超 博， 張 紅， 李文月， 邵思奇， 張志民

(吉林大學口腔醫(yī)學院 牙體牙髓病科，吉林 長春 130041)

變形鏈球菌耐氟菌株耐酸相關(guān)基因ropA的克隆及蛋白表達

超 博， 張 紅， 李文月， 邵思奇， 張志民*

(吉林大學口腔醫(yī)學院 牙體牙髓病科，吉林 長春 130041)

克隆并表達變形鏈球菌耐氟菌株耐酸相關(guān)基因ropA。以變形鏈球菌UA159的耐氟菌株全基因組為模版，PCR擴增ropA基因并與pMD-18T克隆載體連接構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒，測序鑒定。BamHⅠ、Hind Ⅲ雙酶切重組克隆質(zhì)粒,回收目的基因片段并與pProEX HTa表達載體通過粘性末端連接構(gòu)建重組表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌感受態(tài)細胞DH5α，IPTG誘導，SDS-PAGE檢測RopA表達量。測序結(jié)果為變形鏈球菌UA159的耐氟菌株ropA基因堿基序列與親代菌株UA159完全一致。SDS-PAGE結(jié)果顯示IPTG成功誘導RopA蛋白表達，并且隨誘導時間的延長蛋白表達增多。變形鏈球菌UA159耐氟菌株的耐酸相關(guān)基因ropA未發(fā)生突變，說明變形鏈球菌耐氟菌株耐酸性增強不是由ropA堿基序列的改變導致。本研究成功誘導RopA蛋白表達，為后續(xù)研究RopA蛋白功能奠定了基礎(chǔ)。

變形鏈球菌；耐氟菌株；耐酸相關(guān)基因ropA；克隆；蛋白表達

氟化物是目前應用最廣泛的防齲制劑[1]。臨床常用的防齲制劑氟化物可以進入正在形成的礦化的磷灰石中形成氟磷灰石使磷灰石的晶體穩(wěn)定性得到增強，還能抑制細菌的質(zhì)子移位ATP酶及磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)，降低細菌的產(chǎn)酸能力，預防齲病的發(fā)生[2]。但是長期局部高濃度氟化物的使用可能導致口腔中耐氟菌株的選擇性生長[3]。耐氟菌株不僅能降低局部用氟產(chǎn)生的抑齲效果,而且較親代菌株更不易被氟化物所抑制。變形鏈球菌耐氟菌株H+ATP酶活性高于親代菌株,從而導致其耐酸性增強,致齲能力增強。當pH值降至5.5以下時，耐氟菌株顯示出較強的產(chǎn)酸力，繼續(xù)產(chǎn)酸并脫礦，使菌斑致齲力增強。研究耐氟菌株可以了解變形鏈球菌耐氟菌株突變后致齲毒力的變化，為臨床上合理應用氟化物及尋找新的防齲藥物提供依據(jù)。近年來，耐氟菌株的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生物學行為和基因組學等內(nèi)容已成為研究熱點[4]。變形鏈球菌利用口腔內(nèi)多種糖源，源源不斷地合成乳酸，導致牙釉質(zhì)脫礦齲損形成。因此，細菌黏附于牙齒表面形成生物膜，糖代謝產(chǎn)酸，以及在低pH值等惡劣環(huán)境下的生存能力是致齲的關(guān)鍵[5]。ropA基因又是變形鏈球菌耐酸反應以及生物膜形成等重要毒力因素的主要調(diào)節(jié)基因，本研究旨在克隆ropA，測定其基因序列有無突變，并將其在大腸埃希菌中表達，從分子水平上研究耐氟菌株耐酸性增強的原因，進一步確定ropA編碼的激發(fā)因子的調(diào)控能力，為進一步探討其在變形鏈球菌致齲過程中的作用以及在疾病防治領(lǐng)域的應用奠定基礎(chǔ)[6]。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 菌株及載體 吉林大學口腔醫(yī)學院實驗室保存的變形鏈球菌UA159耐氟菌株StreptococcusmutansUA159-FR。大腸埃希菌感受態(tài)細胞DH5α購自博邁德生物公司。克隆載體pMD18-T載體購自寶生物工程有限公司。原核表達載體pProEX Hta購自賽奧克生物公司。

1.1.2 試劑 細菌DNA少量提取試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒購自Magen生物公司；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ，T4 DNA連接酶購自Takara公司，細菌蛋白提取試劑盒購自凱基生物公司，BCA法蛋白定量測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2方法

1.2.1 引物的設(shè)計 根據(jù)GenBank上發(fā)表的S.mutansUA159 ropA(登陸號：NC-004350.2)的基因序列，設(shè)計引物并送至庫美生物公司合成。ropA基因長度為1 284 bp，內(nèi)側(cè)引物擴增產(chǎn)物長度為1 302 bp，外側(cè)引物擴增產(chǎn)物長度為1 757 bp。外側(cè)上游引物:AGTGCTTGTAATAGTTGTATCAGTC；外側(cè)下游引物：GGATCAAAGCCGAAAGACTAACCATT；內(nèi)側(cè)上游引物：CGCGGATCCATGTCTACATCATTTGAAAAC(下劃線為BamHⅠ酶切位點)；內(nèi)側(cè)下游引物：CCCAAGCTTTTATTTAACTTTAGCAGAATCAGTA(下劃線為Hind Ⅲ酶切位點)。

1.2.2ropA的擴增與克隆 用細菌DNA少量提取試劑盒提取S.mutansUA159-FR的全基因組作為模版，巢式PCR擴增目的基因。外側(cè)引物擴增反應條件：預變性94 ℃ 1 min；克隆循環(huán)：變性94 ℃ 30 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 7 min，循環(huán)30次；總延伸：72 ℃ 10 min。瓊脂糖凝膠電泳外側(cè)引物的擴增產(chǎn)物，切膠回收目的產(chǎn)物條帶，作為內(nèi)側(cè)引物擴增的模版。內(nèi)側(cè)引物反應條件：預變性94 ℃ 1 min；克隆循環(huán)：變性94 ℃ 30 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 5 min，循環(huán)25次；總延伸：72 ℃ 10 min。將目的基因與克隆載體pMD18-T載體連接16 ℃,反應30 min。將重組質(zhì)粒用熱激法轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌感受態(tài)細胞DH5α，過夜培養(yǎng)，利用藍白篩選，挑取白色菌落，接種至具有氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基，提取質(zhì)粒，進行質(zhì)粒PCR鑒定，將含有目的基因的重組質(zhì)粒送至庫美生物公司測序鑒定。

1.2.3ropA表達載體的構(gòu)建BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定正確的重組克隆質(zhì)粒及pProEX Hta表達載體。瓊脂糖凝膠電泳，回收酶切后有黏性末端的目的基因片段及表達載體，加入T4 DNA連接酶，16 ℃孵育過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌感受態(tài)細胞，提取重組表達質(zhì)粒，酶切鑒定。

1.2.4 RopA蛋白的表達 取1 mL含重組表達質(zhì)粒的大腸埃希菌菌液于1.5 mL離心管中作為IPTG誘導前樣品，其余培養(yǎng)物中添加IPTG至終濃度為1 mmol/L[7]，分別于1、2、3、4 h取1 mL菌液于1.5 mL離心管中。菌液離心后收集菌體，用PBS將菌沉淀重懸洗滌2～3次；加入100 μL Lysis工作液重懸菌體，4 ℃孵育10 min，反復凍融后收集上清。利用BCA法測定提取蛋白濃度，將蛋白濃度稀釋一致后上樣進行SDS-PAGE蛋白電泳，考馬斯亮藍染色分析蛋白表達的情況。

2 結(jié)果與分析

2.1ropA基因的克隆及堿基序列測定

以變形鏈球菌全基因組為模版，用外側(cè)引物擴增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，與預期大小1 757 bp一致。以回收純化的PCR產(chǎn)物為模版，用內(nèi)側(cè)引物擴增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，位置與預期大小1 302 bp一致(圖1)?；厥占兓瘍?nèi)側(cè)引物擴增產(chǎn)物，與克隆載體pMD18-T載體連接構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒并送檢。將重組克隆質(zhì)粒的測序結(jié)果與GenBank中變形鏈球菌UA159的ropA基因序列進行Blast比對，未發(fā)現(xiàn)突變位點。由此推測變形鏈球菌耐氟菌株耐酸性增強并不是由氟化物誘導變形鏈球菌ropA基因突變進而改變RopA蛋白結(jié)構(gòu)和功能所導致。

圖1 ropA的PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of ropAM:DL 2 000 DNA分子量標準;1:外側(cè)引物擴增產(chǎn)物；2:內(nèi)側(cè)引物擴增產(chǎn)物M:DL 2 000 DNA Marker;1：Outer primer amplification product；2：Inside primer amplification product

2.2構(gòu)建重組表達質(zhì)粒及RopA蛋白的表達

BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切重組克隆質(zhì)粒后獲得大小約1 284 bp的插入片段，大小與目的基因一致。酶切后pProEX Hta表達載體與未酶切質(zhì)粒相比條帶位置高，說明質(zhì)粒在限制性內(nèi)切酶作用下由環(huán)狀變?yōu)榫€狀，具有黏性末端(圖2)。SDS-PAGE蛋白電泳結(jié)果顯示，可見目的蛋白條帶位于40～55 kDa之間，與預期大小48 kDa一致，并且目的蛋白位于大腸埃希菌裂解液上清中，說明RopA融合蛋白以可溶型表達。IPTG誘導1 h及2 h后，目的蛋白表達不明顯，誘導3 h可見明顯的蛋白條帶，且誘導4 h的蛋白量明顯多于3 h，證明本研究成功誘導RopA可溶型蛋白的表達(圖3)。

圖2 BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切重組克隆質(zhì)粒與pProEX Hta表達載體Fig.2 Double enzyme restriction of recombinant cloning vector and pProEX Hta1:重組克隆質(zhì)粒;2:BamHⅠ和HindⅢ雙酶切重組克隆質(zhì)粒；3:DL10 000 DNA Marker;4:pProEX HTa表達載體;5:BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切表達載體pProEX HTa1:recombinant cloning vector;2:BamHⅠand HindⅢ double enzymed recombinant cloning vector；3:DL10 000 DNA Marker;4:pProEX HTa;5:BamHⅠand HindⅢ double enzymed pProEX HTa

圖3 RopA蛋白的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of RopA1:DL 10 000 DNA分子量標準;2:空白對照;3:IPTG誘導1 h;4:IPTG誘2 h;5:IPTG誘導3 h;6:IPTG誘導4 h1:DL 10 000 DNA Marker;2: Blank control;3:IPTG induced 1 h;4:IPTG induced 2 h;5:IPTG induced 3 h;6:IPTG induced 4 h

3 討 論

ropA編碼的激發(fā)因子是核糖體相關(guān)的高度保守的肽酰-脯氨酰-順反式異構(gòu)酶，通過核糖體蛋白L23結(jié)合于核糖體生成多肽的出口處，與新生多肽相互作用，避免其過早地錯誤折疊，為后續(xù)其他分子伴侶的輔助折疊奠定基礎(chǔ)。除此之外，激發(fā)因子可以保護蛋白多肽暴露的疏水末端避免形成有害的聚合物并且?guī)椭归_過早折疊的結(jié)構(gòu)使其再次進入生產(chǎn)性折疊途徑。激發(fā)因子通過其內(nèi)表面的四個疏水位點與底物多肽結(jié)合，這四個結(jié)合位點在自身結(jié)構(gòu)中表現(xiàn)出高度的流動性使其能與眾多底物結(jié)合，并且能夠在疏水結(jié)合位點的附近與底物形成氫鍵以增加親和性[8-9]。

不同細菌中激發(fā)因子盡管結(jié)構(gòu)相似，因細菌的所處環(huán)境不同功能略有差異[10]。在大腸埃希菌中激發(fā)因子與50S核糖體亞基緊密相關(guān)，結(jié)合從核糖體上釋放的新生多肽，并與DnaK協(xié)同作用幫助新生蛋白折疊[11]。在革蘭陽性致病菌生膿鏈球菌中，RopA蛋白與分泌型半胱氨酸蛋白酶SpeB的分泌和成熟密切相關(guān)[12]。

ropA基因是變形鏈球菌耐酸反應以及生物膜形成等重要毒力因素的主要調(diào)節(jié)基因。在低pH值條件下，ropA基因缺陷的變形鏈球菌對酸和氧化應激的耐受能力相對于親代菌株降低，同時，在以葡萄糖為糖源的培養(yǎng)基中，ropA基因缺失的變形鏈球菌形成生物膜的能力降低，僅為原來的80%甚至更低。通過蛋白印跡分析還發(fā)現(xiàn)，ropA基因缺陷菌株的葡糖基轉(zhuǎn)移酶明顯減少。ropA基因突變株的生長速率與野生株相比沒有明顯差別，但是在酸性介質(zhì)中，突變株的倍增時間長，提示耐酸能力的降低。并且在pH 2.8的培養(yǎng)液中孵育45 min后，突變株的存活率降低，親代菌株存活率是其45倍[13]。

氟化物的長期大量應用導致變形鏈球菌耐氟菌株的產(chǎn)生。變形鏈球菌耐氟菌株的產(chǎn)酸和耐酸能力均較高，提高了口腔菌斑的致齲能力。耐氟菌株耐酸性增強的原因在分子水平上尚有待進一步研究。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，變形鏈球菌耐氟菌株的comD、dnaK、ccpA等基因個別位點發(fā)生突變[14]。為了驗證變形鏈球菌耐氟菌株耐酸性增強是否與耐酸相關(guān)基因ropA堿基序列發(fā)生改變相關(guān)，本研究構(gòu)建了含ropA基因的重組克隆質(zhì)粒，測序并與GenBank中變形鏈球菌UA159的ropA基因序列對比，檢測結(jié)果顯示變形鏈球菌耐氟菌株ropA基因1 284個堿基均未發(fā)生突變。說明變形鏈球菌耐氟菌株產(chǎn)酸及耐酸性增強并不是由ropA基因堿基序列改變所致，可能由耐氟菌株與親代菌株在ropA轉(zhuǎn)錄、翻譯以及RopA蛋白結(jié)構(gòu)和功能等方面的差異性引起。

趙洪巖通過基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學非標記定量技術(shù)研究了變形鏈球菌UA159耐氟菌株和親代菌株的蛋白質(zhì)表達差異，結(jié)果顯示差異蛋白67種，其中包括激發(fā)因子[15]，說明激發(fā)因子RopA在變形鏈球菌耐氟菌株的產(chǎn)酸及耐酸能力增強中發(fā)揮作用。為深入研究其作用機制，本研究構(gòu)建了含ropA基因的重組表達質(zhì)粒，用IPTG成功誘導了RopA蛋白的可溶型表達，為進一步研究其結(jié)構(gòu)與功能奠定基礎(chǔ)。根據(jù)RopA在大腸埃希菌和生膿鏈球菌中促進蛋白折疊及活化的作用，推測RopA缺失導致耐酸能力的降低是由于新生蛋白的正確折疊能力降低。Lyon等用RopA缺陷株的細胞提取液進行蛋白電泳及考馬斯亮藍染色，發(fā)現(xiàn)33種蛋白的表達量發(fā)生改變，其中22種蛋白表達上調(diào)，11種表達下調(diào)[12]。這些蛋白的大部分功能未知，但是小部分上調(diào)的蛋白如DnaK、GroE，均為熱或酸刺激下產(chǎn)生的分子伴侶，在細菌應對口腔內(nèi)復雜多變的理化環(huán)境時發(fā)揮作用[16]。證明RopA缺陷株對低pH值等惡劣環(huán)境的耐受能力降低，從而導致DnaK和GroE等分子伴侶表達上調(diào)，以代償細菌應激能力的降低，但其具體作用機制有待進一步研究[17]。

本研究對比了變形鏈球菌耐氟菌株耐酸相關(guān)基因ropA的序列并與GenBank對比，未發(fā)現(xiàn)突變位點，說明耐氟菌株耐酸性增強不是由ropA堿基序列的改變導致，從基因水平上排除了一個耐氟菌株耐酸性增強的原因。并且成功表達了RopA蛋白，為進一步研究RopA蛋白的結(jié)構(gòu)和功能以及防齲制劑的研制奠定基礎(chǔ)[18]。

[1] Pandit S, Kim J E, Jung K H, et al. Effect of sodium fluoride on the virulence factors and composition ofStreptococcusmutans, biofilms[J].Archives of Oral Biology,2011,56(7):643-649.

[2] Van-Loveren C, Hoogenkamp M D, Ten-Cate J. Effects of different kinds of fluorides on enolase and ATPase activity of a fluoride-sensitive and fluoride-resistantStreptococcusmutansstrain[J].Caries Research,2008,42(6):429-434.

[3] Lau K A, Kral T A. Isolation and characterization of low-pH fluoride-resistant mutants ofStreptococcusmutans[J].Oral Microbiology & Immunology,1987,2(3):136-138.

[4] 盧春英,張志民,于浩,等.變形鏈球菌耐氟菌株的篩選及分子鑒定[J].吉林大學學報(醫(yī)學版),2014,40(2):437-440.

[5] Takahashi N,Nyvad B.The role of bacteria in the caries process:ecological perspectives[J].Journal of dental research,2011,90(3):294-303.

[6] Kilian T M, Beck-Sickinger A G. Recombinant expression and characterization of biologically active protein delta homolog 1[J].Protein Expression & Purification,2015,110:72-78.

[7] Einsfeldt K, Júnior J B S, Argondizzo A P C, et al. Cloning and expression of protease ClpP fromStreptococcuspneumoniae, inEscherichiacoli: Study of the influence of kanamycin and IPTG concentration on cell growth, recombinant protein production and plasmid stability[J]. Vaccine,2011,29(41):7136-7143.

[8] Gamerdinger M, Deuerling E. Trigger Factor Flexibility[J]. Science,2014,344(344):590-591.

[9] Tomohide Saio, Xiao Guan, Paolo Rossi, et al. Structural Basis for Protein anti-Aggregation Activity of the Trigger Factor Chaperone[J].Science,2014,344(6184):1250494.

[10] Godin-Roulling A, Schmidpeter P A M, Schmid F X, et al. Functional adaptations of the bacterial chaperone trigger factor to extreme environmental temperatures[J].Environmental Microbiology,2015,17(7):2407-2420.

[11] Welin-Neilands J, Svensater G. Acid tolerance of biofilm cells ofStreptococcusmutans[J].Applied and environmental microbiology,2007,73(17):5633-5638.

[12] Lyon W R, Caparon M G. Trigger Factor-Mediated Prolyl Isomerization Influences Maturation of theStreptococcuspyogenesCysteine Protease[J]. Journal of Bacteriology,2003,185(12):3661-3667.

[13] Wen Z T, Suntharaligham P, Cvitkovitch D G, et al. Trigger Factor inStreptococcusmutansIs Involved in Stress Tolerance, Competence Development, and Biofilm Formation[J].Infection & Immunity,2005,73(1):219-225.

[14] 戴瑩.變形鏈球菌耐氟菌株耐酸相關(guān)dnaK操縱子結(jié)構(gòu)基因突變的檢測[D].長春：吉林大學,2015.

[15] 趙洪巖.采用非標記定量技術(shù)對變形鏈球菌耐氟菌株的差異蛋白質(zhì)組學研究[D].長春：吉林大學,2011.

[16] Tomoyasu T, Tabata A, Imaki H, et al. Role ofStreptococcusintermediusDnaK chaperone system in stress tolerance and pathogenicity[J]. Cell stress & chaperones,2012,17(1):41-55.

[17] Typas A, Sourjik V. Bacterial protein networks: properties and functions[J]. Nature Reviews Microbiology, 2015, 13(9):559-572.

[18] Sun JH, Xu QA, Fan MW. A new strategy for the replacement therapy of dental caries[J]. Med Hypotheses,2009,73(6):1063-1064.

CloningandProteinExpressionofAcid-ResistanceGeneropAinFluoride-ResistanceStrainofStreptococcusmutans

CHAO Bo, ZHANG Hong, LI Wen-yue, SHAO Si-qi, ZHANG Zhi-min

(Dept.ofEndodontics,Schl.ofStomatol.,JilinUni.,Changchun130041)

Acid-resistance related generopA of fluoride-resistance strain ofStreptococcusmutanswas cloned and expressed taking template of complete genome of fluoride-resistance strain UA159 ofS.mutans, PCR amplifiedropA gene and linked with pMD-18T cloned vector to construct recombinant cloned plasmid, sequenced and characterized. The recombinant plasmid was digested with double enzymeBamH I andHind III, the recovered targeted gene fragments were linked with pProEX Hta expressed vector through viscose terminus to construct the expression plasmid and transformed intoE.coli′s receptive state cells DH5α, induced with IPTG, and detected the expression amount ofropA with SDS-PAGE. The results showed that the sequencing results ofropA gene base sequence of fluoride-resistant strain ofS.mutanswas completely accord with the parent strain UA159. The results of SDS-PAGE showed that IPTG successfully induced to express RopA protein, and as the induced time protracted the expressed amount of protein increased. Therefore, it was concluded that acid-resistant related generopA of fluoride-resistant strain ofS.mutansdid not mutated, suggested that the strengthening of acid-resistance of fluoride-resistant strain ofS.mutanswas resulted in the changes ofropA base sequence. The successful induction of RopA protein expression in this experiment had laid a foundation to study on the function of RopA protein that follow up.

Streptococcusmutans; fluoride-resistant strain; acid-resistance related generopA; cloning; protein expression

大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(2014B78315)

超博 女，碩士研究生。主要從事齲病病因?qū)W基礎(chǔ)及臨床研究。E-mail:1348310112@qq.com

* 通訊作者。男，教授，博士，博土生導師。主要從事齲病病因?qū)W、牙髓生物學和根管治療學方面的研究。E-mail:zhangzm1964@sina.com

2016-08-01；

2016-10-08

Q939.93

A

1005-7021(2017)04-0023-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2017.04.004

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