筱 禾 編譯

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非甾體油菜素內(nèi)酯類化合物NSBR1的開發(fā)

筱 禾 編譯

(上海市農(nóng)藥研究所，上海 200032)

油菜素內(nèi)酯(BL)(圖1中的1)是植物甾體激素，1979年其化學(xué)結(jié)構(gòu)被鑒定。BL及其相關(guān)化合物被歸類為油菜素甾醇(BRs)。BRs以低濃度廣泛存在于植物中，在植物生長發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。迄今為止，已經(jīng)鑒定了70多個天然BRs，一些BRs已經(jīng)被化學(xué)合成。BRs可引發(fā)植物廣泛的生理和形態(tài)反應(yīng)：莖伸長，葉彎曲和偏上性生長，誘導(dǎo)乙烯生物合成，活化質(zhì)子泵，核酸和蛋白質(zhì)的生物合成，碳水化合物同化和分配的調(diào)控以及光合作用的激活。由王志勇等首先鑒定出的BR受體被命名為BR敏感受體激酶1(BRI1)，通過X射線晶體結(jié)構(gòu)分析了BRI1的三維結(jié)構(gòu)。同期報道了BRs信號傳遞所需的體細(xì)胞胚發(fā)生受體激酶3(SERK3)，被稱為BRI1相關(guān)受體激酶1(BAK1)。幾年前，首次公布了擬南芥BRI1-BL-SERK1復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)。

圖1 農(nóng)用BL(1)及BRs的結(jié)構(gòu)

由于BRs可以保護植物免受高鹽、高溫、重金屬和干旱引起的各種非生物脅迫以及細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲和昆蟲引起的生物脅迫，仿BRs作用的化合物可用作農(nóng)用化學(xué)品。BRs增強作物對除草劑的耐受性及醫(yī)療中應(yīng)用的可能性也引人關(guān)注。20世紀(jì)后期的若干研究報告表明，BRs將在不久的將來投入實際運用。一些農(nóng)藥公司已經(jīng)致力于BR(1)、24-BL和(22,23)-28-homo BL等BRs的實際應(yīng)用研究，但其效果和穩(wěn)定性降低了。之后，選擇化合物2和3(TS303)等改良BL類似物用于實際應(yīng)用。含有TS303和二氫茉莉酸丙酯的TS303和TNZ303液劑可顯著提高作物產(chǎn)量。TNZ303噴霧處理水稻種子可提高產(chǎn)量。俄羅斯和波蘭對噴霧施用于小麥、馬鈴薯和甜菜進行了深入研究。但在過去20年間僅發(fā)表了幾篇關(guān)于BRs應(yīng)用的科研論文。BRs可用于植物保護和增產(chǎn)，然而，BRs的基本結(jié)構(gòu)(甾體骨架)可能影響B(tài)Rs在農(nóng)業(yè)中的實際應(yīng)用。

非甾體類昆蟲蛻皮激素激動劑的發(fā)現(xiàn)為新穎殺蟲劑的開發(fā)開辟了道路，因此甾體轉(zhuǎn)化為非甾體十分引人關(guān)注。大約20年前，合成了非甾體類BL的化合物，并通過水稻葉傾角測定法(rice lamina inclination assay，RLIA)測定了它們的活性。但這種活性不合情理，所以Takimoto合成了已報道化合物，發(fā)現(xiàn)其對經(jīng)BL生物合成抑制劑——brassinazole (Brz)處理的獨行菜無活性。早期利用計算機篩選搜索非甾體類BL化合物，并對篩選的化合物進行RLIA檢測。遺憾的是沒有發(fā)現(xiàn)激動劑化合物，但發(fā)現(xiàn)了3種拮抗劑(圖2中的4－6)。本研究旨在獲得一種新型非甾體BL激動劑。在本研究中，通過使用對接模擬和分子動力學(xué)(MD)等計算機技術(shù)使BL拮抗劑化合物合理轉(zhuǎn)化為激動劑。對設(shè)計合成的化合物進行生物測定以檢測BL活性。檢測了擬南芥中響應(yīng)BL處理的標(biāo)記基因的表達(dá)。

圖2 BL拮抗劑的結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 化學(xué)藥劑及其合成

化合物4和6?8(圖2和圖3)為實驗室自制樣品。根據(jù)圖4的合成路線，由哌嗪和取代苯甲酸化學(xué)合成了新穎的-苯甲?；?'-苯基哌嗪(NBNPP)類似物9－12。通過1H和13C NMR(BRUKER AVANCE 400)以及高分辨質(zhì)譜(HRMS)鑒定新合成的化合物結(jié)構(gòu)。京都大學(xué)合成化學(xué)與生物化學(xué)系Thermo Fisher Scientific EXACTIVE光譜儀記錄HRMS。使用Biotage SNAP Ultra進行色譜純化。

1.1.1 3,4-二氟--甲氧基--甲基苯甲酰胺

將3,4-二氟苯甲酸(2.5 g，15.8 mmol)和,-二甲基羥胺鹽酸鹽(2.3 g，22.8 mmol)溶于無水二氯甲烷(100 mL)中，然后加入DCC(3.2 g，16.1 mmol)。在室溫下攪拌5 h后，加入水(40 mL)和氯仿(40 mL)。過濾除去固體物質(zhì)。水層用氯仿(40 mL)萃取3次。合并氯仿層，用50 mL飽和NaCl(鹽水)洗滌。將氯仿層用無水Na2SO4干燥，蒸發(fā)得到淡黃色油狀物(5.82 g)。NMR(400 MHz, CDCl3)7.53(m, 1H), 7.51(m, 1H), 7.21(m, 1H), 3.55(s, 3H), 3.37(m, 2H).

圖3 N-苯甲?；?N′-苯基哌嗪類(NBNPPs)的結(jié)構(gòu)

圖4 NBNPPs類似物9?12的合成路線

1.1.2 1-(3,4-二氟苯基)丁-1-酮

在Ar氣保護下，將3,4-二氟--甲氧基--甲基苯甲酰胺(1.0 g，6.3 mmol)溶于10 mL無水THF中。向THF (2 mL)中滴加2 M PrMgBr，在室溫下攪拌2 h。加入飽和NH4Cl水溶液(10 mL)淬滅反應(yīng)并攪拌30 min。向混合物中加入水(40 mL)和氯仿(20 mL)。水層用氯仿(30 mL)萃取3次。合并的氯仿層用飽和NaCl(30 mL)洗滌，用無水Na2SO4干燥。過濾除去Na2SO4，蒸發(fā)得到粗的淡黃色油狀物。將該油狀物通過色譜法分離(0.87 g，79%產(chǎn)率)。NMR (400 MHz, CDCl3), 7.74 (m, 1H), 7.72 (m, 1H), 7.25 (m, 1H), 2.90 (t, 2H), 1.75 (sextet, 2H), 1.00 (t, 3H).

1.1.3 1-(3-氟-4-哌嗪-1-基)苯基丁-1-酮

將1-(3,4-二氟苯基)丁-1-酮(0.62 g，3.4 mmol)和哌嗪(1.0 g，11.6 mmol)溶于乙腈(2 mL)中，回流過夜。向反應(yīng)混合物中加入水(30 mL)和乙酸乙酯(20 mL)，水層用乙酸乙酯(20 mL)萃取3次。合并有機層，用飽和NaCl(30 mL)洗滌，用無水Na2SO4干燥。除去Na2SO4后，減壓濃縮濾液，得到淡黃色油狀物(0.64 g，收率76%)。NMR (400 MHz, CDCl3), 7.66 (dd, 1H), 7.61 (dd, 1H), 6.91 (t, 1H), 3.18 (m, 4H), 3.04 (m, 4H), 2.86 (t, 2H), 1.74 (sextet, 2H), 1.66 (bs, 2H), 0.99 (t, 3H).

1.1.4-(3,4-二羥基苯甲酰基)-'-(4-丁?；?2-氟苯基)吡嗪(9)

將3,4-二羥基苯甲酸(0.1 g，0.64 mmol)和1-(3,4-二氟苯基)丁-1-酮(0.1 g，0.40 mmol)溶于5 mL無水二氯甲烷中，隨后加入EDC[1-乙基-3-(3-二甲基氨基羰基)碳二亞胺鹽酸鹽；0.2 g，0.8 mmol]。在室溫下攪拌混合物2 h后，加入水(10 mL)和氯仿(40 mL)，水層用5 mL氯仿萃取3次。合并后氯仿層用飽和NaCl洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，殘余物用己烷/氯仿結(jié)晶，得到無色固體(14 mg，收率9%)，熔點147~148 oC。NMR (400 MHz, CDCl3), 7.71 (dd, 1H), 7.67 (dd, 1H), 7.04 (s, 1H), 6.91 (t, 1H), 3.85 (bs, 4H), 3.23 (bs, 4H), 2.88 (t, 2H), 1.76 (q, 2H), 1.72 (bs, 2H), 0.99 (t, 3H). HRMS/C21H23FN2O4[M-H]－：計算值：385.1564，實測值：385.1563。

可由相應(yīng)的苯甲酸類——苯甲酸、3,4-二甲基苯甲酸、3-乙酰氨基-4-甲氧基苯甲酸合成其他3種哌嗪衍生物(10－12)。

1.1.5-(4-乙酰氨基(acetlamino)-3-甲氧基苯甲酰基)-'-(4-丁?；?2-氟苯基)吡嗪(10)

熔點155~156 oC。NMR (400 MHz, CDCl3), 8.50 (d, 1H), 7.77 (s, 1H), 7.69 (dd, 1H), 7.64 (dd, 1H), 7.26 (m, 1H), 6.94 (m, 2H), 3.94 (s, 3H), 3.63-4.04 (s, 4H), 3.25 (s, 4H), 2.86 (t, 2H), 2.23 (s, 3H), 1.76 (q, 2H), 0.99 (t, 3H). HRMS/C24H28FN3O4[M+Na]+：計算值：464.1962，實測值：464.1950。

1.1.6-苯甲?；?'-(4-丁?；?2-氟苯基)吡嗪(11)

熔點95~96 oC。NMR (400 MHz, CDCl3), 7.67 (dd, 1H), 7.63 (dd, 1H), 7.47 (s, 5H), 6.92 (t, 1H), 3.96 (bs, 2H), 3.93 (bs, 2H), 3.24 (bs, 4H), 2.86 (t, 3H), 1.74 (q, 2H), 0.99 (t, 3H). HRMS/C21H23FN2O2[M+H]+：計算值：355.1822，實測值：355.1812。

1.1.7-(3,4-二甲基苯甲?；?'-(4-丁?；?2-氟苯基)吡嗪(12)

熔點138~139 oC。NMR (400 MHz, CDCl3), 7.67 (dd, 1H), 7.63 (dd, 1H), 7.22 (s, 1H), 7.16 (m, 2H), 6.92 (t, 3H), 3.92 (bs, 2H), 3.74 (bs, 2H), 3.25 (bs, 4H), 2.88 (t, 3H), 2.29 (s, 6H), 1.74 (q, 2H), 0.99 (t, 3H). HRMS/C23H27FN2O2[M+H]+：計算值：383.2135，實測值：383.2124。

1.2 生物測定

1.2.1 擬南芥下胚軸伸長測定

將擬南芥哥倫比亞生態(tài)型(Col-0)的種子浸入含有1% Triton X-100的70%乙醇溶液中30 min，然后移入99%乙醇中并攪拌1 min。用無菌濾紙吸除種子表面多余的乙醇。將滅菌的種子種植在含有0.9%瓊脂、1.5%蔗糖和測試化合物的1/2 MS培養(yǎng)基中，在4 ℃下于黑暗條件下生長。靜置2~3 d后，將種子在22 ℃光照下保持4 h(春化處理)。在22 ℃黑暗條件下生長7 d后，測定下胚軸的長度。運用Image J軟件測量下胚軸長度。將測試化合物溶解于DMSO溶液(低于1% DMSO)加入培養(yǎng)基中。將部分(50 mg)植物儲存于－80 ℃含有10 μL巰基乙醇的1 mL RLT緩沖液中。研磨冷凍的植物小塊材料，使用RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen)提取總RNA。使用PrimeScript(Takara)合成第一鏈cDNA，并將其用作定量RT-PCR模板，使用TaKaRa PrimeScript RT Reagent Kit進行RT-PCR。RT-PCR反應(yīng)溶液(25 μL)由SYBR Premix Ex Taq II(12.5 μL)、無菌水(7.3 μL)、正向和反向引物(0.1 μL)及cDNA(2.5 μL)組成。以ACT2作為內(nèi)對照?；蛱禺愋砸镆姳?。

表1 基因特異性引物

1.2.2 水稻葉傾角測定

選用矮稈水稻(cv. Tan-Ginbozu)秧苗進行稻葉傾角測定，用于測定類BL活性。以2%NaClO水溶液對Tan-ginbozu種子進行滅菌處理，在30 ℃光照條件下于滅菌水中浸泡3 d。將發(fā)芽的水稻種子移植到1%瓊脂培養(yǎng)基中，在30 ℃光照條件下培養(yǎng)3 d。在施用0.5 μL吲哚-3-乙酸(50 mM乙醇溶液)后，將試驗化合物的乙醇溶液施用于秧苗的第二葉。以1μL乙醇和BL溶液(1 μM)處理分別作為陰性和陽性對照。

1.3 MD模擬

之前已報道了MD方法和配體-受體復(fù)合物的結(jié)合自由能計算。使用AMBER 14 MD package和AMBER Tools 15進行MD模擬。AMBER force field 14SB應(yīng)用于配體分子的蛋白質(zhì)和gaff。通過MM-PBSA(Molecular Mechanics Poisson-Boltzmann Surface Area)計算游離能作為ΔGmmpbsa，使用SZYBKI(Ver.1.8.0.1；OpenEye：Santa Fe，USA)的Freeform模塊計算配體構(gòu)象異構(gòu)體熵。結(jié)合自由能ΔGbind校正為ΔGmmpbsa－TΔSligand。每個配體分子的構(gòu)象集由OMEGA2(Ver.2.5.1.4)生成。移除配體分子BL，由2種晶體結(jié)構(gòu)(PDB︰4LSX和PDB︰4LSA)構(gòu)建受體蛋白復(fù)合物模型。為構(gòu)建BRI1/SERK1復(fù)合體模型，4LSX鏈A(BRI1)被替換為4LSA，4LSX鏈C作為SERK1模型。使用OEDocking(Ver.3.2.0.2; OpenEye)的MAKE_RECEPTOR和FRED模塊進行對接模擬。

2 結(jié)果與討論

2.1 BL激動劑設(shè)計

用前期研究篩選出的14種化合物(包括化合物7、8)處理擬南芥進行生物測定?；衔?因數(shù)量不足無法測定?；衔?和6對擬南芥下胚軸伸長無影響。如圖4所示，具有一個NBNPP基本結(jié)構(gòu)的化合物7和8在100 μM時可顯著抑制下胚軸伸長，效果與1 μM的Brz處理相當(dāng)。其他篩選化合物在此項測定中無活性。

圖5 候選化合物(100 μM)和Brz (1 μM)對擬南芥下胚軸伸長的影響

BL和化合物8的結(jié)構(gòu)在前期計算機篩選中使用的藥效團模型的疊合情況如圖6所示。化合物8的A環(huán)F原子周圍的X區(qū)域相當(dāng)于BL和SERK1甾體A環(huán)的羥基間形成的氫鍵?；衔?的苯環(huán)和哌嗪環(huán)之間的羰基相當(dāng)于BL甾體B環(huán)(內(nèi)酯環(huán))上的羰基?？拷衔?的B環(huán)的另一個羰基氧相當(dāng)于BL側(cè)鏈的C-22上OH的氧。BL側(cè)鏈C-18和C-21周圍的Y區(qū)域具有疏水性相當(dāng)于化合物8的氟苯基部分。化合物8的正丙基部分末端周圍的其他區(qū)域等同于BL側(cè)鏈異丙基基團末端周圍的區(qū)域(Z)。

為了比較受體蛋白和配體分子間的相互作用，將BL和化合物8分別使用FRED(OpenEye)進行對接模擬，并使用MD/MM-PBSA計算結(jié)合自由能。如圖6所示，檢測到BL A環(huán)的OH和SERK1之間的氫鍵(HBs)(圖7的左圖)，而拮抗化合物8(圖7的中圖)沒有形成氫鍵(HB)。在BRI-BL-SERK1復(fù)合物(PDB：4LSX)的初始晶體結(jié)構(gòu)中，這2個OH基團對BL與SERK1間的相互作用很重要。因此，用OH替代化合物8的F原子，獲得化合物9，以模擬BL的A環(huán)部分，與受體對接。正如所預(yù)測的，在MD模擬之后，化合物9在OH和SERK1間形成HBs。SERK1的Phe和His殘基參與初始晶體結(jié)構(gòu)(4LSX)中BL的A環(huán)的2,3-(OH)2的HB形成，而MD后不同氨基酸殘基(His、Val、Thr)參與新構(gòu)建的BRI1/SERK1模型中的HB形成。在化合物9的嵌合模型中，參與HB形成3個氨基酸(Phe、Val、Thr)與BL略有不同，化合物8中沒有觀察到HBs。有趣的是，BRI1的Thr殘基在BL和化合物9的復(fù)合物中均可形成HB?？尚纬蒆Bs的這些氨基酸殘基中，Phe和His位于鄰近位置。表1為用MM-PBSA和Freeform(OpenEye)計算的候選化合物7-12的配體-受體結(jié)合ΔG值。盡管所有化合物的ΔG值均非負(fù)值，但化合物9的ΔG值是6個NBNPPs中最低的(表2)。

注：Y區(qū)域表示疏水特征，X區(qū)域表示靜電相互作用特征。箭頭表示受體/供體

圖7 BL及化合物8、9與BRI1/SERK1復(fù)合物嵌合模型(docking models)

表2 根據(jù)MM-PBSA計算的NBNPPs的配體-受體結(jié)合能*

注：*ΔG：BL為5.81kcal/mol；CS為5.30kcal/mol。

合成了具有各種羥烷基鏈的CS類似物(圖8的13-16)，進一步測定它們的活性以探討構(gòu)象對活性的影響。最近合成了具有各種烷基鏈的CS類似物(圖7的17-24)，進而測定它們的活性，探討構(gòu)效關(guān)系。在這2項研究中，均通過RLIA以pED50(ED50= 50%有效劑量)對活性進行定量評價。還計算了CS激動劑(圖9以及BL和CS的ΔG值，發(fā)現(xiàn)ΔG和pED50之間具有線性相關(guān)性。根據(jù)該計算條件，一些化合物的ΔG值為正，這在理論上似乎是不可接受的，但如圖9所示，這些計算值與體內(nèi)活性具有良好的相關(guān)性。如圖9所示，根據(jù)ΔG和pED50間的線性相關(guān)性預(yù)測化合物9(ΔG=2.18 kcal/mol)具有類甾體化合物活性，化合物7、8、10-12因高ΔG (7.30~17.14 kcal/mol)被認(rèn)為無活性。

圖8 具不同側(cè)鏈甾酮(castasterone)的類似物結(jié)構(gòu)

由于化合物9為BL激動劑，因此使用擬南芥下胚軸延伸法測定其生物活性。如圖10所示，Brz(1 μM)處理可抑制的擬南芥下胚軸伸長，后經(jīng)化合物9以及BL處理可顯著恢復(fù)。

2.2 擬南芥中的基因表達(dá)

在新合成的NBNPPs(9-12)中，化合物9可使經(jīng)Brz處理的擬南芥下胚軸顯著伸長。因此，評估了其對BR反應(yīng)基因表達(dá)的影響。對在經(jīng)或未經(jīng)化合物9處理的1/2 MS瓊脂固體培養(yǎng)基中生長的7 d齡野生型擬南芥植物進行定量實時PCR(qPCR)分析。在該測定中化合物9的應(yīng)用濃度為10 μM和30 μM，可顯著誘導(dǎo)擬南芥出現(xiàn)類BL表型。以100 nM的BL和3 μM的Brz作為對照，確定了化合物9對BR響應(yīng)標(biāo)記基因的作用。本研究選擇了下調(diào)BL的BL生物合成基因(D和)。因此，發(fā)現(xiàn)化合物9對這些基因的表達(dá)水平的下調(diào)呈劑量依賴關(guān)系，類似BL的作用(圖11)。這些結(jié)果表明，化合物9為BL激動劑，其通過常見轉(zhuǎn)錄元件(commontranscriptional module)激活激素反應(yīng)。其他化合物(10-12)對標(biāo)記基因表達(dá)沒有影響(數(shù)據(jù)未列出)。

圖9 油菜素內(nèi)酯ΔG和生物活性間(pED50)的線性相關(guān)性

注：數(shù)值為±SE的平均值(對照和Brz處理的柱形圖從左到右均依次DMSO、化合物9、BL)。*表示與野生型植物相比有顯著性差異

2.3 水稻葉傾角測定

由于化合物9在擬南芥中表現(xiàn)了激動劑效應(yīng)，進而對這些新合成的NBNPPs(9-12)在水稻上也進行了RLIA評估(圖12)。僅有化合物9在10 nmol時顯示了明顯的激動劑活性。進一步研究了化合物9的劑量效應(yīng)關(guān)系(圖13)。由劑量效應(yīng)曲線估算得出化合物9的ED50為0.79 nmol(pED50=9.1)。根據(jù)圖9中所示的ΔG和pEC50之間的關(guān)系，可合理預(yù)測化合物活性。

注：CPD和BR6ox2表達(dá)的柱形圖從左到右均依次為DMSO、10 μM化合物9、30 μM化合物9、BL、Brz；*表示與野生型植物差異顯著

注：*表示與對照(乙醇)有顯著差異(T檢驗，p<0.01)

注：橫坐標(biāo)為劑量對數(shù)標(biāo)度(mol)

雖然與BL (pED50=13.6)和CS(pED50=12.3)相比，化合物9 (pED50=9.1)的活性較弱，但是其活性為21-epi-CS (pED50=8.5) 和21-nor-CS (pED50=8.7)的2~3倍，與化合物17(pED50=9.2)相當(dāng)，也與C-17 位具有酰基側(cè)鏈的BL類似物(pED50=8.6~10.5)相當(dāng)。由于這種新的非甾體化合物9在生理和基因水平均表現(xiàn)出類BL活性，因此被稱為NSBR1。如圖9所示，根據(jù)MM-PBSA計算的結(jié)合能ΔG(2.13 kcal/mol)是合理的。目前正在研究對NBNPP的A和B環(huán)上的取代基進一步修飾以及用更適當(dāng)?shù)幕鶊F取代其哌嗪和苯環(huán)，以期提高活性。此結(jié)果表明用于計算蛻皮激素激動劑的結(jié)合自由能(ΔG)的MMPBSA分析也適用于其他配體-受體結(jié)合能計算。

3 結(jié) 論

為尋求BL的激動劑/拮抗劑，對自500萬種化合物中篩選得到的14種化合物進行了擬南芥試驗。研究發(fā)現(xiàn)有2種NBNPPs顯示了拮抗活性，1種成功轉(zhuǎn)化為激動劑NSBR1?？紤]到基于MD模擬的配體-受體結(jié)合能，適當(dāng)進行了從拮抗劑到激動劑的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化。NSBR1在擬南芥的基因表達(dá)和RLIA中也表現(xiàn)出激動劑活性。

10.16201/j.cnki.cn31-1827/tq.2017.05.05

TQ450

A

1009-6485(2017)05-0028-07

筱禾，女，工程師。Tel: 021-64387891-201。

2017-10-06。