陳 健，謝 清，Aun Raza，湯 建，歐陽臻

(江蘇大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

澤漆總黃酮的制備工藝及神經(jīng)保護活性

陳 健，謝 清，Aun Raza，湯 建*，歐陽臻

(江蘇大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

以總黃酮和金絲桃苷為考察指標(biāo)，通過靜、動態(tài)吸附和解析實驗，對三種陰離子交換樹脂和三種大孔吸附樹脂進行篩選，確定制備澤漆總黃酮的工藝。優(yōu)選FPA98陰離子交換樹脂制備澤漆總黃酮，提取液與樹脂的比例100∶1(v/w)，以pH 2 的70%甲醇洗脫。FPA98樹脂吸附總黃酮的效率為47.86 mg/g，總黃酮解析率為88.7%。產(chǎn)品中總黃酮和金絲桃苷含量分別為48.3%和10.3%。進一步純化后的澤漆總黃酮對魚藤酮誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷有較好的保護作用。

澤漆；陰離子交換樹脂；總黃酮；金絲桃苷；神經(jīng)保護

金絲桃苷具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗癌、抗微血栓形成及保護心腦缺血損傷等藥理活性[1]。金絲桃苷目前的來源有化學(xué)合成和植物提取等方法，市場上提供的金絲桃苷以植物提取為主[2]。前期研究[3]中發(fā)現(xiàn)野生植物澤漆資源豐富，且富含金絲桃苷及2''-O-沒食子?；鸾z桃苷(2''-O-galloyl hyperoside)，后者在堿性條件下(pH 9～11)可以水解失去沒食子酰基變?yōu)榻鸾z桃苷。本文采用大孔樹脂和陰離子交換樹脂，處理澤漆藥材的堿性提取液，優(yōu)化制備富含金絲桃苷的澤漆總黃酮的工藝，并初步測定其神經(jīng)保護活性，為金絲桃苷的工業(yè)化生產(chǎn)以及中藥材澤漆的綜合利用提供依據(jù)。

1 材料與儀器

澤漆藥材于2015年4月收集于江蘇鎮(zhèn)江，經(jīng)本院歐陽臻教授鑒定為大戟科大戟屬植物澤漆(EuphorbiahelioscopiaL.)。全草粉碎(10～20目) 后冷藏備用。金絲桃苷對照品為本實驗室自制，純度>95%。離子交換樹脂：FPA90、FPA98、D201，大孔吸附樹脂：XAD7HP、HP20、AB-8。甲醇(色譜純)、雙純水，其他化學(xué)試劑均為分析純。

Sartorius電子天平；LC-20A高效液相色譜儀(Shimadzu)；PCS型紫外-可見分光光度計；R-21旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(BUCHI)。

2 方法與結(jié)果

2.1 UV法測定澤漆總黃酮含量[4]

精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品用乙醇溶解，制備系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。以30%的乙醇為參比置于510 nm測定吸光度，以濃度對吸光度值做標(biāo)準(zhǔn)曲線：

Y=9.2436X+0.0036，R2=0.9996。

2.2 HPLC-UV測定金絲桃苷含量[5]

色譜柱為Gracesmart RP -C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μmol/L)；流動相為甲醇-水(40∶60)；流速：0.8 mL/min；柱溫：20 ℃；檢測波長：360 nm；進樣量20 μL。

精密稱取金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品用乙醇溶解，制備系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。HPLC測定，以濃度(X)對峰面積(Y)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=32483986X-693.354，R2=0.9997。對照品及樣品依上述條件檢測，HPLC圖如圖1。

圖1 HPLC圖

2.3藥材提取液的制備

根據(jù)前期工作的基礎(chǔ)，選取干燥的澤漆藥材，用30%乙醇(NaOH，pH 10)提取，料液比為20∶1，20 ℃下浸漬12 h。

2.3 澤漆總黃酮的制備

2.3.1 樹脂的篩選[4-5]

精確稱取預(yù)處理過的1 g樹脂，分別加入100 mL的吸附液，期中三種離子樹脂所用吸附液pH 10，三種大孔樹脂所用吸附液提前用5% HCl調(diào)pH至6左右。靜置、吸附24 h。用UV和HPLC兩種方法檢測提取液中剩余總黃酮和金絲桃苷的濃度，計算樹脂對黃酮的吸附量(表1)。再將液體抽濾，樹脂加入100 mL 70%甲醇(大孔樹脂)或pH 2 70%甲醇(陰離子樹脂)中，用UV和HPLC兩種方法檢測浸出液中總黃酮和金絲桃苷的濃度，計算解析率(表1)。根據(jù)表1中數(shù)據(jù)，選取FPA98陰離子交換樹脂進一步優(yōu)化制備澤漆總黃酮的工藝。

表1 不同樹脂對總黃酮和金絲桃苷的靜態(tài)吸附量和解析率(n=3)

2.3.2 FPA98樹脂吸附性能

(1)FPA98樹脂飽和吸附量的確定。FPA98樹脂4份(1 g)分別加至60 mL、80 mL、100 mL和120 mL澤漆提取液(pH 10)中，靜態(tài)吸附24 h后測液體中總黃酮濃度，計算FPA98樹脂的飽和吸附量。如圖2(A)所示，加入100 mL或更多提取液，樹脂達到飽和吸附狀態(tài)，提取液與樹脂的比例達100∶1(v/w)。

(2)吸附過程。將 1 g FPA98樹脂加入100 mL澤漆提取液(pH 10)中，間歇振蕩，每隔6 h取1 mL液體，UV測樹脂吸附總黃酮的量直至飽和為止，結(jié)果如圖2(B)所示，12 h即接近飽和吸附量，12～24 h吸附量增加緩慢。為了盡可能吸附金絲桃苷等黃酮，后續(xù)靜態(tài)實驗中吸附時間設(shè)為24 h。

圖2 FPA98樹脂靜態(tài)吸附參數(shù)圖

2.3.3 FPA98樹脂解析性能

(1)解析過程。將上述達飽和吸附狀態(tài)的樹脂加至100 mL 70%甲醇(pH 2)中，每隔6 h取1 mL UV檢測浸出液，計算總黃酮解析率，結(jié)果如圖3(A)所示，12 h解析率達82.0%，12～24 h解析率增長緩慢，24 h解析率達85.6%。

(2)甲醇含量的確定。將FPA98樹脂4份(1 g)分別加入100 mL的提取液中，靜置24 h后濾除液體。樹脂分別加入pH值為2的30%、50%、70%、90%的甲醇，UV檢測浸出液，計算總黃酮解析率，結(jié)果如圖3(B)所示，70%甲醇(pH 2)解析效率最高。

(3)洗脫液pH值的確定。將FPA98樹脂4份(1 g)分別加入100 mL的提取液中，靜置24h后濾除液體。樹脂分別加入pH值分別為1、2、3和4的70%甲醇，UV檢測，計算總黃酮解析率，結(jié)果如圖3(C)所示，pH 2的70%甲醇的解析效率最高。

圖3 FPA98樹脂靜態(tài)解析參數(shù)圖

2.3.4動態(tài)吸附泄露曲線考察

稱取FPA98樹脂40 g，置于玻璃層析柱中(2.5 cm × 24 cm)，澤漆提取液(0.6 mg/mL)上樣，流速1.5 mL/min，進行動態(tài)吸附。每0.5 L收集1次，UV和HPLC測流出液中總黃酮和金絲桃苷的含量，計算泄露曲線(圖4:A)。2.0 L后流出液中總黃酮含量明顯增加，未吸附的總黃酮比例超28%，3.5 L后流出液中總黃酮含量快速增加。金絲桃苷泄露比例在3.0 L后開始增加，4.0 L后快速增加，說明40 g FPA98樹脂對3.0 L左右澤漆提取液中的金絲桃苷具有比較充分的吸收。

2.3.5 動態(tài)解析曲線考察

最優(yōu)吸附條件上柱，充分吸收后用70%甲醇(pH 2)洗脫，流速1.0 mL/min，UV和HPLC測洗脫液中總黃酮和金絲桃苷的含量(圖4:B)。金絲桃苷的解析速度略慢于總黃酮，1.5 L 70%甲醇(pH 2)即可將2.3.4操作中所吸附的黃酮基本解析完全。

圖4 FPA98樹脂泄露曲線(A)和解析曲線(B)

2.3.6澤漆總黃酮的純化

利用HW-40C凝膠柱(3.0 cm × 25 cm)進一步純化澤漆總黃酮[3]，分別以25%和70%甲醇洗脫，流速2.0 mL/min。TLC跟蹤，25%甲醇(0.4 L)洗脫部位中幾乎無黃酮成分，收集70%甲醇洗脫部位，蒸除容積，得澤漆總黃酮。

FPA98陰離子樹脂制備產(chǎn)品中總黃酮和金絲桃苷含量分別為48.3%和10.3%，利用HW-40C凝膠柱進一步純化后，其含量分別為76.6%和17.7%。

2.4澤漆總黃酮對神經(jīng)細(xì)胞的保護作用[6-7]

測試2.4.6操作制備的總黃酮的神經(jīng)保護作用。將SH-SY5Y細(xì)胞(0.6 ×104個/孔)，加入96孔板中，5%CO2培養(yǎng)箱孵育過夜。次日加藥，設(shè)0.8，4.0，20 和100 μg/mL 4個濃度，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔，加藥4 h后魚藤酮(0.5 μmol/L)損傷細(xì)胞。繼續(xù)孵育48 h，離心，除去上清液后加入MTT，孵育反應(yīng)3～4 h。除去上清液，加入DMSO溶解。在酶標(biāo)儀上570 nm處檢測，計算抑制率。魚藤酮組細(xì)胞存活率為55.8%，澤漆總黃酮組的細(xì)胞存活率分別為53.4%，54.3%，59.0%和65.5%，金絲桃苷組(1 μmol/L)細(xì)胞存活率為78.3%。說明澤漆總黃酮具有一定程度的保護魚藤酮損傷SH-SY5Y細(xì)胞的作用，但其作用強度弱于單一成分金絲桃苷。

3 結(jié)論與討論

金絲桃苷等黃酮類化合物在抗炎、神經(jīng)保護、特別是心腦血管疾病方面具有良好的應(yīng)用潛力[1,8]。本文采用FPA98陰離子樹脂制備澤漆總黃酮，堿性提取液直接柱層析吸附，酸性甲醇水溶液洗脫，制備工藝簡單，產(chǎn)率高，產(chǎn)品中黃酮含量較高。由于柱層析過程中阻力較大，液體流速較慢，需要給與0.01 MPa左右的壓力，故未考察流速對吸附和解析的影響。經(jīng)HW-40C凝膠柱進一步純化后，澤漆總黃酮含量76.6%，其中金絲桃苷含量高達17.7%。經(jīng)凝膠柱純化后的澤漆總黃酮對魚藤酮損傷的SH-SY5Y細(xì)胞具有一定程度的保護作用，但作用強度弱于所含質(zhì)量的金絲桃苷，說明總黃酮中可能含有拮抗性成分，干擾了金絲桃苷的神經(jīng)保護作用，這需要進一步研究加以確證。本文為澤漆總黃酮在神經(jīng)保護及心腦血管疾病方面的應(yīng)用提供了初步的科學(xué)依據(jù)。

[1] 李錦松,陳劍鴻,孟民杰.金絲桃苷藥理作用及其作用機制的研究進展[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報,2015,31(2): 269-272.

[2] 王燕,王先榮,馬鳳余,等.金絲桃苷在植物中的分布及其含量測定[J].安徽醫(yī)藥,2009,13(11): 1312-1315.

[3] 湯建,楊守士,龔璽.澤漆作為制備2''-O-沒食子?；鸾z桃苷和金絲桃苷原料的應(yīng)用及制備方法: 103012521A [P].2013-04-03.

[4] 馬瑞麗,李敏,徐秀泉,等.大孔吸附樹脂制備尾葉香茶菜總二萜的工藝研究[J].中成藥,2014,36(4): 848-851.

[5] 歐陽玉祝,車少林,黃偉濤.大孔樹脂吸附法分離海金沙總黃酮的研究[J].中國野生植物資源,2010,29(6): 40-43.

[6] 馮波,王蓉,盛樹力.神經(jīng)退行性疾病研究中擬神經(jīng)細(xì)胞模型: 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤株 SH-SY5Y 的來源特性及應(yīng)用[J].中國臨床康復(fù),2006,10(6): 121-123.

[7] 崔群力,孫圣剛.姜黃素通過抗氧化作用拮抗魚藤酮致 PC12 細(xì)胞損傷的研究[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2010,39(1): 37-41.

[8] 林萍,易宏偉,張斐.金絲桃苷藥理作用研究進展[J].中國現(xiàn)代中藥,2012,14(10): 23-26.

PreparationProgressandNeuroprotectiveEffectofTotalFlavonoidsfromEuphorbiahelioscopia

Chen Jian,Xie Qing,Aun Raza,Tang Jian*,Ouyang Zhen

(School of Pharmacy,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China)

To prepare total flavonoids ofEuphorbiahelioscopia,three types of ion exchange resins and three types of macroporous resins were studied in adsorption and desorption tests,according to the contents of total flavonoids and hyperoside.The resin FPA98 and eluent of 70% methanol (pH 2) were selected,with the liquid-resin ratio 100∶1 (v/w).One gram of resin FPA98 could adsorb 47.86 mg of total flavonoids,with desorption ratio of 88.7%.The contents of total flavonoids and hyperoside were 48.3% and 10.3%.The purified total flavonoids fromE.helioscopiahad good neuroprotective effect on the SH-SY5Y cells.

Euphorbiahelioscopia; anion exchange resin; total flavanoid; hyperoside; neuroprotective effect

10.3969/j.issn.1006-9690.2017.05.006

2017-01-08

國家自然基金(81573529); 江蘇省中醫(yī)藥局科技項目(YB2015186)。

陳健，主要從事天然活性成分分離鑒定研究。E-mail: chenjian1993@outlook.com

*通訊作者：湯建,E-mail: jt.u@hotmail.com

R285

A

1006-9690(2017)05-0024-03