景迎春，李擎瑜，劉 彬，鄭煜芳,3

(1.復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200438；2.復(fù)旦大學(xué) 發(fā)育生物學(xué)研究院，上海 200433； 3.復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院 生殖發(fā)育研究院，上海 200090)

HB-EGF可挽救ADAM17缺失導(dǎo)致的大腦皮層神經(jīng)前體細(xì)胞分化遷移異常

景迎春1,2，李擎瑜1，劉 彬1，鄭煜芳1,2,3

(1.復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200438；2.復(fù)旦大學(xué) 發(fā)育生物學(xué)研究院，上海 200433； 3.復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院 生殖發(fā)育研究院，上海 200090)

ADAM17金屬蛋白酶對多種生長因子的成熟和功能有重要作用．實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)ADAM17對于大腦皮層神經(jīng)前體細(xì)胞的遷移分化有重要作用，本研究進(jìn)一步探究ADAM17影響大腦皮層神經(jīng)前體細(xì)胞的遷移分化的分子機(jī)制．在小鼠胚胎E14.5天，采用IUE技術(shù)用針對性shRNA降低在大腦皮層中高表達(dá)的ADAM17底物(HB-EGF，L1-CAM，NRG1)的表達(dá)，或者在敲低ADAM17的同時共表達(dá)底物質(zhì)粒，在E18.5天取樣切片染色觀測大腦皮層神經(jīng)前體干細(xì)胞的遷移分化．結(jié)果顯示敲低HB-EGF表達(dá)的大腦皮層神經(jīng)前體細(xì)胞遷移分化異常表型與敲低ADAM17的表型相似；過表達(dá)HB-EGF胞外段成熟蛋白可以拯救敲低ADAM17的大腦皮層神經(jīng)前體細(xì)胞遷移受阻的現(xiàn)象．因此推論，HB-EGF是ADAM17調(diào)控大腦皮層神經(jīng)前體細(xì)胞的遷移分化過程中的一個主要底物．

ADAM17；HB-EGF；L1-CAM；NRG1；皮層神經(jīng)前體細(xì)胞；輻射狀遷移

哺乳動物的大腦皮層有精細(xì)的結(jié)構(gòu)并負(fù)責(zé)高級腦功能，成熟大腦皮層有六層腦皮層結(jié)構(gòu)，在發(fā)育過程中通過“inside out”的發(fā)育模式建立．神經(jīng)前體細(xì)胞(Neural Progenitor Cells,NPCs)經(jīng)不對稱分裂，依附放射性膠質(zhì)細(xì)胞(Radial Glia,RG)以輻射狀向外遷移，同時細(xì)胞形態(tài)也在發(fā)生變化，逐漸分化成為成熟的神經(jīng)細(xì)胞．越晚分裂的細(xì)胞遷移到越外側(cè)的皮層，這一過程被稱為“inside out”腦皮層發(fā)育過程．在這一過程中受到損傷會導(dǎo)致腦結(jié)構(gòu)異常以及神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病．

ADAM17(A Disintegrin And Metalloprotease 17)，又名TACE(Tumor factor-α Converting Enzyme)，是ADAMs家族I型跨膜蛋白，廣泛分布于人體內(nèi)，可以切割70多種位于細(xì)胞膜上的底物，包括Notch受體和EGFR通路中的配體或受體蛋白，細(xì)胞因子或細(xì)胞間黏附因子等[1]．現(xiàn)有對ADAM17在神經(jīng)系統(tǒng)中的研究較多集中在成年腦組織中．在成年哺乳動物腦組織中，ADAM17在大腦皮層、中腦海馬區(qū)、小腦皮層區(qū)域均有高表達(dá)，表達(dá)的細(xì)胞包括神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞等[2-4]．在成年大腦中的研究顯示，ADAM17可以與其他酶競爭切割淀粉樣蛋白前體(Amyloid Precursor Protein,APP)，從而抑制具有神經(jīng)毒性Aβ肽段的生成[5]．ADAM17在缺血等壓力刺激下被激活，促進(jìn)TNFα和IL-6等被切割，引起神經(jīng)炎癥反應(yīng)[6-7]．但是，人們對于ADAM17在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的作用了解的還很少．實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)在ADAM17對小鼠大腦皮層的神經(jīng)中間前體細(xì)胞(Neuronal Intermediate Progenitor Cells,iNPCs)的遷移和分化有重要作用[8-9]，但其作用的分子機(jī)制尚不清晰．

在眾多ADAM17的底物中，已有研究發(fā)現(xiàn)一些底物和大腦皮層發(fā)育有關(guān)，例如NOTCH受體，EGF家族蛋白和一些細(xì)胞黏附分子．但Notch1敲除的小鼠表型和ADAM10(ADAM家族中結(jié)構(gòu)類似ADAM17的成員)敲除的小鼠表型非常接近[10]，而與ADAM17敲除小鼠的表型不同[11-12]，因此通常認(rèn)為ADAM10是生理條件下主要負(fù)責(zé)切割NOTCH的金屬酶．除了NOTCH受體以外，ADAM17底物中的EGF家族蛋白HB-EGF(Heparin-Binding EGF-like Growth Factor)和NRG1(Neuregulin 1)也被報道和大腦皮層發(fā)育相關(guān)．HB-EGF在腦發(fā)育中高度富集于皮層神經(jīng)元中[13-14]，介導(dǎo)神經(jīng)嵴細(xì)胞從后腦遷移到外周，敲除HB-EGF會造成神經(jīng)嵴細(xì)胞遷移失敗[15]，在小鼠海馬區(qū)敲除HB-EGF會降低海馬齒狀回顆粒下區(qū)神經(jīng)元的生成[16]．NRG1可以促進(jìn)樹突的外伸、細(xì)胞增殖分化，防止細(xì)胞凋亡[17]．此外，細(xì)胞黏附因子CAM家族蛋白L1-CAM(L1 Cell Adhesion Molecule)可以調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞軸突的伸張和神經(jīng)細(xì)胞的遷移[18]．但以往對ADAM17通過切割HB-EGF、NRG1或L1-CAM進(jìn)而發(fā)揮作用的研究主要集中在心臟，免疫系統(tǒng)或腫瘤中[19-23]，其在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的機(jī)制還有待闡明．

已知在小鼠胚胎大腦皮層發(fā)育關(guān)鍵期(E14.5～E18.5)，ADAM17在中間區(qū)域(Intermediate Zone,IZ)有高表達(dá)[8-9]，而ADAM17的3種底物HB-EGF，NRG1，L1-CAM也在同一時期的相同位置有表達(dá)[24-27]．由此推測，ADAM17可能是通過切割這3種底物分子影響小鼠大腦皮層iNPCs遷移和分化．本研究主要通過子宮內(nèi)電轉(zhuǎn)的方法，探索了ADAM17對小鼠大腦皮層iNPCs的遷移和分化影響的可能的分子機(jī)制．結(jié)果顯示，HB-EGF是ADAM17下游的重要分子，參與調(diào)控小鼠大腦皮層iNPCs的遷移分化．

1 材料和方法

1.1菌株、細(xì)胞系和實驗動物

本課題中用于質(zhì)粒擴(kuò)增的菌株均為E.coliDH5α，購自碧云天公司．大鼠施旺細(xì)胞系RSC96購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫．本課題中使用的小鼠為野生型C57BL/6近交系，購買于上海斯萊克實驗動物中心．

1.2培養(yǎng)基

本課題中E.coliDH5α的培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基(氯化鈉1%，蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，pH7.4，固態(tài)培養(yǎng)基再加1.5%的瓊脂)，培養(yǎng)條件為37℃．RSC96細(xì)胞培養(yǎng)采用F12培養(yǎng)基(Gibco公司)加10%FBS(康寧公司)以及Plasmocin (InvivoGen公司)，培養(yǎng)條件為37℃，5% CO2．

1.3質(zhì)粒

小鼠ADAM17表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-ADAM17-HA(A17-HA)由Carl P.Blobel博士實驗室贈送．熒光質(zhì)粒pCAG-EYFP(EYFP)由復(fù)旦大學(xué)發(fā)育生物學(xué)研究所的陶無凡教授實驗室贈送．ADAM17的干擾質(zhì)粒A17-Ri、ADAM10的干擾質(zhì)粒A10-Ri、干擾對照質(zhì)粒Ri-NC以及HB-EGF、L1-CAM、NRG1的干擾質(zhì)粒HBEGF-Ri、L1-CAM-Ri、NRG1-Ri皆從上海吉瑪公司購買．HB-EGF質(zhì)粒通過RT-PCR擴(kuò)增獲得cDNA并構(gòu)建到pSeqB載體質(zhì)粒中．HB-EGF的胞外段表達(dá)質(zhì)粒HF150和全長表達(dá)質(zhì)粒HF208是通過PCR擴(kuò)增出pSeqB-HB-EGF質(zhì)粒上的HB-EGF片段，再酶切連接該片段到pCAG-IRES-EGFP質(zhì)粒的BglⅡ與XmaⅠ位點之間(HF150的PCR引物對序列為5’-AAATGATCAATGGAGACAGACACACT-3’和5’-AAA ACCGGTTTAATGGTGATGGTGATGATGCACTGGTAGAGTCA-3’；HF208的PCR引物對序列5’-AAAT GATCAATGGAGACAGACACACT-3’和5’-AAAACCGGTTTAATGGTGATGGTGATGATGGTGG GAGCTAGCCA-3’)．

1.4子宮內(nèi)電轉(zhuǎn)化

腹腔注射麻醉孕鼠(10μL/g體重，生理鹽水配置4mg/mL戊巴比妥鈉)，小鼠完全麻醉后，打開腹腔，小心取出子宮，在胎鼠腦室內(nèi)用微電極吸入1μL(約4μg)質(zhì)粒，用電轉(zhuǎn)儀的電極夾住胎鼠頭部，正負(fù)極分別位于左右腦兩邊，正極位于注射質(zhì)粒的一邊，然后用40V電轉(zhuǎn)，5次刺激，每次50ms，然后將子宮放回母鼠腹腔，并縫合傷口，恢復(fù)飼養(yǎng)；在E18時解剖取出電轉(zhuǎn)過的胚胎大腦，固定包埋，準(zhǔn)備做免疫組化檢測．

1.5小鼠大腦皮層免疫組化

將E14-18的孕鼠解剖，包埋胎鼠大腦，20μm連續(xù)冰凍矢狀切片，每片載玻片收集8個組織，干燥2h，用免疫組化筆沿組織畫圈，滴加PBS在載玻片上，室溫放置10min，傾去PBS，再滴加4% PFA，10min；PBS洗滌3次，每次1min，滴加0.05% TX100，室溫10min，5%血清(PBS配置)封閉2h，滴加一抗抗體，工作濃度1∶200，蓋上封口膜，置濕盒內(nèi)4℃過夜，PBS洗去一抗，滴加Cy3標(biāo)記的二抗，工作濃度1∶ 500,室溫避光2h，PBS洗去二抗，3次，每次1min，滴加DAPI，工作濃度1∶5000，室溫避光10min，PBS洗滌兩次，每次1min，甩干PBS，用抗熒光淬滅封片劑封片，注意不要產(chǎn)生氣泡，熒光顯微鏡下檢測．

1.6Westernblot

用Lipo3000(Life Technologies,L3000-015)轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒至RSC96細(xì)胞中(六孔板細(xì)胞每孔板轉(zhuǎn)染2μg質(zhì)粒)，轉(zhuǎn)染24h后，收集細(xì)胞去除細(xì)胞培養(yǎng)基；對于六孔板細(xì)胞，每孔細(xì)胞量加入100μL的RIPA(弱)裂解液，吹打混勻后，冰上孵育30min；4℃，12000g離心20min，取適量上清加入蛋白上樣緩沖液，混勻，100℃煮5min，放回冰上再進(jìn)行SDS-PAGE電泳，用對應(yīng)抗體檢測蛋白表達(dá)情況，本課題所用的β-actin抗體(A1978)購自Sigma公司，非特異性堿性磷酸酶抗體(ab133602)購自Abcam公司．

2 結(jié)果與分析

2.1降低HB-EGF表達(dá)對小鼠大腦皮層細(xì)胞遷移和發(fā)育的效果與降低ADAM17表達(dá)的效果相似

通過子宮內(nèi)電轉(zhuǎn)化的方法，在胎鼠E14.5天分別共轉(zhuǎn)單個底物的shRNA干擾質(zhì)粒和熒光質(zhì)粒，手術(shù)4d后，在E18.5天進(jìn)行解剖收集胚胎大腦并切片觀察．對照組中，約61%的綠色熒光標(biāo)記細(xì)胞遷移到了皮質(zhì)板區(qū)(Cortical Plate,CP)外側(cè)并呈現(xiàn)雙極細(xì)胞的形態(tài)(圖1(a)，圖2(a))．而降低ADAM17的表達(dá)后，只有約有26%帶有綠色熒光標(biāo)記的細(xì)胞遷移到了CP區(qū)內(nèi)側(cè)，而近50%帶有綠色熒光的細(xì)胞胞體停留在IZ區(qū)不再向外遷移；放大的圖中顯示遷移受阻的細(xì)胞有多極纖維狀突起(圖1(b)，圖2(a))．這與降低ADAM10的表達(dá)結(jié)果有明顯不同，降低ADAM10表達(dá)后，99%的細(xì)胞都滯留在IZ區(qū)或者腦室下區(qū)(Sub-Ventricular Zone,SVZ)區(qū)，且細(xì)胞呈現(xiàn)出球形，少突起的特征(圖1(c)，圖2(b))．

圖1 敲除特定基因后胎鼠大腦皮層細(xì)胞遷移情況Fig.1 The cell migration results in embryonic mice cortex after knocking down certain genes

在E14.5天胎鼠大腦中共轉(zhuǎn)EYFP質(zhì)粒和不同的shRNA質(zhì)粒(1∶6濃度比)，包括對照A17-Ri-NC和不同的knock-down質(zhì)粒：A17-Ri,A10-Ri,HB-EGF-Ri,L1-CAM-Ri,NRG1-Ri．手術(shù)恢復(fù)4d后，在E18.5天進(jìn)行解剖觀察，并用免疫組化Nestin(紅色)標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞和前體細(xì)胞，DAPI(藍(lán)色)標(biāo)記細(xì)胞核．切片厚度=20μm，標(biāo)尺=200μm．

降低HB-EGF的表達(dá)后，有約18%的細(xì)胞到達(dá)CP區(qū)內(nèi)側(cè)，約70%帶有綠色熒光的細(xì)胞胞體停留在IZ區(qū)不再向外遷移(圖1(d)，圖2(b))，但其leading process可以繼續(xù)向外側(cè)伸出到CP區(qū)(圖1(d))，這一遷移受阻的現(xiàn)象與降低ADAM17表達(dá)后的現(xiàn)象相似；更高倍數(shù)放大的結(jié)果中可以看到，這些遷移受阻的細(xì)胞多為Nestin陽性的多極細(xì)胞，且周圍的RG細(xì)胞纖維同樣呈現(xiàn)出較為細(xì)而卷曲的形態(tài)，這些細(xì)胞形態(tài)和分化的特性以及RG架構(gòu)的特性同樣是與降低ADAM17表達(dá)后十分類似的(圖1(b)，(d))．

降低L1-CAM的表達(dá)后，對母鼠和胎鼠的影響都很大，不僅母鼠死亡/流產(chǎn)率很高(66.7%，見表1)，且電轉(zhuǎn)化的胎鼠死亡率也很高(存活母鼠中的胎鼠死亡率為50%)，因此僅得到2只存活胎鼠的切片結(jié)果．這兩只胎鼠大腦皮層切片顯示，降低L1-CAM后，帶有綠色熒光的細(xì)胞遷移受阻(圖1(e))，96%的細(xì)胞停留在IZ區(qū)更為內(nèi)側(cè)與SVZ區(qū)交界的區(qū)域(圖2(b))．更高倍數(shù)的放大下可以看到，綠色熒光的強度較弱且細(xì)胞數(shù)較少，并且這些細(xì)胞的胞體都呈球形，缺少應(yīng)有的纖維狀突起，切片中綠色熒光細(xì)胞的周圍存在較多熒光小點，近似細(xì)胞碎片(圖1(e))．上述結(jié)果表明降低L1-CAM表達(dá)的細(xì)胞與降低ADAM17后的細(xì)胞狀態(tài)截然不同(圖1(b)，(f))，而與降低ADAM10表達(dá)后的表型更為接近(圖1(c)，(f))．

降低NRG1表達(dá)后，同樣產(chǎn)生了很高的胎鼠死亡率(存活母鼠中的胎鼠死亡率為66.7%)和母鼠死亡/流產(chǎn)率(66.7%，見表1)．在僅存的1只胎鼠的切片中，99%帶有綠色熒光的細(xì)胞停留在IZ區(qū)的內(nèi)側(cè)靠近SVZ處(圖1(f)，圖2(b))；高倍放大的結(jié)果中可以看到，綠色熒光標(biāo)記的細(xì)胞胞體較大，帶有纖維樣突出，且這些突出多為切向分布，很少有垂直于大腦皮層切面走向的突出．上述結(jié)果表明在大腦皮層敲低NRG1的表達(dá)后細(xì)胞的遷移和形態(tài)也與敲低ADAM17表達(dá)后的現(xiàn)象不同(圖1(b)，(f))，而與降低ADAM10表達(dá)后的表型更為接近(圖1(c)，(f))．

圖2 細(xì)胞遷移率統(tǒng)計結(jié)果Fig.2 Summary of the cell-migration-percentage

對圖1實驗進(jìn)行細(xì)胞遷移率統(tǒng)計．細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計采用Image J軟件，X區(qū)遷移率=X區(qū)被標(biāo)記細(xì)胞數(shù)/(CP區(qū)+IZ區(qū)+VZ/SVZ區(qū)被標(biāo)記細(xì)胞總數(shù))．(a) 敲低ADAM17和HB-EGF對胎鼠大腦皮層細(xì)胞遷移率影響類似．Ni-NC組7只胎鼠，A17-Ri組6只胎鼠，HB-EGF-Ri組3只胎鼠．*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001．(b) 敲低ADAM10，L1-CAM和NRG1對胎鼠大腦皮層細(xì)胞遷移的影響．由于小鼠存活率過低，A10-Ri和NRG1-Ri組各只有1只胎鼠，L1-CAM-Ri組為兩只胎鼠的平均值．

表1 IUE實驗中的小鼠存活率Tab.1 Summary of mice used in IUE experiments

注：本表統(tǒng)計了各組實驗中排除了明顯的實驗操作問題后的IUE術(shù)后母鼠及胎鼠的存活情況．每一組中，母鼠存活率=N存活母鼠N手術(shù)母鼠×100%；胎鼠存活率=N存活胎鼠N電轉(zhuǎn)胎鼠×100%．

上述實驗結(jié)果表明，在已知的與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)的ADAM17的3種底物中，只有HB-EGF表達(dá)降低后在小鼠大腦皮層中產(chǎn)生的現(xiàn)象與ADAM17表達(dá)降低后最為相似．由此推測HB-EGF極可能是ADAM17調(diào)控小鼠大腦皮層iNPCs細(xì)胞發(fā)育和遷移的重要下游底物．?dāng)M在后續(xù)實驗中用HB-EGF的全長或胞外段表達(dá)質(zhì)粒與ADAM17的shRNA干擾質(zhì)粒共轉(zhuǎn)，來觀察HB-EGF是否可以挽救降低ADAM17表達(dá)后對iNPCs細(xì)胞的遷移和分化的阻滯作用．

2.2HB-EGF全長及胞外段表達(dá)質(zhì)粒對降低ADAM17產(chǎn)生的表型的拯救情況

圖3 HF150和HF208質(zhì)粒在RSC96細(xì)胞中的表達(dá)情況Fig.3 The expressions of HF150 and HF208 in RSC96 cells

從左到右分別是陰性對照組，HF150和HF208(6μg/10cm皿)，轉(zhuǎn)染24h后收樣做Western blot，內(nèi)參為β-actin.

分別構(gòu)建帶有His-tag的HB-EGF全長表達(dá)質(zhì)粒(HF208)和胞外段表達(dá)質(zhì)粒(HF150)，并在大鼠施旺細(xì)胞系RSC96細(xì)胞上對HF150及HF208質(zhì)粒進(jìn)行表達(dá)驗證．用anti-His-tag抗體在Western blot中對外源表達(dá)的HB-EGF進(jìn)行標(biāo)記，結(jié)果表明兩種質(zhì)粒都能正常表達(dá)(圖3)．

再次通過子宮內(nèi)電轉(zhuǎn)的方法，在小鼠E14.5天時共轉(zhuǎn)ADAM17的shRNA干擾質(zhì)粒和HF150或HF208的表達(dá)質(zhì)粒．再在E18.5天進(jìn)行解剖切片觀察．實驗結(jié)果表明，當(dāng)HB-EGF表達(dá)質(zhì)粒的濃度較低時(HF150/208∶A17-Ri=2∶3，圖4(a)，(b))，大部分被綠色熒光標(biāo)記的細(xì)胞依然滯留于IZ區(qū)，尤其是HF208處理組，僅28%被標(biāo)記細(xì)胞遷移到了CP區(qū)(圖5)，即其對ADAM17敲低導(dǎo)致的輻射狀外向遷移受阻現(xiàn)象的拯救并不明顯；當(dāng)提高了HB-EGF表達(dá)質(zhì)粒的濃度后(HF150/208∶A17-Ri=3∶3，圖4(c)，(d))，拯救現(xiàn)象變得明顯；當(dāng)進(jìn)一步提高HB-EGF表達(dá)質(zhì)粒的濃度時(HF150/208∶A17-Ri=4∶3，圖4(e)，(f))，其對遷移受阻的拯救效果更加明顯．其中，HF150組87%被標(biāo)記細(xì)胞遷移到CP區(qū)，HF208組75%被標(biāo)記細(xì)胞遷移到CP區(qū)(圖5)．統(tǒng)計顯示，模擬被ADAM17切割后的HB-EGF(HF150)有比模擬未被ADAM17切割的全長HB-EGF(HF208)有更顯著的拯救效果(圖5).

圖4 共轉(zhuǎn)HB-EGF質(zhì)粒與ADAM17的shRNA干擾質(zhì)粒對腦皮層細(xì)胞遷移受阻現(xiàn)象的拯救結(jié)果Fig.4 The results of co-transfecting HB-EGF plasmids and ADAM17’s shRNA to rescue the inhibition to cortical cell migration

在E14.5天共轉(zhuǎn)不同比例的HB-EGF質(zhì)粒和A17Ri質(zhì)粒，HF-EGF質(zhì)粒自帶EGFP/EYFP標(biāo)簽，在E18.5天進(jìn)行解剖觀察．并用DAPI標(biāo)記細(xì)胞核后染色拍照，圖為一次代表性實驗結(jié)果．切片厚度為20μm，標(biāo)尺為200μm.

圖5 細(xì)胞遷移率統(tǒng)計結(jié)果Fig.5 Summary of the cell-migration-percentage

對圖4實驗進(jìn)行細(xì)胞遷移率統(tǒng)計.細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計采用Image J軟件，X區(qū)遷移率=X區(qū)被標(biāo)記細(xì)胞數(shù)/(CP區(qū)+IZ區(qū)+VZ/SVZ區(qū)被標(biāo)記細(xì)胞總數(shù))．HF∶A17Ri在2∶3和4∶3比例各一只小鼠，HF∶A17Ri=3∶3時的各4只胎鼠，*P<0.05．

3 討 論

對大腦皮層多層結(jié)構(gòu)建立過程的了解是認(rèn)識大腦功能的發(fā)育基礎(chǔ)．本課題研究結(jié)果表明，敲低Hbegf胎鼠和敲低Adam17胎鼠的大腦皮層細(xì)胞遷移表型最相似，而且過量表達(dá)HB-EGF可以挽救敲低ADAM17導(dǎo)致的iNPCs外向遷移遺傳．因此，HB-EGF作為ADAM17下游的重要信號分子，參與調(diào)控大腦皮層發(fā)育過程中iNPCs細(xì)胞外向遷移，進(jìn)而影響大腦皮層的發(fā)育．

HB-EGF拯救實驗結(jié)果中，模擬被ADAM17切割后的HB-EGF表達(dá)質(zhì)粒(HF150)有比未被切割的HB-EGF全長表達(dá)質(zhì)粒(HF208)更明顯的拯救效果，這說明被切割后的成熟HB-EGF能夠更好地調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞在大腦皮層遷移的功能．而在敲低ADAM17的情況下，模擬未切割的鉚釘在膜上的HB-EGF也具有拯救效果．產(chǎn)生這一現(xiàn)象的一個可能是由于ADAM17-Ri的敲低并不完全，殘留的ADAM17能夠切割全長HB-EGF并發(fā)揮作用；另一個可能是ADAM17不是唯一對HB-EGF進(jìn)行切割的金屬蛋白酶，可能存在其他的蛋白酶能切割釋放成熟的HB-EGF繼續(xù)發(fā)揮功能，從而部分拯救了由ADAM17的減少導(dǎo)致的細(xì)胞遷移受阻現(xiàn)象．比如基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2(Matrix Metallo Proteinase 2)或MMP9也可以從膜上切割釋放成熟的HB-EGF[28]．Wang等用成年小鼠SVZ區(qū)的神經(jīng)前體細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)MMP2或MMP9可以增強神經(jīng)前體細(xì)胞的遷移[29]．

實驗結(jié)果還顯示，在胎鼠腦內(nèi)敲低Adam17與敲低Adam10的結(jié)果有顯著差異．不同于ADAM17對于大腦皮層中iNPCs細(xì)胞外向遷移的影響，敲低Adam10后對皮層神經(jīng)細(xì)胞有更嚴(yán)重的影響．幾乎全部(99%)細(xì)胞都滯留在IZ或者SVZ區(qū)，且細(xì)胞呈球形、少突起．這些結(jié)果提示，雖然ADAM17和ADAM10在結(jié)構(gòu)上非常相似且有共享的底物，但是在皮層發(fā)育過程中，二者作用的分子機(jī)制顯著不同．最新一項研究證實，ADAM10通過NOTCH通路調(diào)控了NPCs中的細(xì)胞骨架蛋白doublecortin從而影響NPCs細(xì)胞的外向遷移[30]．這與之前報道顯示的ADAM10是NOTCH的生理切割酶[10-12]一致．而ADAM17更多通過HB-EGF等底物發(fā)揮作用．

除NOTCH之外，實驗結(jié)果還顯示出降低L1-CAM或NRG1表達(dá)后的細(xì)胞遷移現(xiàn)象與敲低ADAM10表達(dá)的效果接近，這提示L1-CAM和NRG1也可能參與了ADAM10對大腦皮層發(fā)育的作用，但目前證據(jù)還不足以完全排除ADAM17也參與其中調(diào)控的可能性．

有意思的是，L1-CAM上的突變與X連鎖型智力障礙綜合癥相關(guān)聯(lián)[31]．而NRG1和HB-EGF的表達(dá)異常動物模型也均有一定程度的精神疾病行為學(xué)表型．Dang等發(fā)現(xiàn)大鼠經(jīng)歷過持續(xù)性的壓力實驗后會在額葉處高表達(dá)NRG1和ErbB4，提示NRG1/ErbB4其在抑郁癥中的作用[32]．Oyagi等也報道了在前腦內(nèi)特異性敲除Hbegf的小鼠出現(xiàn)了類似抑郁癥和精神分裂癥等疾病表型[33]．雖然目前還沒有在神經(jīng)系統(tǒng)特異性敲除的Adam17小鼠模型被報道，從我們的結(jié)果推測，其產(chǎn)生行為異常的幾率也較高．因此更深入地了解ADAM17在大腦皮層發(fā)育和功能中的作用機(jī)制，將對于人類精神疾病的致病基因突變的遺傳篩查和治療帶來更多指導(dǎo)．

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HB-EGFRescuestheDifferentiationandMigrationDefectsofiNPCsinCerebralCortexCausedbyADAM17Knockdown

JINGYingchun1,2,LIQingyu1,LIUBin1,ZHENGYufang1,2,3

(1.SchoolofLifeSciences,FudanUniversity,Shanghai200438,China; 2.InstituteofDevelopmentalBiologyandMolecularMedicine,FudanUniversity,Shanghai200433,China; 3.InstituteofReproductiveDevelopment,ObstetricsandGynecologyHospitalofFudanUniversity,Shanghai200090,China)

ADAM17 is an important metalloprotease to cleave several crucial growth factors from cell membrane for their maturation and release.Our previous study had demonstrated that ADAM17 affects the migration and maturation of neural intermediate progenitor cells (iNPCs) in mouse embryonic cerebral cortex.In the present study,we further explored the underlying mechanism.Three substrates of ADAM17 (HB-EGF,L1-CAM,NRG1) are reported to be highly expressed in developing cerebral cortex.We knocked down the expression of these substrates in the mouse embryonic brain at E14.5 by using theinuteroelectroporation (IUE).The brains samples were collected at E18.5 and subsequently sectioned and stained by immunofluorescent method.The rescue experiments were performed by over-expressing the substrates together with shRNA of ADAM17.The abnormal migration and maturation phenotype of iNPCs caused by knocking down HB-EGF is similar to those caused by ADAM17 knock-down.When the matured HB-EGF was over-expressed together with ADAM17 shRNA,the migration and maturation of iNPCs was rescued in mouse embryonic brain.HB-EGF is the major molecule downstream of ADAM17 required for the migration and maturation of iNPCs in developing mouse cerebral cortex.

ADAM17; HB-EGF; L1-CAM; NRG1; neural intermediate progenitor cells; radial migration

0427-7104(2017)05-0602-08

2017-02-16

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(2013CB945404),上海市科委重點創(chuàng)新項目(14JC1401000)

景迎春(1992—)，女，碩士研究生；鄭煜芳，女，副教授，通信聯(lián)系人，E-mail：zhengyf@fudan.edu.cn.

Q189

A