周 亮， 謝麗玲， 朱 琳， 朱炎坤， 韓光耀， 畢 蕭， 彭 齊

(汕頭大學 理學院，廣東 汕頭 515063)

大黃醇提物對嗜水氣單胞菌抑菌活性及其機制

周 亮， 謝麗玲*， 朱 琳， 朱炎坤， 韓光耀， 畢 蕭， 彭 齊

(汕頭大學 理學院，廣東 汕頭 515063)

研究大黃醇提物對嗜水氣單胞菌的抑菌活性及機制。主要采用牛津杯法和液體倍比稀釋法；通過掃描電鏡、SDS-PAGE、二維電泳及串聯質譜等方法探討大黃醇提物對嗜水氣單胞菌的抑菌機制。結果顯示，大黃醇提取物對嗜水氣單胞菌有明顯的抑制效果，抑菌圈為(24.5±0.2) mm，MIC和MBC均為3.91 mg/mL；在藥物作用下，菌體表面變粗糙，細胞膜受損并出現破裂；在經藥物處理4 h后，細菌蛋白含量明顯下降(P<0.05)，2-DE電泳發(fā)現3個差異性蛋白。結果表明，大黃醇提物對嗜水氣單胞菌的抑制作用機制是破壞其細胞膜結構及影響特定蛋白的表達。

大黃；嗜水氣單胞菌；抑菌活性；機制

自然界中廣泛存在的嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila) 對魚類、兩棲類、爬行類、鳥類和哺乳類等動物具有很強的感染作用,在臨床上表現為急性出血性敗血癥的主要特征[1-3]。近年來，人們大量使用化學藥物如消毒劑和抗生素來防治嗜水氣單胞菌對水產動物的危害，導致藥物殘留、破壞動物免疫力以及體內微平衡等毒副作用，既危及水產動物的健康，又危害人類的健康。因此尋找綠色有效抑菌物質越來越引起人們關注[4-9]。 大黃隸屬蓼科植物，也稱錦紋、黃良，別名將軍、生軍、馬蹄黃，主要活性成分包括大黃素、大黃酸、大黃酚、蘆薈大黃素和土大黃素等，是一類蒽醌衍生物，還有多種有機化合物和無機物。大量研究表明大黃對幽門螺旋桿菌、厭氧菌、真菌有明顯抗菌作用，是廣譜的抗菌中藥。中藥具有毒副作用小、取材方便、不易產生耐藥性等優(yōu)點，因此采用中藥防治疾病，對發(fā)展水產動物無公害養(yǎng)殖，開發(fā)綠色抗菌藥物有著十分重要的意義[10-12]。本文研究了大黃對致病性嗜水氣單胞菌的抑菌活性及機制，為開發(fā)低毒高效、用于水產養(yǎng)殖的綠色抗菌新藥提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 供試菌株 嗜水氣單胞菌(A.hydropila)XX-25，南京農業(yè)大學劉永杰教授惠贈，本實驗室保存。

1.1.2 LB培養(yǎng)基(質量分數，%) 酵母粉0.5，蛋白胨1，氯化鈉1。

1.1.3 試劑 甲叉雙丙烯酰胺、丙烯酰胺、尿素、CHAPS、DTT、十二烷基硫酸鈉、三羥甲基氨基甲烷、溴酚藍、Bio-Lyte、考馬斯亮藍R-250等購自上海sangon生物工程有限公司，甲醇、甘油、無水乙醇、正丁醇、濃鹽酸、冰乙酸等購自汕頭西隴化工有限公司。

1.1.4 儀器與設備 TDL-5-A型低速大容量離心機(上海安亭科學儀器廠)；UVmini-1240紫外可見分光光度計(島津國際貿易(上海)有限公司)；SPX-250B型生化培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)用光學儀器廠)；JSM-6360LA掃描電鏡(日本電子)；等電聚焦電泳儀(上海普迪生物技術有限公司)。

1.2方法

1.2.1 大黃醇提物的制備 大黃烘干12 h后進行粉碎，精確稱取大黃粉末5.0 g，用50 mL 70%乙醇在圓底燒瓶中80 ℃回流提取2次，每次1 h，合并提取液，旋轉蒸發(fā)儀濃縮至濃度為0.5 g/mL，用0.22 μm水系濾膜過濾除菌后置于4 ℃冰箱保存。

1.2.2 大黃醇提物對嗜水氣單胞菌敏感性試驗 ①牛津杯法[13]：取對數期約107cfu/mL的細菌菌液100 μL稀釋，均勻涂布平板，牛津杯中加入大黃醇提物200 μL，陰性對照為無菌水，陽性對照為20 μg/mL氨芐青霉素。37 ℃培養(yǎng)16 h后觀察，測定抑菌圈大小。②最低抑菌濃度(MIC)測定[14-17]：采用液體倍比稀釋法測定中藥粗提液的最低抑菌濃度，陰性對照加入等量的無菌水，不渾濁的最低藥物濃度為 MIC 值。③最低殺菌濃度(MBC)測定：根據MIC的結果，將培養(yǎng)液劃線于LB培養(yǎng)基上。平皿內無細菌生長的藥物濃度為MBC值。

1.2.3 抑菌機制的研究 ①菌體形態(tài)觀察[18-21]：將培養(yǎng)至對數期的嗜水氣單胞菌按2%接種量接種到3.91 mg/mL(MIC)提取液的培養(yǎng)液中，以不加藥液為對照。37 ℃搖床培養(yǎng)4、6、8 h后分別取樣，離心去上清，2.5%的戊二醛4 ℃固定過夜后用0.2 mol/L的PBS(pH=7.4)洗3次，然后依次用30%、50%、60%、85%、90%、100%乙醇脫水1次，每次15 min，最后涂片，干燥，噴金，在掃描電鏡下觀察。②丙烯酰胺凝膠電泳和細胞可溶性蛋白含量的測定：將培養(yǎng)至對數期的嗜水氣單胞菌按2%接種量接種到3.91 mg/mL提取液的培養(yǎng)液中，以不加藥液為對照組。37 ℃搖床培養(yǎng)，收集4、6、8、10 h菌體后超聲破碎提取蛋白。選用10%分離膠、5%濃縮膠，用0.5%考馬斯亮藍 R-250進行染色，上樣量為25 μL?？扇苄缘鞍诐舛扔肂radford法測定，每組測定3次。③雙向電泳及質譜的分析[22-24]：第一向等電聚焦，將提取的樣品與水化液混合(1∶4)總體積250 μL，吸入到IPG膠條槽中，水化和聚焦在20 ℃自動進行。等電聚焦結束、膠條進行平衡完后，進行SDS-PAGE電泳。第二向SDS凝膠采用分離膠10%、濃縮膠5%的不連續(xù)垂直板電泳。電泳結束，取出凝膠，進行染色。用脫色液在搖床上進行脫色過夜，純水漂洗3次，凝膠圖像掃描儀獲取圖片，使用PDQuest軟件對圖片進行強度校正、背景消減、點檢測、點匹配等分析。將特異性點送到深圳市維納菲生物技術有限公司進行質譜檢測。

2 結果與分析

2.1敏感性試驗

大黃醇提物對嗜水氣單胞菌敏感性試驗結果顯示，用0.5 g/mL大黃醇提物對嗜水氣單胞菌的抑制活性明顯，結果見表1。大黃醇提物所形成的抑菌圈直徑為(24.5+0.2) mm，說明大黃醇提物對嗜水氣單胞菌有很好的抑制效果。MIC是評價抗菌藥物抑菌活性的指標，MBC則是指將細菌殺死的最低藥物濃度。結果顯示大黃醇提物對嗜水氣單胞菌的MIC和MBC的結果為3.91 mg/mL。

表1 嗜水氣單胞菌的抑菌圈

2.2掃描電鏡觀察結果

掃描電鏡鏡像觀察結果見圖1。大黃處理4 h后有部分菌體的形態(tài)發(fā)生明顯變化(箭頭所指)，部分細菌出現裂解(圖1a1)。對照組(圖1a)的菌體為長桿狀，表面光滑，形態(tài)飽滿，沒有細胞破損情況。然而處理6、8 h后，正常細胞逐漸變多，大部分細胞呈正常形態(tài)。說明大黃醇提物對嗜水氣單胞菌的細胞膜有一定影響，可能是破壞了細胞膜的完整性，細胞內滲透壓的改變，最終導致細菌破裂死亡。

圖1 嗜水氣單胞菌的掃描電鏡觀察結果Fig.1 SEM results of Aeromonas hydrophilaa,b,c：對照組4、6、8 h電鏡圖；a1、b1、c1處理組4、6、8 h電鏡圖a,b,c:Controls of different time in fourth,sixth,eighth；a1,b1,c1:treated with ethanol-extracts from Rhubarb of different time in fourth,sixth,eighth

2.3細菌蛋白測定

用SDS-PAGE檢測大黃醇提物對嗜水氣單胞菌蛋白的影響，結果顯示，處理組與對照組在分子量20 KD附近的條帶有明顯差異(圖2)，表明經大黃醇提物作用后，嗜水氣單胞菌蛋白的表達在4、6、8、10 h中受到不同程度影響，處理組的蛋白條帶變淡，這可能是某些蛋白在表達上受到了抑制。經Bradford法測其蛋白濃度，結果如圖3所示。在4、6、8、10 h時，處理組總蛋白含量有變化，且4 h蛋白含量變化顯著(P<0.05)，說明大黃醇提物對嗜水氣單胞菌的蛋白表達量也產生了影響。

圖2 可溶性蛋白的SDS-PAGEFig.2 Solubility proteins of SDS-PAGEM：Makre；a、b、c、d：對照組4、6、8、10 h的蛋白；1、2、3、4：處理組4、6、8、10 h的蛋白M: Maker；a，b，c，d:Controls of different time in fourth,sixth,eighth,tenth hour；1,2,3,4：treated with ethanol-extracts from Rhubarb of different time in fourth,sixth,eighth,tenth hour

2.42-DE及質譜結果

通過細菌蛋白雙向電泳后，用凝膠圖像掃描儀獲取圖像(圖4)，結果顯示，在分子量20 KD附近有3個明顯的蛋白差異點，取這3個點進行質譜分析，結果如表2所示。結合質譜結果發(fā)現圖4中點1是轉錄延長因子GreA(transcription elongation factor GreA)，細菌在mRNA合成時，轉錄延長因子與RNA聚合酶結合參與延長階段，為細菌的蛋白質合成做準備。大黃醇提物處理后，轉錄延長因子GreA的表達量出現極度下調，轉錄延長因子不夠，會使得RNA聚合酶無法在DNA上滑動，mRNA合成受阻，最后蛋白質不能正常合成，影響細菌生命活動。圖4中點2是超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)，超氧化物歧化酶是除去機體內氧自由基的重要酶，它的量不足，會導致細胞無法承受氧自由基的脅迫，影響細菌的正常生理功能。圖4中點3是烷基氫過氧化物還原酶亞基C(alkyl hydroperoxide reductase subunit C，Ahp C)，這也是細菌抵抗氧化脅迫的主要蛋白組成成分之一，一旦外界環(huán)境惡劣時，此蛋白為了適應外界的脅迫而過量表達。

圖3 細菌經大黃醇提物處理后蛋白釋放情況Fig.3 Leakage of protein from bacteria after treatment with ethanol extracts of Rhubard

圖4 嗜水氣單胞菌的2-DE圖譜Fig.4 The 2-DE of Aeromonas hydrophilaa、b分別代表4 h的對照組、4 h的處理組a:control;b:treated with ethanol-extracts from Rhubarb

編號結果BLAST結果Mr(Da)/pI分數覆蓋率/%對比的肽段1gi|491497280轉錄延長因子GreA17671/4．6530858%152gi|644513742超氧化物歧化酶21598/5．5549848%143gi|491479594烷基氫過氧化物還原酶亞基C20776/5．03737100%32

3 討 論

菌體細胞膜是具有高度選擇透過性膜，其通透性發(fā)生改變會影響細胞的正常生理功能[25-27]。研究表明，大黃醇提物處理嗜水氣單胞菌4 h后，通過電鏡觀察，發(fā)現細菌表面出現不規(guī)則的皺痕，部分細菌的膜已破裂，影響了細菌結構的穩(wěn)定和能量代謝，最終影響了細菌的正常生理功能。

雙向電泳技術是蛋白質組學研究的核心技術之一。它利用各種蛋白質等電點和分子量的不同來分離復雜蛋白質組分。本研究應用雙向電泳獲得了嗜水氣單胞菌的2-DE 圖譜，并選取了3個高豐度且差異性明顯的蛋白點進行質譜分析。該3個蛋白點分別為轉錄延長因子GreA、超氧化物歧化酶、烷基氫過氧化物還原酶亞基C。大量文獻表明，這3個蛋白對細菌的正常生理及其結構極為重要。如Kun等[28]認為伸長GreA是細菌RNA聚合酶不可或缺的復雜因子之一，它在轉錄延伸中扮演多個角色。石磊等[29]認為超氧化物歧化酶廣泛存在于微生物、動物和植物等多種生物體內，超氧化物歧化酶通過清除機體超氧自由基，達到保護機體免受超氧自由基傷害。V. Leclère等[30]也表明超氧化物歧化酶能抵抗外界氧壓力，保護細菌免受外部超氧化物的作用。Ahp C蛋白屬于巰基依賴2-Cys過氧還原家族蛋白，是細菌中抵抗氧化脅迫的主要蛋白之一，在幽門螺桿菌中是最主要的抗氧化蛋白，細菌Ahp C可自聚合形成大分子的聚合體，同時開始獲得分子活性[31]。研究大黃醇提物對嗜水氣單胞菌蛋白表達的結果顯示，藥物處理后，這些蛋白出現差異表達，而作為生命活動重要的這三種蛋白的非正常表達，使得細菌生命體的正常活動受到影響。 本研究發(fā)現大黃醇提物對嗜水氣單胞菌有很好的抑制活性，并且其抑菌機制主要破壞其細胞膜結構及影響特定蛋白的表達。

[1] GB/T 18652-2002,中華人民共和國國家標準《致病性嗜水氣單胞菌檢驗方法》[S].2002.

[2] 呂愛軍,李任年,余為一.嗜溫氣單胞菌研究進展[J].中國動物檢疫, 2000,(11):42-43.

[4] 李國旺,苗志國,趙恒章.大黃的體外抑菌實驗[J].光譜實驗室,2011,28(1)：66-68.

[5] Singh V,Chaudhary DK,Mani I,et al.Development of diagnostic and vaccine markers through cloning,expression,and regulation of putative virulence-protein-encoding genes of Aeromonas hydrophi-la[J]. The Journal of Microbiology,2013,51(3): 275-282.

[6] Vaseeharan B,Thaya R.Medicinal plant derivatives as immunos-timulants: an alternative to chemotherapeutics and antibiotics in aquaculture[J]. Aquaculture international,2014,22(3): 1079-1091.

[7] Su HC,Ying GG,Tao R,et al. Occurrence of antibiotic resist-ance and characterization of resistance genes and integrons in En-terobacteriaceae isolated from integrated fish farms in south China[J]. Journal of environmental monitoring,2011,13(11):3223 -3229.

[8] 謝麗玲,彭齊,蔡鏈純,等.黃芩醇提物對副溶血性弧菌抑制機制的研究[J].生物技術通報,2015,31(8):159-165.

[9] 陳晴,謝鯤鵬,云寶儀,等.黃柏等中草藥對MRSA的抑菌作用及其對質粒的消除作用[J].微生物學雜志，2013,33(3):54-57.

[10] 馬建鳳,劉華鋼,朱丹.中藥體外抑菌研究的方法學進展[J].藥物評價研究,2010,33(1):42-45.

[11] 劉蓓蓓.大黃中有效成分的提取、分離測定及其抗突變作用[J].中國醫(yī)藥指南,2013,11(6):63-65.

[12] 李淑娟,董曉華,武海霞,等.大黃及其有效成分藥理作用研究進展[J].醫(yī)學綜述,2005,11(1)：76-78

[13] 劉健,王海雁,趙淑江.牛津杯法測定五倍子對大黃魚病原弧菌的體外抑菌活力[J].海洋科學,2009,33(11):44-47.

[14] 張靜袆,周曾芬,張喻.大蒜油抑制幽門螺桿菌體外實驗研究[J].臨床消化病雜志,2006,18(2):108-109.

[15] 林燕文.2種蓼科植物體外抑菌試驗研究[J].微生物學雜志，2011,31(3):102-105.

[16] Feng He, Ying Yang , Guang Yang,et al.Studies on antibacterial activity and antibacterial mechanism of a novel polysaccharide fromStreptomycesvirginiaH03[J].Food Control ,2010,21(9):1257-1263

[17] Yi Zhao, Mingshun Chen, Zhengang Zhao,et al.The antibiotic activity and mechanisms of sugarcane (SaccharumofficinarumL.) bagasse extract against food-borne pathogens[J].Food Control ,2015,(185):112-118.

[18] Rinki Dandapat,Bhabani Sankar Jena,Pradeep Singh Negi. Antimutagenic and antibacterial activities ofPeltophorumferrugineumflower extracts[J]. Asian Pacific Journal of Tropical Disease,2012,2(12): S778-S782.

[19] Sangetha,S Zuraini Z, Suryani S,et al.In situ TEM and SEM studies on the antimicrobial activity and prevention of Candida albicans biofilm by Cassia spectabilis extract[J].Micron,2009,40(4):439-443.

[20] Ann-Li Yong, Keng-Fei Ooh, Hean-Chooi Ong,et al.Investigation of antibacterial mechanism and identification of bacterial protein targets mediated by antibacterial medicinal plant extracts[J].Food Control ,2015,186:32-36.

[21] Lianci Peng, Shuai Kang, Zhongqiong Yin,et al. Antibacterial activity and mechanism of berberine againstStreptococcusagalactiae[J].Int J Clin Exp Pathol ,2015,8(5):5217-5223.

[22] 張麗軍.2DE中IPG膠條轉移到SDS-PAGE中的技術改進[J].生命科學研究,2004,8(3):225-230.

[23] Luche S,Santoni V,abilloud T. Evaluation of nonionic and zwitteri-onic detergents as membrane protein solubilizers in two-dimensional electrophoresis[J].Proteomics, 2003, 3(3):249- 253.

[24] O′ Farrell P H. High resolution two-dimensional gel electrophoresis of proteins[J]. Journal of Biological Chemistry,1975(10),250:4007-4021.

[25] M T馬迪根,J M馬丁克.微生物學(第11版)[M].北京:科學出版社,2009:95.

[26] 王倩,謝明杰.木犀草素對金黃色葡萄球菌的抑菌活性及其機制[J].微生物學報,2010,50(9):1180-1184.

[27] 錢麗紅,陶妍,謝晶.茶多酚對金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的抑菌機理[J].微生物學報,2010,37(11): 1628-1633.

[28] Kun Li, Tianyi Jiang, Bo Yu, et al.Transcription Elongation Factor GreA Has Functional Chaperone Activity[J].plos One,2012,7(12):e47521.

[29] 石磊,楊秀艷,趙麗華.超氧化物歧化酶在微生物中的含量及分布情況[J].齊齊哈爾醫(yī)學院學報,2005,26(7):794-796.

[30] V. Leclère, M. Bèchet,R. Blondeau.Functional significance of a periplasmic Mn-superoxide dismutase fromAeromonashydrophila[J].Journal of Applied Microbiology,2004, 96(4):828-833.

[31] Chuang MH,Wu MS,LoWL,et al.The antioxidant protein alkyl hydroperoxide reductase ofHelicobacterpyloriswitches from a peroxide reductase to a molecular chaperone function[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2006,103(8):2552-2557.

TheAntibacterialActivityandMechanismsofEthanol-ExtractsofRhubarb(Rheumofficinale)againstAeromonashydrophila

ZHOU Liang, XIE Li-ling, ZHU Lin, ZHU Yan-kun, HAN Guang-yao, BI Xiao, PENG Qi

(Coll.ofSci.,ShantouUni.,Shantou515063)

Antibacterial activity and mechanisms of ethanol-extracts of rhubarb (Rheumofficinale) (EER) againstAeromonashydrophilawas studied mainly using Oxford cup and liquid double dilution methods; the antibacterial mechanism of EER was investigated by SEM, SDS-PAGE analysis, two-dimensional electrophoresis and tandem mass spectrometry. The results showed that ethanol-extracts of EER had obvious antibacterial effects, with an inhibition zone diameter of (24.5±0.2) mm. Both the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of EER againstA.hydrophilawere 3.91 mg/mL; Under the action of medicine, the bacterial surface became rough, the cell membrane damaged, and appeared rupture. The content of bacterial protein significantly declined 4 h after treated with medicine (P<0.05), and 2-DE electrophoresis had found three proteins of difference. Therefore, the inhibition mechanism of EER againstA.hydrophilawas to destroy the structure of cell membrane and affect the expression of specific proteins.

rhubarb (Rheumofficinale);Aeromonashydrophila; antibacterial activity; mechanism

汕頭大學校內科研基金項目(NFC14003)；廣東省自然科學基金項目(S2013010015919)；廣東省科技計劃項目(2015A020210095)

周亮 男，碩士研究生。研究方向為生物活性物質。E-mail：14lzhou@stu.edu.cn

* 通訊作者。女，碩士，副教授。研究方向為生物活性物質。E-mail：llxie@stu.edu.cn

2016-12-08；

2016-12-21

Q939.96

A

1005-7021(2017)04-0040-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2017.04.007

歡迎訂閱《微生物學雜志》