平進(jìn)行分類比較

由圖4和表5可以看出，兩個(gè)樣品中共26個(gè)微生物菌科。

圖4 不同鹵水樣品科分類Fig.4 Family classificationof different brine

樣品A中有很大一部分是科未定的，其比例占到42.36%；其次是屬于擬桿菌目的紫單胞菌科、屬于放線菌目的放線菌科，所占比例分別為37.63%、10.09%。而在樣品B中屬于互養(yǎng)目的互養(yǎng)菌科所占比例為87.21%，優(yōu)勢(shì)菌群幾乎沒(méi)有變化。兩個(gè)樣品中出現(xiàn)了11個(gè)不同的菌科，根瘤菌科、類芽胞桿菌科、球菌科、高溫放線菌科、微桿菌科、鞘脂單胞菌科、橙單胞菌科在樣品A中都沒(méi)有出現(xiàn)，在B鹵水中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)黃桿菌科、棒狀桿菌科、鹽單胞菌科、鹽厭氧菌科?？傊?，在科水平上，兩個(gè)鹵水樣品的主要菌群變化不大，但是兩個(gè)鹵水的差異明顯。

表5 不同鹵水微生物科分類之間的差異

2.5微生物在屬的水平進(jìn)行分類比較

由圖5和表6可知，厭氧球菌屬和卟啉單胞菌屬，在樣品A鹵水中為優(yōu)勢(shì)菌屬，所占比例分別為40.22%、37.54%，這兩種菌屬在樣品B鹵水中完全沒(méi)有出現(xiàn)；氨基桿菌屬在樣品B鹵水中的含量達(dá)到了86.94%，占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，而在樣品A鹵水的比例為0.49%。兩個(gè)樣品在24個(gè)菌屬中，僅有6個(gè)相同的菌屬，且所占比例差異較大，所以兩個(gè)樣品差異顯著。

圖5 不同鹵水樣品屬分類Fig.5 Genus classification of different brine

序號(hào)類別名稱樣品A/%樣品B/%1厭氧球菌屬(Anaerococcus)40．22-2卟啉單胞菌屬(Porphyromonas)37．54-3放線桿菌屬(Actinobaculum)6．99-4肉桿菌屬(Atopostipes)5．05-5消化鏈球菌屬(Peptoniphilus)2．060．446四體球菌屬(Tetragenococcus)1．00-7氨基桿菌屬(Aminobacterium)0．4986．948擬桿菌屬(Bacteroides)0．362．559依格納季氏菌屬(Ignatzschineria)0．062．2410乳球菌屬(Lactococcus)0．010．0411乳桿菌屬(Lactobacillus)0．010．7212短波單胞菌屬(Brevundimonas)0．01-13鹽單胞菌屬(Halomonas)0．01-14棒狀桿菌屬(Corynebacterium)0．01-15假單胞菌屬(Kroppenstedtia)-0．0216微桿菌屬(Microbacterium)-0．1217鏈球菌屬(Streptococcus)-0．0118蒼白桿菌屬(Ochrobactrum)-0．0319根瘤菌屬(Rhizobium)-0．0120芽胞桿菌屬(Brevibacillus)-0．0121未分級(jí)的(Norank)0．010．0222無(wú)法培養(yǎng)(Uncultured)0．030．5123其他(Others)0．874．4324未分類的(Unclassified)5．291．92

經(jīng)過(guò)上面不同類水平的分析并結(jié)合圖6，還發(fā)現(xiàn)兩個(gè)樣品的微生物分布都高度集中在屬的水平上，且主要微生物菌群的變化都不明顯。

圖6 兩個(gè)樣品中細(xì)菌組成圖Fig.6 Compositions of bacteria in two samples

2.6Rarefaction曲線

Rarefaction曲線是從樣本中抽取一定量的個(gè)體，統(tǒng)計(jì)這些個(gè)體代表的物種數(shù)目，并以個(gè)體數(shù)與物種數(shù)來(lái)構(gòu)建曲線。圖7橫坐標(biāo)表示的是OTU數(shù)目，縱坐標(biāo)表示的是樣本序列數(shù)，樣品A和B的曲線趨于平坦，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)足以覆蓋所有的微生物，表明了樣品中微生物的多樣性。對(duì)兩個(gè)樣品的豐度進(jìn)行比較，可知樣品B(CDQ_2)中微生物的多樣性程度明顯比樣品A(CDH_1)要豐富。

圖7 Number of Reads Sampled label:0.97曲線Fig.7 Number of Reads Sampled label:0.97 curve

2.7Rank-Abundance曲線

Rank-Abundance曲線是分析多樣性的一種方式，可用來(lái)解釋多樣性的兩個(gè)方面，即物種豐度和物種均勻度。圖8中橫坐標(biāo)表示OTU等級(jí)，縱坐標(biāo)對(duì)應(yīng)的是OTU中序列數(shù)的相對(duì)百分含量。樣品B(CDQ_2)的曲線比樣品A(CDH_1)的曲線稍緩，說(shuō)明樣品B(CDQ_2)中的微生物分布更均一。

圖8 相對(duì)豐度圖Fig.8 Rank-Abundance curve

2.8OTU分布Venn圖

經(jīng)過(guò)454高通量測(cè)序，在97%相似度水平上劃分 OTU，在樣品A(CDH_1)和B(CDQ_2)分別發(fā)現(xiàn)243個(gè)和360個(gè)高質(zhì)量的OTU。圖9直觀地統(tǒng)計(jì)了兩個(gè)樣品中所共有和獨(dú)有的OTU數(shù)目及重疊情況。從圖9中可分析出重疊部分OTU占總OTU的4%左右，說(shuō)明兩個(gè)樣品間微生物的差異性顯著。

圖9 維恩圖Fig.9 Venn diagram

2.9PCA分析

圖10中以樣本A(CDH_1)和樣本B(CDQ_2)中所有菌群做樣品，進(jìn)行PCA分析，主成分1(PC1)和主成分2(PC2)是造成兩個(gè)樣品的兩個(gè)最大差異特征，貢獻(xiàn)率分別為100% 和0%。 兩個(gè)樣品出現(xiàn)明顯的分離狀態(tài)且距離比較遠(yuǎn)，經(jīng)分析可以推斷兩個(gè)樣品的菌落結(jié)構(gòu)差異比較大。這種現(xiàn)象說(shuō)明，原料來(lái)源不同，微生物的情況差異顯著。

圖10 主成分分析圖Fig.10 Principal Component Analysis

3 討 論

本研究通過(guò)454高通量技術(shù)，對(duì)兩個(gè)不同鹵水中的微生物多樣性和菌落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。Rarefaction曲線得出樣品B中微生物多樣性程度比樣品A高；Rank-Abundance曲線中得出樣品B曲線比樣品A平緩。從微生物的門(mén)、綱、目、科、屬的水平進(jìn)行分類比較，測(cè)出了7個(gè)菌門(mén)、10個(gè)菌綱、17個(gè)菌目、26個(gè)菌科、24個(gè)菌屬。同時(shí)通過(guò)OTU分布Venn圖和PCA圖分析也發(fā)現(xiàn)兩個(gè)樣品中微生物的相似度不高，差異顯著。樣品A和樣品B中的微生物分布都非常不均一，都高度集中到屬的水平上。例如，樣品B中86.94%的細(xì)菌都是互養(yǎng)門(mén)、互養(yǎng)綱、互養(yǎng)目、互養(yǎng)科的氨基桿菌屬。經(jīng)過(guò)以上研究發(fā)現(xiàn)臭豆腐鹵水的發(fā)酵過(guò)程只與少數(shù)主要菌種有關(guān)，為后續(xù)臭豆腐的工業(yè)化發(fā)展提供一定的依據(jù)。由于微生物發(fā)酵自然進(jìn)行，樣品沒(méi)有辦法重復(fù)，有一定的偶然性，同類別的發(fā)酵食品品質(zhì)指標(biāo)有差異，如風(fēng)味物質(zhì)、感官等實(shí)際上還是原料、微生物、工藝等差異性造成的，所以下一步有必要對(duì)臭豆腐鹵水的原料在發(fā)酵過(guò)程中微生物群變化規(guī)律、生理生化反應(yīng)、氣味物質(zhì)形成及變化進(jìn)行研究，以期待為傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)升級(jí)提供參考。

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ComparisonofTwoDifferentStinkyTofuBrinesMicrobialDiversitywith454High-ThroughputTechniques

HE Jing1, 2, XIE Jing1, 2, ZENG Yu-lun1, 2, CHEN Miao-fen3, JIANG Li-wen1, 2

(1.Coll.ofFoodSci. &Tech.,HunanAgric.Uni.,Changsha410128; 2.HunanProv.KeyLab.ofFoodSci. &Biotech.,Changsha410128; 3.Nat′l&Prov.UnionEngin.Res.Ctr.fortheVet.HerbalMed.Res. &Initiative,Coll.ofFoodSci. &Tech.,Changsha410128)

454 high-throughput techniques were used to evaluate and statistically analyze the microbial diversity assessment in two different stinky tofu brines. It was found 7 phyla, 10 classes, 17 orders, 26 families and 24 genera after comparing with SILVA database. Larger differences of microbial species and concentrated at the genus level, and the distribution was very heterogeneous were found in these two samples. In the sample AAnaerococcusandPorphyromonasowe the highest proportion, 40.22%, 37.54% respectively. Only six of the same genus in the two samples, and the proportion of great difference was very heterogeneous were found. In the sample B,Aminobacteriumhave accounted for the largest proportion for 86.94%, become the absolute dominant bacteria. The experiment showed that the original material of the stinky tofu brine had a great influence on microbial differences. And found in stinky tofu brine during the fermentation only with a few major strains related.

stinky tofu brine; microbial; high-throughput technique; analysis

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31571819)

賀靜 女，碩士研究生。研究方向?yàn)槭称芳庸づc安全。E-mail:1242447550@qq.com

* 通訊作者。男，教授，博士。研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail:hnndjlw@163.com

2016-09-05；

2016-11-02

Q938；TS214.2

A

1005-7021(2017)04-0046-07

10.3969/j.issn.1005-7021.2017.04.008