楊 艷, 王厚照 , 張 玲

(廈門大學 附屬成功醫(yī)院/安徽醫(yī)科大學 解放軍174臨床學院，福建 廈門 361003)

多重耐藥鮑曼不動桿菌氨基糖苷類修飾酶與16SrRNA甲基化酶基因的研究

楊 艷, 王厚照*, 張 玲

(廈門大學 附屬成功醫(yī)院/安徽醫(yī)科大學 解放軍174臨床學院，福建 廈門 361003)

了解氨基糖苷類修飾酶、16S rRNA甲基化酶基因在多重耐藥鮑曼不動桿菌中的流行情況。收集2014年12月至2015年3月廈門大學附屬成功醫(yī)院住院患者臨床分離的多重耐藥鮑曼不動桿菌共28株，采用VIKET Compact 2 全自動細菌鑒定系統(tǒng)進行細菌鑒定，應用紙片擴散法(K-B法)檢測鮑曼不動桿菌對抗菌藥物的耐藥性，采用聚合酶鏈反應(PCR)法檢測氨基糖苷類修飾酶、16S rRNA甲基化酶基因。結果顯示，多重耐藥鮑曼不動桿菌除對頭孢哌酮/舒巴坦耐藥率為21.4%外，對其他所測藥物耐藥率均>50%，本組28株多重耐藥鮑曼不動桿菌共檢出5種氨基糖苷類修飾酶基因aac(3)-Ⅰ、aac(3)-Ⅱ、aac(6′)-Ⅰb、ant(3")-Ⅰ、aph(3′)-Ⅰ和1種16S rRNA甲基化酶基因armA，陽性率分別為85.7%(24株)、7.14%(2株)、67.8%(19株)、92.9%(26株)、53.6%(15株)和 82.1%(23株)。氨基糖苷類修飾酶、16S rRNA甲基化酶耐藥基因是多重耐藥鮑曼不動桿菌對氨基糖苷類耐藥的重要原因。

鮑曼不動桿菌；多重耐藥性；氨基糖苷類修飾酶；16S rRNA甲基化酶；耐藥基因

鮑曼不動桿菌是引起院內感染重要的條件致病菌，臨床檢出率不斷上升、嚴峻的耐藥形勢受到廣大醫(yī)療工作者的廣泛關注。氨基糖苷類常用來治療鮑曼不動桿菌引起的感染，由于多重耐藥菌株的不斷增加，鮑曼不動桿菌對β-內酰胺類耐藥率不斷增加的同時，對氨基糖苷類耐藥率也在不斷上升。為探討鮑曼不動桿菌對氨基糖苷類抗菌藥物的耐藥機制，本研究對廈門大學附屬成功醫(yī)院2014年12月至2015年3月收集的多重耐藥鮑曼不動桿菌進行氨基糖苷類修飾酶與16S rRNA甲基化酶基因檢測，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 菌株來源 收集2014年12月至2015年3月廈門大學附屬成功醫(yī)院住院患者臨床分離的多重耐藥鮑曼不動桿菌28株，剔除同一患者相同部位重復分離的菌株。所有菌株均采用VIKET Compact 2 全自動細菌鑒定儀進行鑒定。標本來源為23株痰液、4株分泌物、1株尿液。多重耐藥鮑曼不動桿菌的判定標準：對5類抗菌藥物(頭孢菌素類、氟喹諾酮類、氨基糖苷類、碳青霉烯類和β-內酰胺酶抑制劑)中3類及以上耐藥的。質控菌株：大腸埃希菌ATCC25922 和銅綠假單胞菌ATCC27853。

1.1.2 藥敏試驗 采用紙片擴散法(K-B法)進行藥物敏感性試驗，根據(jù)2013年版美國臨床實驗室標準化研究所(CLSI)的標準判斷藥敏試驗結果。

1.1.3 儀器和試劑 全自動細菌鑒定儀VIKET Compact 2、GN細菌鑒定卡(法國梅里埃公司)；PCR擴增儀(eppendorf公司)；超微量分光光度計(德國IMPLEN公司)；電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)；PCR試劑盒(TaKaRa，大連寶生物工程有限公司)；M-H平板、藥敏紙片(英國OXOID 公司)；DNA Marker及PCR引物(上海生工生物工程有限公司)。

1.2方法

1.2.1 引物設計 引物序列參考文獻[1]，引物序列及產(chǎn)物長度見表1。

表1 靶基因PCR引物序列及終產(chǎn)物長度

續(xù)表1

1.2.2 DNA模板的制備 采用煮沸法提取細菌的DNA：挑取純培養(yǎng)菌落置于1.5 mL EP 管中(裝有200 μL無菌純水)，震蕩混勻，制成均勻的菌懸液。金屬浴100 ℃煮沸10 min， 14 000 r/min離心10 min，上清液即為DNA模板溶液， IMPLEN超微量分光光度計檢測DNA 模板含量，將濃度調整一致。

1.2.3 耐藥基因檢測 各耐藥基因均采用PCR法檢測。PCR反應體系：P1引物1 μL、P2引物1 μL，dNTP 4 μL，10×PCR buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl23 μL，Taq酶0.3 μL，DNA模板液2 μL，超純水33.7 μL，總反應體系50 μL。PCR擴增循環(huán)參數(shù)為：93 ℃預變性2 min，93 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，循環(huán)35個周期，最后72 ℃延長5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，凝膠成像系統(tǒng)觀察結果同時拍照保存。

1.2.4 DNA序列測序 PCR陽性產(chǎn)物純化后由上海生工生物工程有限公司測序，并與NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫進行比對。

2 結果與分析

2.1藥敏試驗結果

本組多重耐藥鮑曼不動桿菌耐藥情況較嚴重，除頭孢哌酮/舒巴坦耐藥率最低，為21.4%外，其他藥物耐藥率均>50%。結果見表2。

表2 28株多重耐藥鮑曼不動桿菌藥敏試驗結果(n(%))

續(xù)表2

2.2氨基糖苷類修飾酶與16SrRNA甲基化酶基因的檢出情況

對28株多重耐藥鮑曼不動桿菌進行9種氨基糖苷類修飾酶基因、6種16S rRNA甲基化酶基因檢測發(fā)現(xiàn)：氨基糖苷類修飾酶基因檢出aac(3)-Ⅰ基因24株、aac(3)-Ⅱ基因2株、aac(6′)-Ⅰb基因19株、ant(3″)-Ⅰ基因26株、aph(3′)-Ⅰ基因15株； 16S rRNA甲基化酶基因檢出armA 23株，各基因檢出率見表3。陽性基因電泳圖見圖1～圖6。分別抽取1株aac⑶-Ⅰ基因、aac(6′)-Ⅰb基因、ant(3″)-Ⅰ基因、armA基因進行基因測序，與GenBank上登錄的標準序列比對同源性均>99.9%。

圖1 aac(3)-Ⅰ基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 The aac(3)-Ⅰgene electrophoresis of PCR productsM: DNA marker；P: 陽性對照；N：陰性對照；S：樣本M: DNA marker; P: Positive control; N: Negative control;S: Samples

圖2 aac(3)-Ⅱ基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 The aac(3)-Ⅱgene electrophoresis of PCR productsM: DNA marker；P: 陽性對照；N：陰性對照；S:樣本M: DNA marker; P: Positive control; N: Negative control; S: Samples

圖3 aac(6′)-Ⅰb基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.3 The aac(6′)-Ⅰb gene electrophoresis of PCR productsM: DNA marker；P: 陽性對照；N：陰性對照；S：樣本M: DNA marker; P: Positive control; N: Negative control; S: Samples

圖4 ant(3″)-Ⅰ基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.4 The ant(3″)-Ⅰgene electrophoresis of PCR productsM: DNA marker；P: 陽性對照；N：陰性對照；S：樣本M: DNA marker; P: Positive control; N: Negative control; S: Samples

圖5 aph(3′)-Ⅰ基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.5 The aph(3′)-Ⅰgene electrophoresis of PCR productsM: DNA marker；P: 陽性對照；N：陰性對照；S:樣本M: DNA marker; P: Positive control; N: Negative control; S: Samples

圖6 armA基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.6 The armA gene electrophoresis of PCR productsM: DNA marker；P: 陽性對照；N：陰性對照；S:樣本M: DNA marker; P: Positive control; N: Negative control; S: Samples

3 討 論

鮑曼不動桿菌主要分布在重癥監(jiān)護病房(ICU)[2]，已成為ICU 內患者感染的首位病原菌[3], 常造成感染的暴發(fā)流行，且ICU 內感染主要是由多重耐藥菌株引起[4]，多重耐藥菌的檢出率不斷增多，給臨床抗感染工作帶來了巨大的壓力。

氨基糖苷類藥物作用機制是與細菌核糖體30S亞單位的16S rRNA解碼區(qū)的A位點結合，抑制細菌蛋白質的合成，從而導致細菌死亡。氨基糖苷類因其抗菌譜廣、抗菌效果好，在臨床抗感染工作中廣泛應用的同時耐藥現(xiàn)象也越來越嚴重。氨基糖苷類耐藥機制主要包括：外膜通透性降低、產(chǎn)生氨基糖苷類修飾酶(AMEs)、甲基化修飾、主動外排及靶位點的突變，其中最主要的是產(chǎn)生AMEs 和甲基化修飾產(chǎn)生16S rRNA甲基化酶[5]，AMEs按功能分為三類：①乙酰轉移酶(AAC)，使游離羥基乙?；虎诤塑辙D移酶(ANT)，使游離羥基核苷化；③磷酸轉移酶(APH)，使游離羥基磷酸化。三大類共50余種，AMEs修飾氨基糖苷類的特定基團的結果是引起共價鍵改變，導致藥物不易進入菌體與靶位結合，從而產(chǎn)生耐藥性。

鮑曼不動桿菌中已檢出aac(3)-I、aac(3)-Ⅱ，aac(3)-Ⅲ、aac(3)-Ⅳ、aac(2′)-Ib、aac(6)-I、ant(2″)-I、ant(3″)-I、aphA1、aphA6等多種AMEs基因[6-7]，本組28株多重耐藥鮑曼不動桿菌檢出：aac(3)-Ⅰ、aac(3)-Ⅱ、aac(6′)-Ⅰb、ant(3″)-Ⅰ、aph(3′)-Ⅰ共5種AMEs基因。除aac(3)-Ⅱ檢出率(7.14%)最低外，其余4種基因檢出率均>50%,其中ant(3″)-Ⅰ基因檢出率高達92.9%，因此，可見氨基糖苷類耐藥基因在本院多重耐藥鮑曼不動桿菌中廣泛存在。

氨基糖苷類抗菌藥物作用的靶位點是16S rRNA，甲基化修飾的16S rRNA與氨基糖苷類的親和力降低，因此導致對氨基糖苷類的高水平耐藥[8-9]，16S rRNA甲基化酶的編碼基因包括rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、rmtE、npm和armA等，其中armA和rmtB是主要基因[10]。rmtB基因主要見于腸桿菌科細菌[11]，armA基因主要位于鮑曼不動桿菌的染色體上。本組28株多重耐藥鮑曼不動桿菌檢出23株攜帶armA基因，檢出率達82.1%，顯示armA基因在鮑曼不動桿菌中廣泛存在，與研究報道相一致[12]。

本研究發(fā)現(xiàn)，同一細菌檢出2種以上氨基糖苷類耐藥基因較多，并且出現(xiàn)多種不同的基因組合形式，與耐藥性結果綜合分析發(fā)現(xiàn)：耐藥表型與基因型并不是一一對應關系。值得注意的是,本組有兩株菌未檢出AMEs基因和16S rRNA甲基化酶基因，但表現(xiàn)為對妥布霉素和慶大霉素耐藥，后續(xù)實驗檢測外排泵基因結果顯示這兩株菌adeB外排泵基因均陽性，證明氨基糖苷類耐藥可能與主動外排系統(tǒng)有關，結果與報道一致[13]。

綜上所述，廈門大學附屬成功醫(yī)院多重耐藥鮑曼不動桿菌中檢出5種AMEs基因和1種16S rRNA甲基化酶基因，以ant(3″)-Ⅰ、aac(3)-Ⅰ、armA陽性率最高，基因攜帶率高且多種基因常同時存在，是鮑曼不動桿菌對氨基糖苷類耐藥的主要原因。因此，加強細菌耐藥性監(jiān)測和耐藥基因的研究對于臨床提高抗感染治療的效率和探求細菌耐藥機制及其傳播方式具有重要意義。

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AminoglycosideModifyingEnzymesand16SrRNAMethylaseGenesinMulti-DrugResistantAcinetobacterbaumannii

YANG Yan, WANG Hou-zhao, ZHANG Ling

(Affil.ChengGongHosp.ofXiamenUni.,PLA174Clin.Coll.ofAnhuiMed.Uni.,Xiamen361003)

The prevalence of aminoglycoside modifying enzymes and 16S rRNA methylase genes in multi-drug resistantAcinetobacterbaumanniiwas studied. A total of 28 multi-drug resistantA.baumanniiisolates were collected from Dec. 2014 to Mar. 2015 from patients in the ChengGong Hospital Affiliated to Xiamen University. Bacterial identification was performed by VITEK 2 Compact automatic bacterial identification system. Kirby-Bauer Diffusion Method was used to detect the drug resistance of antimicrobial drugs. The aminoglycoside modifying enzymes and 16S rRNA methylase genes were amplified by polymerase chain reaction (PCR). The results showed that the resistance rate of all the other measured drugs were all above 50% except for cefoperazone-sulbactam (21.4%). 5 kinds of aminoglycoside modifying enzyme genes includingaac(3)-I,aac(3)-II,aac(6′)-Ib,ant(3")-I,aph(3′)-I and one kind of 16S rRNA methylase genearmA were found in 28 strains of multi-drug resistant A. baumannii with the positive rates at 85.7% (24 strains), 7.14% (2 strains), 67.8% (19 strains), 92.9% (26 strains), 53.6% (15 strains) and 82.1% (23 strains) respectively. Therefore the genes of aminoglycoside modifying enzymes and 16S rRNA methylase were the major reasons for the resistance to aminoglycosides in multi-drug resistantA.baumannii.

Acinetobacterbaumannii; multi-drug resistance; aminoglycoside modifying enzymes; 16S rRNA methylase; medicine-resistance gene

全軍醫(yī)學科技青年培育項目(13QNP047)

楊艷 女，碩士，主管檢驗師。 主要從事臨床免疫學和微生物學檢驗。 E-mail:yangyan_1878@126.com

* 通訊作者。男，碩士，副主任技師。主要從事檢驗科管理工作。E-mail:wanghouzhao@126.com

2016-12-06；

2016-12-28

Q939.93

A

1005-7021(2017)04-0028-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2017.04.005

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