石 芳， 趙墨元, 2， 楊柳青， 侯國(guó)華， 葉 明*

(1.合肥工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；2.莫納什大學(xué) 醫(yī)藥、護(hù)理與健康科學(xué)系，澳大利亞 3168)

不同碳源和生長(zhǎng)因子條件下粒毛盤菌代謝產(chǎn)物初步研究

石 芳1， 趙墨元1, 2， 楊柳青1， 侯國(guó)華1， 葉 明1*

(1.合肥工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；2.莫納什大學(xué) 醫(yī)藥、護(hù)理與健康科學(xué)系，澳大利亞 3168)

采用GC-MS法對(duì)一種粒毛盤菌(Lachnumsp.)在不同碳源、生長(zhǎng)因子條件下發(fā)酵代謝產(chǎn)物的揮發(fā)性成分組成與差異進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，不同碳源和生長(zhǎng)因子條件下產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物不同，主要包括有機(jī)酸、胺類、烷烴類、酯類、醇類、吡咯等物質(zhì)。分別以20 g/L的葡萄糖、蔗糖、淀粉為碳源的發(fā)酵液中檢測(cè)到的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物為7、7、10種；添加1 mg/L 的VC、VB1、甘氨酸、色氨酸作為不同生長(zhǎng)因子的發(fā)酵液中檢測(cè)到的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物分別為6、7、7、12種。結(jié)果顯示粒毛盤菌YM406發(fā)酵代謝產(chǎn)物具有豐富的多樣性，并且在不同的培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物存在一定的差異。

粒毛盤菌；代謝產(chǎn)物；GC-MS；碳源；生長(zhǎng)因子

近年來(lái)，從微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了越來(lái)越多的活性物質(zhì)。微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，具有抗細(xì)菌、抗真菌、抗腫瘤、抗病毒等多種生物活性，是微生物藥物開發(fā)的源泉[1]。此外，微生物代謝產(chǎn)物也可作為菌種鑒定的依據(jù)[2]。從微生物中獲取新型骨架化合物，一般從兩方面進(jìn)行研究：一是增加微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的多樣性，二是尋找快速有效的高通量篩選策略，最大限度地獲取新的微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物[3]。目前，人們已經(jīng)從微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了2萬(wàn)多個(gè)具有生物活性的化合物[4]。然而在進(jìn)行微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物研究時(shí)，如何提高微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的多樣性是一個(gè)重要課題[5]。 微生物在常規(guī)培養(yǎng)條件下存在未表達(dá)的代謝途徑，以至于許多代謝產(chǎn)物不能產(chǎn)生。因此，運(yùn)用各種技術(shù)和方法激活這些沉默途徑，獲得結(jié)構(gòu)多樣的代謝產(chǎn)物已成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)[6]。研究表明同一微生物在不同培養(yǎng)條件下的代謝產(chǎn)物不同，如采用分段發(fā)酵的方法發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后期溫度不同，對(duì)乳酸菌繁殖和積累類細(xì)菌素有影響，不同的碳源和氮源的組合用量也能產(chǎn)生不同的結(jié)果[7]；利用GC-MS方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)不同培養(yǎng)和工藝條件下枯草芽胞桿菌的代謝產(chǎn)物不同[8]；溫度、時(shí)間、初始pH、接種量以及油脂添加量等不同發(fā)酵條件對(duì)發(fā)酵代謝產(chǎn)物中共軛亞油酸產(chǎn)量的影響也不同[9]，不同溫度和酸度條件對(duì)鏈霉菌屬微生物的生長(zhǎng)及代謝產(chǎn)物的影響不同[10]。而不同菌株在同一培養(yǎng)條件下的代謝產(chǎn)物也不同，如基因型不同的銅綠假單胞菌的菌株揮發(fā)性代謝產(chǎn)物是不同的[11]。 粒毛盤菌屬(Lachnum)是一類腐生性真菌，個(gè)體較小，分布廣泛，多生于腐朽的樹木、葉莖或根部等處。長(zhǎng)期以來(lái)，各國(guó)學(xué)者在粒毛盤菌多樣性研究方面做了大量工作[12-17]。有學(xué)者在20世紀(jì)90年代發(fā)現(xiàn)粒毛盤菌在深層發(fā)酵條件下能產(chǎn)生脂酮類、異香豆素類等抗菌物質(zhì)[18-19]。近幾年來(lái)，本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)一些粒毛盤菌菌株在深層發(fā)酵條件下產(chǎn)生大量多糖、色素及多酚等活性物質(zhì)，其多糖具有抗氧化[20]、抗衰老[21]、降血糖[22]、降血脂[23]等活性，黑色素具有治療貧血[24]、抗氧化[25]、抗紫外輻射[26]、抗衰老[27]等活性，但在粒毛盤菌代謝產(chǎn)物多樣性研究方面則剛剛起步。本文研究了不同碳源和生長(zhǎng)因子對(duì)粒毛盤菌YM406次級(jí)代謝產(chǎn)物的影響，為揭示粒毛盤菌代謝產(chǎn)物多樣性、獲得更多活性物質(zhì)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 菌種來(lái)源 粒毛盤菌YM406子實(shí)體采集于安徽黃山，由合肥工業(yè)大學(xué)微生物資源與應(yīng)用研究所分離保存。

1.1.2 培養(yǎng)基(g/L) ①活化培養(yǎng)基：葡萄糖20，酵母膏5，蛋白胨5，瓊脂15，自然pH；②發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20，酵母膏5，蛋白胨5，自然pH。

1.1.3 主要試劑及儀器 蛋白胨、酵母膏、瓊脂等試劑購(gòu)自天津市博迪化工有限公司；SW-CJ-ICU型超凈工作臺(tái)購(gòu)自上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；TDL-50B型臺(tái)式離心機(jī)購(gòu)自上海安亭科學(xué)儀器廠；250D型數(shù)顯光照培養(yǎng)箱購(gòu)自金壇市正基儀器有限公司；GC-MS-2010島津購(gòu)自深圳市華得隆科技有限公司。

1.2方法

1.2.1 菌種活化 將斜面保藏的粒毛盤菌菌株接種于活化培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d，活化培養(yǎng)物作為搖瓶發(fā)酵的種子。

1.2.2 菌株發(fā)酵 菌株經(jīng)平板活化后，用打孔器接種菌齡一致、直徑為6 mm的菌塊于裝有150 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中培養(yǎng)10 d(發(fā)酵溫度25 ℃，搖床轉(zhuǎn)速160 r/min)。參考文獻(xiàn)[28]的實(shí)驗(yàn)方法選擇碳源與生長(zhǎng)因子濃度，分別以20 g/L的蔗糖和淀粉替換葡萄糖研究不同碳源對(duì)粒毛盤菌代謝產(chǎn)物的影響，并以不接種的不同碳源培養(yǎng)基作為空白對(duì)照；在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加1 mg/L的 VC、VB1、甘氨酸和色氨酸研究不同生長(zhǎng)因子對(duì)粒毛盤菌代謝產(chǎn)物的影響，并以不接種的不同生長(zhǎng)因子培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。

1.2.3 不同培養(yǎng)條件下的代謝產(chǎn)物檢測(cè) 分別取不同碳源、生長(zhǎng)因子培養(yǎng)條件下的粒毛盤菌發(fā)酵液進(jìn)行離心(6 000 r/min, 20 min)，取適量上清液裝入進(jìn)樣瓶中，進(jìn)行GC-MS分析。 ①氣相色譜條件: 色譜柱：HP-INNOWax(30 m×0.25 mm×0.25 mm)；載氣：氦氣；柱流量：1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；程序升溫：起始溫度60 ℃，保持1 min，5 ℃/min 升至240 ℃，保持5 min，再以20 ℃/min升至260 ℃，保持2 min；進(jìn)樣量：1 μL；進(jìn)樣方式：不分流。 ②質(zhì)譜條件: 電離方式：EI；電子能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；接口溫度：260 ℃；溶劑延遲：2 min；分析時(shí)間：2～45 min；模式：Scan；掃描范圍：50～ 550 m/z。

2 結(jié)果與分析

2.1不同碳源條件下的代謝產(chǎn)物分析

菌株YM406在不同碳源條件下的空白培養(yǎng)基、發(fā)酵后的培養(yǎng)液GC-MS分析色譜圖分別見圖1、圖2。色譜峰譜庫(kù)比對(duì)結(jié)果見表1、表2。由表1可知，以葡萄糖為碳源的空白培養(yǎng)基檢測(cè)出5種不同的化合物，其中醛類3種、有機(jī)酸2種。以蔗糖為碳源的空白培養(yǎng)基檢測(cè)出7種不同的化合物，其中醛類3種、有機(jī)酸2種、醇類1種、胺類1種。以淀粉為碳源的空白培養(yǎng)基中僅檢測(cè)出2種物質(zhì)，分別為醛和有機(jī)酸。由表2可知，以葡萄糖為碳源的發(fā)酵液中檢測(cè)出7種不同的化合物，其中有機(jī)酸2種，烷烴類、酯類、醚類、醇類、吲哚類各1種。以蔗糖為碳源的發(fā)酵液中檢測(cè)出7種不同的化合物，其中有機(jī)酸3種，烷烴、胺類、醇類、酮類各1種。以淀粉為碳源的發(fā)酵液中檢測(cè)出10種不同的化合物，其中含有胺類3種，烷烴、醇類各2種，有機(jī)酸、酯類、脲類各1種。

圖1 不同碳源條件下的空白培養(yǎng)基GC-MS圖譜 Fig.1 GC-MS spectra of blank medium with different carbon sourcesA: 葡萄糖; B: 蔗糖; C: 淀粉，圖2同A: glucose; B: sucrose; C: starch,Figure 2 with

圖2 不同碳源條件下的發(fā)酵液GC-MS圖譜 Fig.2 GC-MS spectra of fermentation broth with different carbon sources

序號(hào)化合物名稱保留時(shí)間/min 相似度/% 相對(duì)分子質(zhì)量相對(duì)含量/% 葡萄糖 蔗糖 淀粉 13?甲基丁醛2．20293860．910．18-2二甲基亞硝胺10．1749474-0．08-3糠醛11．90898960．100．06-4乙酸12．63197600．250．090．025丙酸14．2969074-0．06-62，4?葵二烯醛19．754961340．550．490．387膽固醇24．86187386-0．17-8順式?13?十八碳烯酸29．661772825．6110．00-

注：“-”表示未檢出，下表同

表2 不同碳源條件下的發(fā)酵液成分GC-MS分析

續(xù)表2

由此可見，以淀粉為碳源時(shí)，發(fā)酵液中檢測(cè)出的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物種類最多，為10種，其次是以葡萄糖和蔗糖為碳源的發(fā)酵液。這3組發(fā)酵液中，均檢出了甘油、三氯甲烷、3-甲基-4-氧代戊酸3種物質(zhì)，其中相對(duì)含量最高的是甘油。以葡萄糖為碳源時(shí)，發(fā)酵液中生成了其他兩個(gè)處理組中未檢測(cè)到的4種化合物，分別是甲酸甲酯(2.76%)、乙二醇一異丁醚(10.95%)、乙酸(6.67%)和吲哚(2.75%)。以蔗糖為碳源時(shí)，發(fā)酵液中生成了其他發(fā)酵液中未檢測(cè)到的2種化合物分別為2, 2-二甲基-1-丙醇乙酸(18.17%)和六氫吡咯并[1,2-a] 吡嗪-1,4-二酮(4.76%)。以淀粉為碳源時(shí)，發(fā)酵液中生成了其他發(fā)酵液中未檢測(cè)到的6種化合物，分別為尿素(2.01%)、吡咯(1.90%)、1-硝基丁烷(0.89%)、1, 3-丙二醇(8.70%)、乙酸、 [3-羥基-4-(1-丙酰)苯基] 酯(8.78%)和吡咯-2-甲酰胺(1.09%)。

2.2不同生長(zhǎng)因子條件下的代謝產(chǎn)物分析

菌株YM406在不同生長(zhǎng)因子條件下的空白培養(yǎng)基、發(fā)酵液的GC-MS分析色譜圖分別見圖3、圖4。對(duì)應(yīng)色譜峰的化合物和相對(duì)含量見表3、表4。

圖3 添加不同生長(zhǎng)因子的空白培養(yǎng)基GC-MS圖譜 Fig.3 GC-MS spectra of blank medium with different growth factorsA: VC; B: VB1; C: 甘氨酸; D: 色氨酸，圖4同A: VC; B: VB1; C: Glycine; D: TryptopHan,Figure 4 with

圖4 添加不同生長(zhǎng)因子的發(fā)酵液GC-MS圖譜 Fig.4 GC-MS spectra of fermentation with different growth factors

由表3可知，添加VC為生長(zhǎng)因子的空白培養(yǎng)基中檢測(cè)出4種不同的化合物，其中有機(jī)酸2種、醛類1種、糖類衍生物1種。添加VB1為生長(zhǎng)因子的空白培養(yǎng)基中檢測(cè)出7種不同的化合物，其中醛類4種、有機(jī)酸2種、胺類1種。添加甘氨酸為生長(zhǎng)因子的空白培養(yǎng)基中檢測(cè)出4種物質(zhì)，分別為有機(jī)酸2種、烷烴和酚類各一種。添加色氨酸為生長(zhǎng)因子的空白培養(yǎng)基中檢測(cè)出6種物質(zhì)，分別為醛類3種、有機(jī)酸2種、烷烴1種。由表4可知，添加VC的發(fā)酵液中檢測(cè)出6種不同的化合物，有機(jī)酸2種，胺類、酮類、醇類、吲哚類各1種。添加VB1的發(fā)酵液中檢測(cè)出7種化合物，有機(jī)酸、醇類各2種，肟類、胺類、無(wú)機(jī)酸各1種。添加甘氨酸的發(fā)酵液中檢測(cè)出7種不同的化合物，烷烴類、酯類、有機(jī)酸類、胺類、酚類、醇類、吡咯類各1種。添加色氨酸的發(fā)酵液中檢測(cè)出12種物質(zhì)，酯類2種，醇類2種，酮類2種，胺類、有機(jī)酸、醚類、胍類、烷烴類、吡啶類各1種。

由表4可見，添加色氨酸為生長(zhǎng)因子時(shí)，發(fā)酵液中揮發(fā)性代謝產(chǎn)物種類最多，為12種，其次是添加甘氨酸和VB1的發(fā)酵液。這4組發(fā)酵液中，均含有2, 2-二甲基-1-丙醇乙酸和甘油2種物質(zhì)，且VC組中2, 2-二甲基-1-丙醇乙酸相對(duì)含量最高，為26.35%。4組相對(duì)含量最高的均為甘油，VB1組的甘油相對(duì)含量高達(dá)67.12%。此外，各組中產(chǎn)生了一些其他組沒有的化合物，如添加VC的發(fā)酵液中產(chǎn)生了2-吡咯烷酮(1.74%)、吲哚(4.55%)；添加VB1的發(fā)酵液中產(chǎn)生了乙酸(6.53%)、甲氧基-苯基肟(2.00%)、磷酸(1.83%)、1-戊醇, 2,2-二甲基(1.36%)；添加甘氨酸的發(fā)酵液中產(chǎn)生了八甲基環(huán)四硅氧烷(1.42%)、苯酚(1.05%)、六氫吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮(30.24%)；添加色氨酸的發(fā)酵液中產(chǎn)生了二甲基亞硝胺(0.51%)、乙二醇丁醚(0.88%)、胍(1.13%)、苯甲醇(4.89%)、脫氫甲瓦龍酸內(nèi)酯(1.02%)、4, 4-二甲基庚烷(1.34%)、3-吡啶, 4-氨基-2-乙基-6-甲基(2.70%)、3,5,7,8-四氫化-4,6-哌啶二酮(2.90%)、脫氧精胍菌素(1.5%)。

表3 不同生長(zhǎng)因子條件下的空白培養(yǎng)基成分GC-MS分析

表4 不同生長(zhǎng)因子條件下的空白培養(yǎng)基成分GC-MS分析

續(xù)表4

3 討 論

微生物能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、活性多樣的次級(jí)代謝產(chǎn)物，是天然產(chǎn)物的重要來(lái)源之一，且不同的產(chǎn)物往往是經(jīng)過(guò)不同的代謝途徑產(chǎn)生的[29]。例如，醛類物質(zhì)主要是通過(guò)不飽和脂肪酸的氧化、脂質(zhì)氫過(guò)氧化物和過(guò)氧化物的分解及氨基酸的降解[30]途徑形成的，酸類物質(zhì)主要由脂肪酶水解途徑，醇脫氫酶和醛脫氫酶轉(zhuǎn)化途徑和糖類物質(zhì)合成脂肪酸等代謝途徑形成，醇類化合物主要由糖酵解、脂肪酸經(jīng)脂肪氧化作用以及氨基酸分解作用形成[31]。

本研究采用GC-MS分析方法檢測(cè)了不同碳源和生長(zhǎng)因子條件下粒毛盤菌產(chǎn)生的揮發(fā)性次級(jí)代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)不同碳源條件下，粒毛盤菌YM406發(fā)酵液中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物種類與含量具有一定差異。以葡萄糖為碳源時(shí)，發(fā)酵液主要產(chǎn)生醇類(41.70%)、酸類(17.01%)、烷烴類(10.23%)和醚類(10.95%)化合物；以蔗糖為碳源時(shí)，發(fā)酵液主要產(chǎn)生醇類(20.52%)、酸類(29.00%)和烷烴類(9.46%)化合物；以淀粉為碳源時(shí)，發(fā)酵液主要產(chǎn)生醇類(50.52%)、酸類(11.09%)、胺類(11.16%)化合物，同時(shí)，其發(fā)酵液中檢測(cè)到的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物種類最多，為10種，且該組中醇類物質(zhì)相對(duì)含量最高，說(shuō)明以淀粉為碳源時(shí)利于粒毛盤菌產(chǎn)醇類物質(zhì)，而Loughlin Gethins等[32]發(fā)現(xiàn)葡萄糖、果糖和乳糖3種碳源對(duì)馬克斯克魯維酵母的雜醇產(chǎn)量無(wú)顯著影響，同時(shí)在3組發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)了一些有應(yīng)用價(jià)值的化合物，如甘油、三氯甲烷、甲酸甲酯，吡咯和尿素，六氫吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮等。甘油和尿素是重要的化工原料，在醫(yī)學(xué)、工業(yè)和商業(yè)領(lǐng)域等諸多方面具有廣泛的應(yīng)用[33]；甲酸甲酯是極具應(yīng)用價(jià)值的化學(xué)品和油品添加劑[34]；三氯甲烷和吡咯衍生物是重要的有機(jī)合成原料。

不同生長(zhǎng)因子條件下的粒毛盤菌YM406發(fā)酵液中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物種類與含量也具有一定差異。添加VC為生長(zhǎng)因子的發(fā)酵液主要產(chǎn)生醇類(48.85%)和酸類(26.35%)化合物；添加VB1為生長(zhǎng)因子的發(fā)酵液主要產(chǎn)生醇類(67.12%)和酸類(11.76%)化合物；添加甘氨酸為生長(zhǎng)因子的發(fā)酵液主要產(chǎn)生醇類(44.28%)和酮類(30.24%)化合物；添加色氨酸為生長(zhǎng)因子的發(fā)酵液主要產(chǎn)生醇類(62.78%)和酸類(15.39%)化合物，同時(shí)，其發(fā)酵液中檢測(cè)到的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物種類最多，為12種。由此可見，添加VB1為生長(zhǎng)因子的發(fā)酵液產(chǎn)生的醇類物質(zhì)最多。在4組發(fā)酵液中檢測(cè)出乙酰胺、胍、八甲基環(huán)四硅氧烷、乙二醇丁醚、苯甲醇、脫氫甲瓦龍酸內(nèi)酯和脫氧精胍菌素等具有應(yīng)用價(jià)值的化合物。其中乙酰胺是許多有機(jī)物和無(wú)機(jī)物的優(yōu)良溶劑，廣泛用于各種工業(yè)產(chǎn)品中；八甲基環(huán)四硅氧烷是廣泛應(yīng)用于有機(jī)硅行業(yè)的化合物；胍、乙二醇丁醚和苯甲醇均廣泛用于工業(yè)化學(xué)品生產(chǎn)中。脫氧精胍菌素是一種新型免疫抑制劑，可以有效地阻止移植器官排異，逆轉(zhuǎn)急性排異反應(yīng)，且副反應(yīng)少，毒性低[35]，應(yīng)用前景非常廣闊。

本研究表明，通過(guò)改變粒毛盤菌培養(yǎng)基的成分，可增加其代謝產(chǎn)物的多樣性，為粒毛盤菌以及其他微生物代謝產(chǎn)物及其應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。然而本研究只是對(duì)1株粒毛盤菌代謝產(chǎn)物中揮發(fā)性成分進(jìn)行了初步分析，粒毛盤菌能產(chǎn)生多少種代謝產(chǎn)物，不同粒毛盤菌代謝產(chǎn)物種類如何，將有待采用更多的分析方法(如LC-MS、代謝組學(xué)等)以及更多的菌種(株)進(jìn)行比較分析。

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InitialStudyonMetabolitesofLachnumsp.withDifferentCarbonSources&GrowthFactors

SHI Fang1, ZHAO Mo-yuan1, 2, YANG Liu-qing1, HOU Guo-hua1, YE Ming1

(1.Schl.ofFoodSci. &Engin.,HefeiUni.ofTechnol.,Hefei230009; 2.FacultyofMed.,Nursing, &HealthSci.,MonashUni.,Australia3168)

Composition and difference of volatile components in fermentation metabolites ofLachnumYM406 with different carbon sources and growth factors was analyzed by GC-MS. The results showed that the metabolites are various with different carbon sources and growth factors, mainly including organic acids, amines, alkanes, esters, alcohols, pyrroles and other substances. There were respectively 7, 7, 10 kinds of volatile metabolites in fermentation broth with 20 g/L of glucose, sucrose, and starch as carbon source. Meanwhile, in fermentation broth added with 1mg/L VC, VB1, glycine, tryptophan as growth factors, there were 6, 7, 7, 12 kinds of volatile metabolites respectively. These results showed that the fermentation metabolites byLachnumYM406 under different culture conditions were fairly diverse, suggested that strain YM406 had important application value.

Lachnum; metabolites; GC-MS; carbon sources; growth factors

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31470146)

石芳 女，碩士研究生。研究方向?yàn)楣I(yè)微生物學(xué)。E-mail:1024312029@qq.com

* 通訊作者。男，教授，博士生導(dǎo)師。主要從事食品微生物、微生物源活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功效等研究。E-mail:yeming123@sina.com

2016-08-08；

2016-08-30

Q939.97；TS201.2

A

1005-7021(2017)04-0053-07

10.3969/j.issn.1005-7021.2017.04.009