夏 凡，周 勝，孫達鋒

(1.南京科技職業(yè)學院 生物與環(huán)境學院，江蘇 南京210048；2.南京科技職業(yè)學院 信息技術學院，江蘇 南京210048；3.南京野生植物綜合利用研究院，江蘇 南京 210042)

響應面法優(yōu)化酶法提取枸杞多糖的研究

夏 凡1*，周 勝2，孫達鋒3

(1.南京科技職業(yè)學院 生物與環(huán)境學院，江蘇 南京210048；2.南京科技職業(yè)學院 信息技術學院，江蘇 南京210048；3.南京野生植物綜合利用研究院，江蘇 南京 210042)

選用響應面法優(yōu)化及正交實驗法進行淀粉酶提取枸杞多糖實驗設計及分析。通過單因素實驗后，正交實驗確定淀粉酶酶解提取枸杞多糖的最佳條件為：pH=5.0，溫度50 ℃，時間80 min，加酶量為0.5%，枸杞多糖提取率12.1%；響應面分析確定淀粉酶酶解提取枸杞多糖的最佳條件為酶解溫度49.56 ℃、酶解時間140 min、酶濃度0.3%，枸杞多糖提取率為13.25%。酶法提取枸杞多糖比傳統(tǒng)熱水浸提提高了枸杞多糖的提取率，反應條件溫和，而且通過響應面法進行實驗設計和優(yōu)化比正交實驗法能得到更高的枸杞多糖提取率。

響應面法優(yōu)化；正交實驗法優(yōu)化；淀粉酶；枸杞多糖；對比研究

枸杞又名枸杞子，含有豐富的胡蘿卜素、多種維生素和鈣、鐵等對眼睛健康作用的必須營養(yǎng)物質，所以別名“明眼子”。對于治療肝血不足、腎陰虧虛等引起的視物昏花和夜盲癥，有著明顯的療效[1]。枸杞之名始見于《神農本草經》，并列為上品，千百年來深受人們的喜愛。枸杞子對于人體的健康有著重要的意義，是人們不可缺的健康果實[2]。前輩學者對枸杞多糖的試驗研究發(fā)現枸杞多糖(LBP)是一種水溶性多糖，由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖等六種單糖成分組成，具有生理活性，其能夠增強非特異性免疫功能，提高抗病能力，抑制腫瘤生長和細胞突變[3]。枸杞多糖(LBP)可明顯提高吞噬細胞的吞噬功能，提高T淋細胞的增殖能力。其不僅是一種調節(jié)免疫反應的生物反應調節(jié)劑，而且可以通過內分泌—免疫調節(jié)網絡發(fā)揮抗癌作用[4]。枸杞多糖(LBP)對于消除疲勞具有十分明顯的作用，降血糖枸杞多糖能明顯增強受損胰細胞內超氧化歧化酶(SOD)的活性，提高胰島細胞的抗氧化能力，減輕過氧化物對細胞的損傷，降低丙二醛生成量，對胰島細胞有著一定的保護作用[5]。枸杞多糖可降低大鼠血壓，增加降鈣素基因相關肽的釋放，防止高血壓形成[6]。而且美容養(yǎng)顏、滋潤肌膚皮膚衰老等由于自由基氧化所造成的也可以由具有強力的抗氧化劑的LBP、胡蘿卜素等加上枸杞所含的微量元素硒和維生素E的協(xié)同作用組成強大的抗氧化部隊，以起到美容養(yǎng)顏，滋潤肌膚的作用[7]。正是因為枸杞多糖如此多的有利作用，作為食藥兩用的植物，本研究對枸杞多糖的提取意義很大。

如今對于枸杞多糖的提取研究工藝各種各樣，介于水提法的試驗時間長，效率低；堿提法的試驗復雜仔細；超聲波法提取的試驗設備昂貴，要求實驗員的技能水平高[8]，而酶解法條件溫和，有利于保護產物活性，低能環(huán)保，易于實現工業(yè)化，已被廣泛應用到植物多糖提取上[9]。

響應面法(Response Surface Analysis，RSA)作為一種高效的工藝優(yōu)化方法[10]，具有周期短、實驗次數少、得到回歸方程精確度高的特點，也已廣泛用于天然產物提取工藝優(yōu)化[11-12]。然而，枸杞多糖的酶法提取尚未見RSA法的應用。 本文利用淀粉酶提取枸杞多糖，通過正交實驗得到優(yōu)化的提取條件，和采用Design-Expert軟件，通過RSA法優(yōu)化提取工藝參數。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞：寧夏產，寧夏中寧縣杞里香枸杞開發(fā)有限公司；淀粉酶，活力為2 000～4 000 μg/mg·s，國藥集團化學試劑有限公司；無水乙醇，分析純，南京奧佳化工有限公司；硫酸，分析純，揚州滬寶化學試劑有限公司；苯酚，分析純，上海實意化學試劑有限公司；葡萄糖，分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

分析天平，FA210B，梅特勒-托利多儀器有限公司；電熱恒溫水浴箱，STC-15B，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；分光光度計，722N，上海菁華科技儀器有限公司；離心分離器，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；旋轉蒸發(fā)儀，SY-2000,上海亞榮生化儀器廠; SHZ-D(Ⅱ)循環(huán)水式真空泵，河南省予華儀器有限公司; 真空冷凍干燥機。

1.3 方法

1.3.1 淀粉酶解枸杞多糖的實驗流程

枸杞用溫水(水溫45 ℃、 50 mL)浸泡30 min,然后用打漿機進行打漿,用紗布過濾得到漿液。

準確稱取一定質量的淀粉酶，并按照重量比加入蒸餾水，將其置于一定溫度的水浴鍋中活化30 min。稱取枸杞20 g，加入酶，調節(jié)溶液的酸堿度，然后置于水浴鍋中浸提，溫度上升到90 ℃，酶失活30 min，冷卻到室溫，濃縮過濾，取上清液，即得多糖溶液，然后減壓濃縮，加入無水乙醇進行沉淀操作，沉淀物質用95%的乙醇、蒸餾水反復洗滌，干燥得多糖粗樣品，并稱量重量，最后得其提取率[13]。

1.3.2 枸杞多糖的測定

采用苯酚-硫酸法[13]測定提取液中總糖。枸杞多糖的得率計算公式為[14]：

枸杞多糖得率=C×V1×N×10-3/(V2×m)×100%

式中：C—表示經過稀釋后測定的多糖含量(μg);

V1—表示提取后得到的上清體積(mL);

N—表示稀釋倍數；

V2—表示用于測定的上清體積(mL);

m—表示用于提取的干枸杞質量(mg)。

其它條件一定下，枸杞多糖提取率與枸杞多糖溶液濃度呈正相關關系，而枸杞多糖濃度與葡萄糖濃度呈正相關關系，而葡萄糖溶液的490 nm的吸光度又與其濃度呈現以上線性關系:y=9.6483x-0.0104，因此枸杞多糖提取率與枸杞多糖提取液在520 nm的吸光度呈線性關系，即枸杞多糖提取液在520 nm的吸光度大，其對應實驗的枸杞多糖提取率也高。

1.3.3 淀粉酶解枸杞多糖單因素實驗

淀粉酶提取枸杞多糖，主要是利用淀粉酶水解纖維素，使其組成枸杞細胞的細胞壁破裂，釋放細胞壁內的枸杞多糖，而多糖釋放的多少和淀粉酶的加入量有著直接的關系。本實驗探討淀粉酶提取枸杞多糖時，酶解溫度、酶解時間、pH以及加水量對多糖的提取的作用,進行單因素實驗，考察以上各因素對淀粉酶解枸杞多糖提取的影響。

1.3.4正交實驗分析

在單因素實驗的基礎上，確定正交實驗的因素與水平，由1.3.2知，枸杞多糖提取率與枸杞多糖提取液在520 nm的吸光度呈一次線性關系，以枸杞多糖提取液在520 nm的吸光度為結果，通過正交實驗對淀粉酶酶解提取枸杞多糖的條件進行優(yōu)化。

1.3.5 Box-Behnken 響應面分析

在單因素實驗的基礎上，確定Box-Behnken響應面分析實驗的因素與水平，以枸杞多糖得率為響應值，通過響應面分析對淀粉酶酶解提取枸杞多糖的條件進行優(yōu)化。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果與分析

2.1.1 加水量對淀粉酶解枸杞多糖提取率的作用

將條件設定為取20 g的枸杞平均分配到5個錐形瓶中，加水量分別為30、40、50、60、70、80 mL,pH=4.0、時間2 h、溫度55 ℃、加淀粉酶0.5%,酶解后立即升溫至85 ℃滅酶,之后熱水浸提2 h,經離心后,測吸光度。

圖 1 加水量對淀粉酶解枸杞多糖提取率影響

2.1.2酶解時間對淀粉酶解枸杞多糖提取率的作用

將條件設定為取20 g的枸杞平均分配到5個錐形瓶中，每個錐形瓶的加水量為50 ml,每個錐形瓶的酶解反應時間分別設置為20、40、60、80、100、120 min，其余同上2.1.1。

圖2 酶解時間對淀粉酶解枸杞多糖提取率影響

2.1.3酶解溫度對淀粉酶解枸杞多糖提取率的作用

將條件設定為取20 g的枸杞平均分配到5個錐形瓶中，每個錐形瓶的加水量為50 mL,每個錐形瓶的酶解反應溫度分別設置為35、45、55、65、75、85 ℃,酶解時間為90 min,其余同上2.1.1。

圖3 酶解溫度對淀粉酶酶解枸杞多糖提取率的影響

2.1.4加酶量對淀粉酶解枸杞多糖提取率的作用

將條件設定為取20 g的枸杞平均分配到5個錐形瓶中，每個錐形瓶的加水量為50 mL,酶解溫度為45 ℃，pH=4.0、酶解時間為90 min、每個錐形瓶加淀粉酶量分別為0.3%，0.4%，0.5%，0.6%，0.7%，0.8%,其余同上2.1.1。

2.1.5 pH對淀粉酶解枸杞多糖提取率的作用

將條件設定為取20 g的枸杞平均分配到5個錐形瓶中，加水量50 mL,五個錐形瓶的pH 分別為3、4、5、6、7、8，酶解時間80 min、酶解溫度45 ℃、加淀粉酶0.6%,其余同上2.1.1。

圖5 pH對淀粉酶解枸杞多糖提取率的影響

2.2正交實驗法對淀粉酶解枸杞多糖條件的優(yōu)化

在單因素實驗的基礎上，固定加水量50 mL和pH=5的試驗條件，選擇酶解溫度、酶解時間、酶濃度進行三因素三水平的正交實驗設計，見表1、表2。

表1 正交試驗因素水平表

表2 正交試驗設計方案及結果分析表

由表2分析結果可知，RB>RC>RA，淀粉酶提取枸杞多糖的提取率最高組合為B3C2A2，淀粉酶提取枸杞多糖的最合適條件為加水量50 mL，pH=5.0，溫度50 ℃，時間80 min，加酶量為0.5%，枸杞多糖提取率12.1%。

表3 最佳實驗條件驗證試驗

2.3 響應面法對淀粉酶解提取枸杞多糖條件的優(yōu)化

2.3.1 Box-Behnken實驗

在單因素實驗的基礎上，固定加水量為50 mL、酶解pH5的實驗條件，選擇淀粉酶添加量、酶解溫度和酶解時間進行3因素3水平的響應面實驗分析。見表4、表5。

表4 響應面設計因素與水平編碼值

2.3.2 響應面分析實驗方案及結果

對淀粉酶法提取枸杞多糖進行響應面分析，見表5。

表5 Box-Behnken實驗設計及實驗結果

表6 二次回歸模型的方差結果分析

2.3.3 二次回歸模型的建立及其顯著性檢驗

運用Design-Expert軟件對表5 的實驗數據進行多元回歸擬合，得到枸杞多糖得率對(y)對酶解溫度(x1)、酶解時間(x2)和酶濃度的二次多項回歸方程為：y=12.59-0.11x1+0.33x2+0.52x3-0.16x1x2-0.31x1x2-0.85x2x3-1.55x12-0.19x22-0.94x32

用Design-Expert軟件對17個實驗點的響應值進行回歸分析，方差分析結果見表6。模型的可靠性可從方差分析及相關系數來考察。當p<0.05,表示該項指標顯著。由表3可知，模型(p=0.000 5)極顯著，失擬項(p=0.117 9)不顯著R2=0.959 3，Radj2=0.9070,因此該二次模型成立，可用于預測淀粉酶酶解枸杞多糖得率，優(yōu)化酶解工藝條件。酶濃度對枸杞多糖得率影響高度顯著，酶解時間較顯著，酶解溫度不顯著。在所選取的各因素水平范圍內，按照對結果的影響排序，其順序為酶濃度>酶解時間>酶解溫度。

2.3.4 因素間的交互影響

由圖6可以看出，若酶濃度不變，酶解溫度與酶解時間的交互作用對枸杞多糖得率的影響顯著，多糖得率隨酶解溫度及酶解時間的增加而呈現由低到高再降低的趨勢，即多糖得率在合適的酶解溫度與酶解時間下具有極大值，該極大值存在于響應面的頂部即響應曲面的頂部，即響應面的最高點，也就是等高線最小的橢圓的中心點。

由圖7可以看出，若酶解時間不變，酶解溫度與酶濃度的交互作用對枸杞多糖得率的影響顯著，多糖得率隨酶解溫度與酶濃度的增加而呈現由低到高再降低的趨勢，即多糖得率在合適的酶解溫度與酶濃度下具有極大值，該極大值存在于響應面的頂部，即響應面的最高點，也就是等高線最小的橢圓的中心點。

圖6 酶解溫度及酶解時間影響多糖得率的響應曲面圖和等高線圖

圖7 酶解溫度及酶濃度影響多糖得率的響應曲面圖和等高線圖

由圖8可以看出，若酶解溫度不變，酶解時間與酶濃度的交互作用對枸杞多糖得率的影響顯著，多糖得率隨酶解時間與酶濃度的增加而呈現由低到高再降低的趨勢，即多糖得率在合適的酶解時間與酶濃度下具有極大值，該極大值存在于響應面的頂部，即響應面的最高點，也就是等高線最小的橢圓的中心點。

酶解溫度與酶濃度對枸杞多糖提取得率的交互效應最為顯著，表現為曲線較陡，酶解溫度與酶解時間對枸杞多糖提取得率的交互效應次之，酶解時間與酶濃度對枸杞多糖提取得率的交互效應顯著性差，表現為曲線較平滑。

圖8 酶解時間及酶濃度影響多糖得率的響應曲面圖和等高線圖

2.3.5 優(yōu)化最佳組合條件

通過上述分析可知，合適的酶濃度、酶解時間、酶解時間有利于酶解法提取枸杞多糖，試驗繼續(xù)采用Design-Expert軟件8.0.6的優(yōu)化功能對響應面試驗的最優(yōu)值預測，在試驗因素取值范圍內選擇最低點為出發(fā)點，響應值選取最大值，選取范圍分別是酶解溫度25～75 ℃，酶解時間50～140 min,酶濃度0.3%～0.6%，可以優(yōu)化得到酶解法提取枸杞多糖的理論最優(yōu)化試驗條件，即最佳酶解溫度49.56 ℃、酶解時間140 min、酶濃度0.3%,在此條件下，酶解法枸杞多糖的提取率理論預測值為13.1913%。

為驗證RSA法的可靠性，采用上述最優(yōu)提取條件進行酶解法提取枸杞多糖實驗，見表7，實際提取率為13.25%，誤差為0.45%。

表7 最佳實驗條件驗證試驗

3 結 論

響應面法優(yōu)化通過17組實驗模擬得二次多項回歸方程，從而可優(yōu)化得最佳提取條件及實際提取率13.25%，比正交實驗最佳組合條件下的實際提取率高，因為響應面優(yōu)化可模擬得二次多項回歸方程，響應面優(yōu)化提取最佳條件比正交實驗法最佳條件增加了提取時間，減少了酶濃度，增加了提取率。由此可見，響應面優(yōu)化法與正交實驗優(yōu)化相比，確實有周期短、回歸方程精確度高的優(yōu)點，最終也增加了實驗結果，是一種有效的實驗分析方法。

總之，酶法提取枸杞多糖比傳統(tǒng)熱水浸提提高了枸杞多糖的提取率，反應條件溫和，而且通過響應面法進行實驗設計和優(yōu)化比正交實驗法能得到更高的枸杞多糖提取率。

[1] 汪建龍.枸杞多糖藥理作用的研究進展[J].時珍國醫(yī)國藥,2005(2):45-48.

[2] 肖華志,胡小松.我國枸杞的加工利用現狀及其深加工的發(fā)展趨勢[J].中國農業(yè)科技導報,2002,4(3): 53-56.

[3] 張惠玲.枸杞的營養(yǎng)與功效[J].農業(yè)科學研究,2011,32(3): 59-62.

[4] 霍超,徐桂花.枸杞生理功效和活性成分的研究進展[J].中國食物與營養(yǎng),2007,11: 50-53.

[5] 何進.枸杞多糖的初步研究[J]食品科學,1995(2):14-21.

[6] 王金童,王秀娟.枸杞子的化學成分和藥理研究概況[J].天津藥學,1999,11(3):14-16.

[7] 章培軍,邢雁霞.枸杞多糖對實驗性肝損傷保護作用的研究[J].中國藥物與臨床,2011,11(11):1286-1287.

[8] 白壽寧.枸杞多糖提取及分離純化技術探討[J].食品工業(yè),2000(3):9-11.

[9] WIJESINGHE W A J P,JEON Y J.Enzyme-assistant extraction(EAE) of bioactive components:A useful approach for recovery of industrially important metabolites from seaweeds[J].A review Fitoterapia,2012,83:6-12.

[10] ZHANG Kui,WANG Qiang.Optimization of ultrasonic extraction of polysaccharides from dried longan pulp using response surface methodology[J].Carbohydrat Polymers,2010,80(1):19-25.

[11] 劉琳，鄢瑞明，曾凡駿.響應面法優(yōu)化枸杞多糖提取的研究[J].食品與發(fā)酵科技,2011,47(6):32-35.

[12] 彭勇勝,王江之,黃程,等.響應面法優(yōu)化姬松茸多糖的提取工藝[J].現代食品科技,2011,127(9):1119-1122.

[13] DUBOIS M,GILLES K A,HAMILTON J K,et al.Colorimetric Method for Determination of Sugara and Related Substances[J].Analytical Chemistry,1956,28:350-356.

[14] 高麗萍，鄭光耀，閆林林，等.響應面法優(yōu)化亞臨界水提取銀耳多糖工藝研究[J].江蘇農業(yè)科學，2016,44(7):339-342

SurfaceOptimizationMethodtoOptimizetheEnzymaticExtractionofLyciumbarbarumPolysaccharides

Xia Fan1*，Zhou Sheng2，Sun Dafeng3

(1.School of Biology and Environment,Nanjing Polytechnic Institute,Nanjing 210048,China;2.School of Computer and Software Engineering,Nanjing Polytechnic Institute,Nanjing 210048,China；3.Nanjing Institute for Comprehensive Utilization of Wild Plants,Nanjing 210042,China)

The response surface optimization method and orthogonal experiment method were used for design and analysis of amylase extraction experiment ofLyciumbarbarumpolysaccharide .Through single factor experiment,the optimum conditions were determined by orthogonal experiment: pH=5.0,extraction at 50℃ for 80min and cellulase concentration with 0.5%.Under this condition,the maximum yield of polysaccharides was obtained as 12.1%.Through surface optimization method,the optimal condition for the extraction was enzymolysis at 49.56℃and time for 140min and cellulase concentration with 0.3%.Under this condition,the maximum yield of polysaccharides was obtained as 13.25%.Compared with the traditional hot water extraction,the enzymic extraction method ofLyciumbarbarumpolysaccharides improved the extraction rate ofLyciumbarbarumpolysaccharides and was in mild reaction conditions.In addition,the extraction rate of LBP was better than that of the orthogonal experiment.

surface optimization method; orthogonal experiment method; amylase;Lyciumbarbarumpolysaccharide; comparison

10.3969/j.issn.1006-9690.2017.05.007

2017-02-12

“十三五”重點研發(fā)計劃項目(2016YFD0400804)。

*通訊作者：夏凡，碩士，從事藥物產品合成及分離研究及教學。E-mail:sissi2xf@163.com

TQ281

A

1006-9690(2017)05-0027-07