丁運華，鄭建靈，郭少敏

(惠州學院 生命科學系，廣東 惠州516007)

五種廣東野生蕨類植物乙酰膽堿酯酶抑制活性的初步研究

丁運華，鄭建靈，郭少敏

(惠州學院 生命科學系，廣東 惠州516007)

采用乙酰膽堿酯酶抑制活性篩選模型，對五種廣東野生蕨類植物的石油醚及乙酸乙酯萃取物進行乙酰膽堿酯酶抑制活性的初步研究。結果表明，石油醚萃取物中，樣品濃度為10 mg/mL時，腎蕨、金毛狗和芒萁對乙酰膽堿酯酶的平均抑制率較高，分別為73.35%，67.32%，58.5%；鋪地蜈蚣的平均抑制率相對較低，為32.88%左右；海金莎的抑制率為負值，對乙酰膽堿酯酶活性沒有抑制，表現(xiàn)出一定的增強作用。樣品濃度為1 mg/mL時，海金沙的平均抑制率最低，約為15.86%，其次是鋪地蜈蚣，22.83%，其余四種植物均大于40%。乙酸乙酯萃取物中，樣品濃度為10 mg/mL時，芒萁的平均抑制率最低，為22.74%，其余四種蕨類的抑制率均較高，都在50%以上。樣品濃度為1 mg/mL時，芒萁的平均抑制率最低，為11.1%，其次是金毛狗，平均抑制率為30.9%，其余三種蕨類的抑制率均大于40%。同種植物在相同濃度時，不同溶劑萃取物對乙酰膽堿酯酶呈現(xiàn)不同的抑制效果。本研究為從野生蕨類植物篩選乙酰膽堿酯酶抑制劑提供參考。

蕨類植物;乙酰膽堿酯酶抑制劑;乙酸乙酯萃取;石油醚萃取

阿爾茨海默氏病(Alzheimer's Disease,AD),又稱早老性癡呆癥,是發(fā)生在老年和老年前期的一種大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變[1]，其臨床表現(xiàn)為漸進性記憶障礙、語言障礙、認知功能減退，并伴隨行為障礙及情緒異常等，其發(fā)病率和死亡率比較高，治療AD的問題日益嚴峻。目前，對于AD 的病因和發(fā)病機制廣為接受的“膽堿能學說”[1-2]認為AD患者大腦中的乙酰膽堿的缺失或水平過低是導致AD的關鍵原因。AD的病理與患者神經(jīng)間隙中乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)活性過高具有重要關系。因此乙酰膽堿酯酶抑制劑(AChEI) 藥物是目前研究最多、最為活躍的抗早老性癡呆癥藥物[1-5]。

廣東地處亞熱帶與熱帶地區(qū),地域遼闊,地形復雜,氣候溫和,雨量充沛,在不同的地域含不同的植被類型和繁多的植物種類,野生植物的種類與資源極其豐富，是開發(fā)乙酰膽堿酯酶抑制劑的寶庫，有研究發(fā)現(xiàn)，許多海藻[1]，蕨類[4]，中草藥[5]等天然植物都有乙酰膽堿酯酶抑制活性。很多蕨類植物自古以來就被廣泛用于醫(yī)藥領域，以治療各種疾病。如鋪地蜈蚣全草有祛風散熱，舒筋活血的功效；海金莎可利尿，通淋和治燙火傷；金毛狗的根莖可補肝腎、強腰膝，除風濕以及利尿等[6]。筆者選用5種廣東常見的野生蕨類植物：鋪地蜈蚣[Palhinhaeacernua(L.) Vas]、海金沙[Lygodiumjaponicum(Thunb.)Sw.]、金毛狗[Cibotiumbarometz(Linn.)J.Sm.]、芒萁[Dicranopterisdichotoma(Thunb.)Bernh.]、腎蕨[Nephrolepisauriculate(L.) Trimen]，對這5種野生蕨類植物的石油醚萃取物及乙酸乙酯萃取物進行乙酰膽堿酯酶抑制活性進行研究，旨在為發(fā)現(xiàn)天然的乙酰膽堿酯酶抑制劑提供線索以及對它們的進一步藥用價值研究提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

鋪地蜈蚣、海金沙、金毛狗、芒萁、腎蕨采集于廣東惠州、河源地區(qū)的山地，經(jīng)惠州學院生命科學學院林芳花副教授鑒定。

1.2 試劑與儀器

底物碘化硫代乙酰膽堿(ATCI) 和顯色劑二硫代雙對硝基苯甲酸(DTNB)均購于國藥集團化學試劑有限公司，乙酰膽堿酯酶購于Sigma公司,配制方法是10 mg酶加入1 mg牛血清白蛋白作為穩(wěn)定劑，用50 mmol/L，pH8.0的PBS溶液1 mL制成2 U/mL的酶液)，他克林(tacrine)購于Sigma公司，配制時用50 mmol/L，pH8.0的PBS溶液配制，其余試劑為國產(chǎn)分析純或生化試劑規(guī)格.

DZF-6020型真空干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司),BJ-350型高速多功能粉碎機,SB3200DT超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有新公司),抽濾機(鄭州長城科工貿(mào)有限公司),RE2000A旋轉蒸發(fā)器(上海一科儀器有限公司),722G可見分光光度計,HWS24型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司)。

1.3 蕨類植物樣品的制備

將采集的5種新鮮蕨類植物全草陰干或烘干后粉碎,取每種粉碎樣品各10 g,用100 mL 95%乙醇溶解,50 ℃超聲波提取30 min,過濾,連續(xù)提取3次,合并提取液；減壓蒸餾后得乙醇提取物浸膏,加入100 mL蒸餾水浸泡溶解，依次用石油醚(100 mL ×3)、乙酸乙酯(100 mL ×3)分別萃取3次，合并提取液，減壓蒸餾，分別獲得相應的石油醚浸膏和乙酸乙酯組分。用50%乙醇分別配成10 mg/mL和1 mg/mL濃度的樣品溶液備用[1,7-8]。

1.4 篩選模型的建立

參照Ellman的方法稍作改進[1,8-9]。改法的原理為AChE催化水解底物碘化硫代乙酰膽堿(ATCI)，水解形成的產(chǎn)物碘化硫代膽堿迅速與顯色劑二硫代雙硝基苯甲酸(DTNB)反應生成黃色產(chǎn)物5-巰基-2硝基苯甲酸，該產(chǎn)物在412nm處有光吸收。在酶催反應的穩(wěn)態(tài)階段用光吸收值OD值表征酶促反應初速度.

1.4.1 OD-T曲線的測定

取50 mmol/L的 PBS 2 730 μL，37℃水浴預熱2 min，再依次加入乙酰膽堿酯酶 13 μL，15 mmol/L 的 DTNB 100 μL，15 mmol/L 的ATCI 100 μl，37℃水浴反應不同時間(0 min,5 min，10 min，15 min,20 min，25 min，30 min)，測其在412 nm 處的OD 值。(扣除ATCI因非酶催水解所產(chǎn)生的吸光值)，確定酶催反應處于初速度的時間。

1.4.2 OD-酶活曲線的測定

取50 mmol/L 的 PBS 2 730 μL，37℃水浴預熱2 min，再依次加入不同濃度(0.8 U/mL，1.2 U/mL，1.6 U/mL,2.0 U/mL,2.4 U/mL,2.8 U/mL)的乙酰膽堿酯酶13 μL,15 mmol/L的DTNB 100 μL,15 mmol/L的ATCI 100 μL,37℃水浴反應的時間由1.4.1的實驗確定，測其在412 nm 處的OD 值。(扣除ATCI因非酶催水解所產(chǎn)生的吸光值)，確定是否可以用OD值代表酶活。

1.4.3 活性測定及計算

取2 630 μL 50 mmol/L的 PBS，37 ℃預熱2 min，再依次加入樣品100 μL，乙酰膽堿酯酶13 μL,15 mmol/L 的DTNB 100 μL，15 mmol/L 的 ATCI 100 μL，37℃水浴反應 20 min，加入100 μL 1%的SDS終止反應，測其在412 nm的OD值，記為A樣品。

由于本實驗五種野生蕨類植物的乙醇提取物樣品本身多有顏色，所以每個樣品同時做一個本底扣除，在上面的測定中，用100 μL 50 mmol/L 的 PBS 代替底物溶液，測其 412 nm 的 OD值，記為 A本底。

空白對照，即用100 μL PBS來代替樣品，測其 412 nm 的 OD 值，記為 A空白。

陽性對照：測定方法同A樣品，反應體系中用100 μL的他克林代替樣品溶液。

吸光值和抑制率的計算公式為：

樣品的吸光值為：A真實=A樣品-A本底

樣品的抑制率為：(A空白-A真實)/A空白×100%

所有實驗重復3次并計算平均值和標準偏差。

2 結果與討論

2.1 篩選模型

2.1.1 ATCI非酶水解的光吸收

底物ATCI會有一定的非酶催水解作用。15 mmol/L 的 ATCI 100 μL加入 2 730 μL 50 mmol/L 的 PBS，15 mmol/L 的 DTNB 100 μL，不加酶，37℃水浴反應不同時間，通過測412 nm 時的OD 值可以明顯見到隨著水浴時間的延長，吸光值緩慢而持續(xù)增高，所以ATCI的吸光值不可忽略。

圖1 ATCI的光吸收曲線

2.1.2 OD-t曲線的測定

反應開始后20 min內(nèi)，在實驗選取的幾個時間點，OD值與時間呈現(xiàn)較好的線性關系，20 min后，吸光值開始下降。因此取20 min作為該反應體系的反應時間，反應開始后20 min內(nèi)的OD值都可以代表其反應初速度。

圖2 OD-t曲線

2.1.3 OD-酶活曲線

由圖3的結果可看出，在20 min時、0.8～2.8 U/mL的酶濃度下，OD值與酶濃度形成較好的線性關系，證明在此范圍內(nèi)可用OD值來表示酶活。

圖3 OD-酶活曲線

2.2蕨類植物的活性測試結果

表1 五種藥用蕨類植物的活性測試結果(平均抑制率)

注：他克林陽性對照濃度為3.13×10-9mg/mL時的抑制率為(63.8±4.15)%

根據(jù)表1的結果顯示，五種藥用蕨類植物的石油醚萃取物及乙酸乙酯萃取物在樣品濃度不同的情況下，對乙酰膽堿酯酶活性的抑制程度也就不同。

石油醚萃取物樣品濃度為10 mg/mL時，腎蕨、金毛狗和芒萁三種蕨類表現(xiàn)出較高的抑制活性。其中腎蕨的平均抑制率最大，為73.35%，其次是金毛狗，平均抑制率為67.32%，芒萁的平均抑制率為58.5%，鋪地蜈蚣的抑制率相對較低，為32.88%,海金沙的平均抑制率為-20.56%，表明它的石油醚萃取物在濃度為10 mg/mL的情況下不僅對乙酰膽堿酯酶活性沒有抑制，反而有一定的增強作用。當樣品濃度為1 mg/mL時，海金沙的平均抑制率最低，只有15.86%，其余四種蕨類植物均大于20%，金毛狗、芒萁和腎蕨的平均抑制率都在40%以上。

乙酸乙酯萃取物的樣品濃度為10 mg/mL時，腎蕨、鋪地蜈蚣、海金沙和金毛狗四種蕨類植物的平均抑制率都較高，均在60%左右，只有芒萁較低，平均抑制率僅有22.74%。當樣品濃度為1 mg/mL時，腎蕨、鋪地蜈蚣和海金沙三種蕨類植物的平均抑制率較高，大于40%，金毛狗的平均抑制率為30.90%，芒萁的平均抑制率最低，只有11.1%。乙酸乙酯萃取物組分沒有出現(xiàn)平均抑制率為負值的情況。

從表1測定結果還發(fā)現(xiàn)，同種藥用蕨類植物在相同濃度的情況下，不同溶劑的萃取物對乙酰膽堿酯酶的活性呈現(xiàn)出不同的抑制效果。鋪地蜈蚣和海金沙在樣品濃度為10 mg/mL和1 mg/mL時的平均抑制率，均為乙酸乙酯萃取物大于石油醚萃取物；金毛狗和芒萁則與之相反，在樣品濃度為10 mg/mL和1 mg/mL時的平均抑制率，均是石油醚萃取物大于乙酸乙酯萃取物；腎蕨則與其他四種蕨類植物的情況不同，其濃度為10 mg/mL時，石油醚萃取物的抑制率大于乙酸乙酯萃取物，而其濃度為1 mg/mL時的抑制率，則是乙酸乙酯萃取物大于石油醚萃取物。

3 討 論

五種廣東鄉(xiāng)土蕨類植物乙醇提取物的石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物對乙酰膽堿酯酶都呈現(xiàn)出一定的抑制作用。比較特殊的是，海金莎的石油醚萃取物樣品濃度為10 mg/mL時，其抑制率是負值，也就是說此時它不僅對乙酰膽堿酯酶活性無抑制作用，反而有一定的增強作用，而在其他濃度或其他萃取物中，抑制率則為正值。針對海金莎的雙向抑制效果，劑量應該是影響因素之一。即同一味藥隨著劑量的變化，功效也會發(fā)生變化。測定結果中同種藥用蕨類植物在相同濃度的情況下，不同溶劑的萃取物對乙酰膽堿酯酶的活性呈現(xiàn)出不同的抑制效果的情況，可能與不同的提取方法得到的化合物種類及含量不同有關。乙酸乙酯提取物類型多為甾醇、萜類、黃酮類，芳酸酯、酚類等，揮發(fā)油成分含量很少，石油醚組分多為脂溶性成分：脂肪酸、甘油酯、長鏈烴類化合物以及萜類、甾體、生物堿等[10-12]。對不同提取物中的化合物成分進行更加系統(tǒng)深入的化學成分結構鑒定研究，將很可能發(fā)現(xiàn)活性強的有效成分，從而為可治療早老性癡呆的藥物開發(fā)及研究提供更有價值的活性先導結構

很多蕨類植物自古以來就被廣泛的用于醫(yī)藥上，其含有黃酮類、甾類、生物堿、酚類、三萜類化合物等多種活性物質，對很多疾病都有較明顯的治療效果。本實驗也表明這五種藥用蕨類植物基本都對乙酰膽堿酯酶有一定的抑制作用，即這些植物里面極可能含有抑制AChE活性的成分。因此，對這些植物作進一步活性追蹤、化學成分分離和結構鑒定將是今后努力的方向。

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StudiesofAcetylcholinesteraseInhibitoryActivitiesofFiveWildFernsExtractsinGuangdong

Ding Yunhua,Zheng Jianling,Guo Shaomin

(School of Life Science,Huizhou University,Huizhou 516007,China)

To research the acetylcholinesterase (AChE) inhibitory activity of five ferns extracts which were collected from Guangdong province,screening model of acetylcholinesterase inhibitory activity were used.The results showed that at 10 mg/mL of petroleum ether extract,Nephrolepisauriculate,CibotiumbarometzandDicranopterisdichotomademonstrated higher inhibitory activity,which were 73.35%，67.32%，58.5% respectively.Lower inhibitory activity was seen inPalhinhaeacernuaand negative inhibitory activity inLygodiumjaponicum; At 1 mg/mL of petroleum ether extract,Lygodiumjaponicumshowed the lowest inhibitory activity,which was 15.86%,andPalhinhaeacernuacame next with 22.83%,and the remaining four ferns were all above 40%.At 10 mg/mL of ethyl acetate extract,Dicranopterisdichotomawas seen with the lowest inhibitory activity,which was 22.74%,while the remaining four ferns were all above 50%; at 1 mg/mL of ethyl acetate extract,Dicranopterisdichotomawas still seen with the lowest inhibitory activity,which was 11.1%,andCibotiumbarometzcame next with 30.9%,the remaining three ferns were all above 40%.Different solvent extracts showed different inhibitory activity at the same concentration with the same fern plant.

fern phant ; acetylcholinesterase inhibitor; ethyl acetate extract; petroleum ether extract

10.3969/j.issn.1006-9690.2017.05.004

2017-03-28

廣東省科技計劃項目(2011B030800021)；惠州市科技計劃項目(2012P16)。

丁運華(1966—)，女，副教授，研究方向：植物生物技術與天然產(chǎn)物研究。E-mail：dingyunhua@hzu.edu.cn

Q949.95

A

1006-9690(2017)05-0017-04