陳思琦 簡金晶 張 妍 戴錫玲

(上海師范大學生命與環(huán)境科學學院，上海 200234)

銀粉背蕨配子體及幼孢子體發(fā)育的研究

陳思琦 簡金晶 張 妍 戴錫玲*

(上海師范大學生命與環(huán)境科學學院，上海 200234)

銀粉背蕨是一種小型觀賞蕨類植物，但目前我國對該蕨的研究還不夠成熟。本文利用改良Knop’s培養(yǎng)基和腐殖土培養(yǎng)銀粉背蕨的孢子，觀察其配子體及幼孢子體形態(tài)發(fā)育特征，并研究了其配子體發(fā)育的最適培養(yǎng)基pH值。研究結(jié)果顯示：(1)銀粉背蕨孢子黃褐色，具三裂縫，極面觀三角圓形，赤道面觀為近半圓形，孢子具網(wǎng)狀紋飾；孢子萌發(fā)為書帶蕨型；原葉體發(fā)育為水蕨型；頸卵器和精子器為薄囊蕨型；成熟原葉體為對稱的心臟形，不具毛狀體；上述特征為銀粉背蕨孢子和配子體發(fā)育的穩(wěn)定特征。(2)培養(yǎng)基pH值在7.0～9.0時隨著堿性的增強，銀粉背蕨孢子萌發(fā)和配子體生長發(fā)育速度逐漸增加。(3)利用腐殖土培養(yǎng)銀粉背蕨孢子，7～8周可發(fā)育成幼葉，成苗率達90%，成苗健壯，根系發(fā)達，是擴繁銀粉背蕨的適宜方式。本文為資源植物銀粉背蕨人工繁殖和演化研究提供科學依據(jù)。

銀粉背蕨；配子體發(fā)育；幼孢子體；pH值

銀粉背蕨(Aleuritopterisargentea(Gmel.) Fee)為中國蕨科(Sinopteridaceae)粉背蕨屬(Aleuritopteris)植物[1]；因其株型小巧且環(huán)境適應性強，葉形奇特，葉背為獨特的銀白色，是難得的一種小型觀賞蕨類[2]。同時，銀粉背蕨還具有活血調(diào)經(jīng)，補虛止咳的藥用價值[3]。

王琳等[4]首先以銀粉背蕨葉柄為材料誘導愈傷組織，建立無性系，研究顯示試管苗移栽到爐灰渣后生長最佳。此后，黃迪等[5]對銀粉背蕨配子體發(fā)育各階段的形態(tài)特征進行初步觀察的同時，研究孢子貯藏時間、培養(yǎng)基質(zhì)、無機鹽濃度和蔗糖濃度等培養(yǎng)條件對銀粉背蕨孢子萌發(fā)、配子體發(fā)育及孢子體成苗的影響，結(jié)果表明常規(guī)培養(yǎng)基質(zhì)中泥炭土和河沙的混合基質(zhì)是銀粉背蕨孢子萌發(fā)和生長的最佳基質(zhì)；無菌培養(yǎng)條件下MS培養(yǎng)基是最適培養(yǎng)基，4%的蔗糖添加對原葉體增殖和發(fā)育最佳。銀粉背蕨具有如此突出的觀賞和藥用價值，但目前我國對銀粉背蕨的研究還并不是十分完善。例如，在各種影響孢子萌發(fā)和配子體發(fā)育的環(huán)境條件中基質(zhì)pH值常常被忽視。大多數(shù)蕨類植物的孢子培養(yǎng)基(液)pH值在5.0～7.0[6]，但不同種類植物孢子萌發(fā)所需要的培養(yǎng)基(液)的最適pH值范圍存在差異[7]，因此，在孢子培養(yǎng)時需要確定培養(yǎng)基的最適pH值范圍。

在保護野生蕨類資源和豐富我國資源蕨類植物的背景下，本文利用改良Knop’s培養(yǎng)基和腐殖土培養(yǎng)銀粉背蕨的孢子，詳細觀察其孢子萌發(fā)、配子體以及幼孢子體各發(fā)育階段的形態(tài)特征，并研究銀粉背蕨配子體發(fā)育的最適培養(yǎng)基pH值，為資源植物銀粉背蕨演化研究和人工繁殖提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

銀粉背蕨的孢子于2014年7月采自浙江大明山巖石縫中，憑證標本保存在上海師范大學蕨類植物標本室。

1.2 方法

改良Knop’s培養(yǎng)基無菌培養(yǎng)。將3%次氯酸鈉溶液倒入放有孢子的離心管中充分震蕩搖勻后離心，無菌水漂洗3遍，在超凈臺上接種于改良Knop’s[8]培養(yǎng)基上。置于ZRX-300E型智能人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光照12 h，光照強度2 000 lux，溫度為25±1℃，濕度為60%～70%。重復培養(yǎng)3次，每次5份。精子用魯哥氏染液固定染色[9]。在配子體發(fā)育各個階段用Nikon E800型光學顯微鏡進行活體觀察并拍照。

在配制好的改良Knop’s培養(yǎng)基中加入1 mol·L-1的NaOH和HCl溶液，用PHSJ-4F型酸度計測培養(yǎng)基pH值，配制成pH值為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的6個組，并分別標記為1～6組。每組接種5個培養(yǎng)皿(蓋直徑60 mm)。

對商用腐殖土進行高溫滅菌處理后，冷卻到室溫。將孢子用3%次氯酸鈉溶液消毒，清洗后將孢子放入噴壺中加蒸餾水，充分搖晃，均勻地噴灑在腐殖土表面。用帶孔的保鮮膜將培養(yǎng)皿進行封口，以保持土壤中的水分。待土壤中的銀粉背蕨原葉體長出幼孢子體時，在解剖鏡下，用解剖針輕輕挑起原葉體，快速栽入準備好的花盆中。花盆中從下到上為鵝卵石、砂土和商用腐殖土以1∶1∶3的層次比例放置。并在花盆底放置有水的托盤，保持土壤濕度。用帶孔的保鮮膜將花盆進行封口。將移栽好的植株放在朝陽處室溫培養(yǎng)，定期澆水，保持土壤濕潤。

2 觀察結(jié)果

2.1 銀粉背蕨配子體和幼孢子體的發(fā)育

2.1.1 孢子及孢子萌發(fā)

孢子黃褐色，具三裂縫，呈輻射對稱；極面觀三角圓形，赤道面觀近半圓形；孢子極軸長47～50 μm，赤道軸長50.5～53 μm；孢子表面具網(wǎng)狀紋飾(圖版Ⅰ：1～2)。

接種5～7 d后，孢子壁沿三裂縫開裂，孢子細胞分裂產(chǎn)生一個原葉體原始細胞，其內(nèi)充滿葉綠體，標志著孢子萌發(fā)；此時孢子壁常裂成3瓣，其中1瓣常頂在絲狀體前端(圖版Ⅰ：3)。假根從孢子的三裂縫處伸出。銀粉背蕨的孢子萌發(fā)類型為書帶蕨型(Vittaria-type)[10]。

2.1.2 絲狀體和片狀體

孢子接種7～12 d后，原葉體原始細胞通過平行于極軸的分裂產(chǎn)生基細胞和原葉體細胞，形成3個細胞的絲狀體(圖版Ⅰ：4)；基細胞不分裂，原葉體細胞橫向分裂后縱向分裂產(chǎn)生2列細胞的絲狀體。絲狀體粗壯，長約3～7個細胞，細胞短桶形，其內(nèi)葉綠體較多，絲狀體基部產(chǎn)生2～3條假根。絲狀體頂端常不出現(xiàn)楔形的頂端細胞。絲狀體前端的細胞均處于分裂狀態(tài)而成為分散生長，形成具長柄的匙形片狀體(圖版Ⅰ：5)。

2.1.3 原葉體

孢子接種17～20 d后，在片狀體一側(cè)的邊緣細胞產(chǎn)生多細胞分生組織，分生組織分裂發(fā)育成幼原葉體(圖版Ⅰ：6)。幼原葉體前端內(nèi)凹，具左右明顯不對稱的兩翼，兩翼向斜上方伸展，較大的翼常具波狀緣(圖版Ⅰ：7)。

接種約35 d后，原葉體發(fā)育成熟。成熟原葉體為對稱的倒卵狀心臟形，兩翼強力向原葉體上方擴展，邊緣具圓鈍的突起，后端尾尖；心臟形凹陷處兩翼相互重疊，不具毛狀體，原葉體寬大于長，大小為1～1.4 mm×1.2～1.6 mm(圖版Ⅰ：8)。原葉體細胞中的橢圓形葉綠體清晰可見，分布均勻(圖版Ⅰ：11)。銀粉背蕨配子體發(fā)育類型為水蕨型(Ceratopteris-type)[10]。

圖版Ⅰ 銀粉背蕨配子體的發(fā)育 1～2.孢子；3.孢子萌發(fā)；4.絲狀體；5.片狀體；6～7.幼原葉體；8.成熟原葉體；9～10.頸卵器；11.原葉體的葉綠體；12～14.精子器；15.假根；16.精細胞；17.游動精子PlateⅠ Gametophyte development of A.argentea 1-2.Spore; 3.Spore germination; 4.Protonema; 5.Plate; 6-7.Young prothallus; 8.Mature prothallus; 9-10.Archegonium; 11.The chloroplasts in prothallus; 12-14.Antheridium; 15.Rhizoids; 16.Spermatid; 17.Spermatozoid

2.1.4 性器官

銀粉背蕨多數(shù)為雌雄同株。接種約5～7周后出現(xiàn)性器官。頸卵器多分布在生長點附近。頂面觀可見頸卵器具4列頸壁細胞(圖版Ⅰ：9)，頸卵器頸部直徑約56～59 μm，為5層細胞高(圖版Ⅰ：10)。精子器分布于假根叢中或原葉體邊緣。側(cè)面觀精子器圓柱狀，由3個細胞(蓋細胞、環(huán)細胞和基細胞)組成，高約50～55 μm，其中基細胞最大，蓋細胞最小(圖版Ⅰ：12)；頂面觀精子器近圓形，直徑約50 μm，其內(nèi)球形的精細胞清晰可見，直徑約14～15 μm(圖版Ⅰ：13)。精子器成熟時，蓋細胞大多孔裂，球形精細胞溢出(圖版Ⅰ：14，16)。精細胞外膜解體，精子釋放出來，精子呈螺旋形，具多根鞭毛(圖版Ⅰ：17)。

2.1.5 假根

次生假根多發(fā)生在原葉體的基部和邊緣，為單細胞管狀，直徑約11～12 μm，部分假根前端膨大或呈螺旋狀；假根內(nèi)偶有代謝物積累，呈黃褐色(圖版Ⅰ：15)。

2.1.6 幼孢子體

經(jīng)過2～3周的腐殖土培養(yǎng)，銀粉背蕨孢子發(fā)育為肉眼可見的幼原葉體階段，原葉體顏色較培養(yǎng)基中培養(yǎng)的原葉體顏色更為深綠(圖版Ⅱ：1)。接種30 d后，發(fā)育為心形幼原葉體(圖版Ⅱ：2)。接種35 d后，原葉體成熟且體積增加，平均長1.8 mm，寬2.4 mm(圖版Ⅱ：3)。接種45 d后，成熟原葉體完成受精作用，發(fā)育到幼孢子體階段。原葉體上長出的幼態(tài)葉呈團扇形，葉緣光滑，無毛狀體等附屬物(圖版Ⅱ：4)，光學顯微鏡下可觀察到幼態(tài)葉表面有氣孔分布(圖版Ⅱ：5)。接種8～9周后，每個配子體長出2～3個幼態(tài)葉，且原葉體逐漸變黃，此時是移栽的最佳時期。在解剖鏡下，將銀粉背蕨以配子體為單位的幼孢子體以3×3的排列方式移栽到直徑12 cm的花盆中(圖版Ⅱ：6)。

圖版Ⅱ 銀粉背蕨孢子的土壤繁殖 1～2.幼原葉；3.成熟原葉體；4.幼態(tài)葉；5.幼態(tài)葉上的氣孔；6～11.分苗后的幼孢子葉發(fā)育過程；12.根系；13.土培苗PlateⅡ Soil propagation of spore in A.argentea 1-2.Young prothallus; 3.Mature prothallus; 4.Young leaf; 5.Stoma in the young leaf; 6-11.Different stages of young sporophytes; 12.Root system; 13.Sporophytes seedlings cultured in the soil

移栽3周后，幼孢子葉逐漸變大，葉緣開始內(nèi)陷出現(xiàn)深裂(圖版Ⅱ：7)。移栽6周后，幼孢子葉繼續(xù)變大，葉緣葉裂加深，在原葉體上繼續(xù)長出1～2個幼孢子葉(圖版Ⅱ：8)。移栽10周后，幼孢子葉的葉緣內(nèi)陷呈三裂，寬約3～4 mm(圖版Ⅱ：9)。移栽14周后，葉片基部裂片繼續(xù)分裂，發(fā)育為掌狀五裂的幼孢子葉(圖版Ⅱ：10)。移栽5個月后，孢子葉背部開始出現(xiàn)白色粉狀物，不定根系發(fā)達，粗壯，多分支(圖版Ⅱ：11～12)。經(jīng)粗略統(tǒng)計，銀粉背蕨孢子土培萌發(fā)率約為70%以上，成苗率可達90%(圖版Ⅱ：13)。

2.2 培養(yǎng)基pH值對銀粉背蕨配子體發(fā)育的影響

利用不同pH值培養(yǎng)基培養(yǎng)銀粉背蕨的孢子，其孢子萌發(fā)和配子體發(fā)育存在顯著差異(表1)。接種1周后，第1組的孢子未萌發(fā)；第2～6組的孢子萌發(fā)，并發(fā)育為絲狀體，其中第6組的絲狀體發(fā)育最快。接種3周后，第1組的孢子萌發(fā)，長成約2個細胞的絲狀體，第2～3組處于絲狀體末期，且產(chǎn)生具分支片狀體，兩分支發(fā)育不同步。第4組的配子體發(fā)育到片狀體末期，第5～6組已發(fā)育成幼原葉體。接種后第5周，第1～3組發(fā)育成幼原葉體，第4～6組原葉體發(fā)育成熟，且已受精。

第1組因pH值偏低，培養(yǎng)基未完全凝固，只有部分孢子萌發(fā)，且生長十分緩慢。第6組孢子最先萌發(fā)，配子體發(fā)育速度最快，少有畸形配子體出現(xiàn)。因此，培養(yǎng)基pH值在7.0～9.0時隨著堿性的增強，銀粉背蕨的孢子萌發(fā)和配子體生長發(fā)育速度逐漸增加。因此，銀粉背蕨孢子培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基pH值范圍為7.0～9.0。

3 討論

本文研究結(jié)果表明，銀粉背蕨孢子具三裂縫，呈輻射對稱，孢子萌發(fā)為書帶蕨型，原葉體發(fā)育為水蕨型，絲狀體、片狀體、頸卵器和精子器的形態(tài)，成熟原葉體為裸露的對稱心臟形等特征與黃笛等[5]的研究基本一致；但在孢子表面紋飾、成熟原葉體邊緣形態(tài)、性器官出現(xiàn)時間和假根直徑等方面存在差異，可能與粉背蕨屬植物配子體發(fā)育過程中變異性極大[10]、培養(yǎng)環(huán)境條件以及觀察手段等因素有關?？梢?，銀粉背蕨的孢子對稱性和萌發(fā)類型、原葉體發(fā)育類型、絲狀體、片狀體、性器官的形態(tài)等是相對穩(wěn)定的形態(tài)特征，可以用于分類和演化研究。

銀粉背蕨的孢子體生長在石灰?guī)r石縫或墻縫中[1]，其配子體在pH4.0～9.0的培養(yǎng)基中都可以生長，但在最適pH7.0～9.0的堿性培養(yǎng)基中萌發(fā)快，配子體發(fā)育速度快，生長狀態(tài)良好。小黑桫欏(Alsophilametteniana)孢子體生長在臺灣、福建、廣東、貴州、四川、云南、江西等山坡林下、溪旁或溝邊[11]，其孢子萌發(fā)和配子體發(fā)育需要在pH值3.7～6.7的酸性土壤進行[12]。同樣生于山麓溝邊及林下陰處酸性土上的金毛狗(Cibotiumbarometz)在pH值為3.0～6.0時孢子能夠萌發(fā)形成配子體，而在pH為7.0時不萌發(fā)[13～14]。因此，蕨類植物配子體和孢子體的生境酸堿范圍具有相對一致性，在孢子培養(yǎng)時可以根據(jù)孢子體的生長環(huán)境確定其配子體的基質(zhì)最適pH值范圍，使人工孢子培養(yǎng)易于成功。

人工孢子繁殖在資源蕨類植物應用方面前景廣闊。黃笛等[5]用4種常規(guī)基質(zhì)(草炭土、園土、蛭石、混合基質(zhì))培養(yǎng)銀粉背蕨孢子，其中混合基質(zhì)(泥炭土+河沙1∶1)的萌發(fā)率達65%以上，成苗率達83.2%，從播孢到小苗形成需要8周時間。王琳等[4]以銀粉背蕨葉柄為材料，經(jīng)過組織培養(yǎng)產(chǎn)生的試管苗移栽成活需要6個月左右。本研究將銀粉背蕨孢子于商用腐殖土中培養(yǎng)，孢子萌發(fā)率為70%以上，成苗率高達90%，7～8周成苗，且成苗粗壯，葉片健康，根系發(fā)達?？梢姡鄬τ谠跓o機培養(yǎng)基中的無菌培養(yǎng)和常規(guī)組織培養(yǎng)，腐殖土培養(yǎng)具有操作簡單，不需要繁雜的接種和移栽馴化等步驟，生長周期短，成活率高，成苗發(fā)育好且成本低等優(yōu)勢，腐殖土還具有良好的保水力，透氣性和養(yǎng)分充足供應[5]等優(yōu)點。因此，利用腐殖土擴繁銀粉背蕨對于其商業(yè)化規(guī)模擴繁具有現(xiàn)實意義。

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The Shanghai Natural Science Foundation(15ZR1430500)；The issue of Shanghai science and technology committee (14DZ2260400)；The problem of Shanghai Administration on City Appearance and Environmental Sanitation(G152430)；The Innovation project of University Students of Shanghai Municipal Education Commission(A-9103-14-007111)

introduction：CHEN Si-Qi(1995—),female,undergraduate,mainly study on artificial cultivation of ferns.

date:2016-09-09

DevelopmentofGametophyteandYoungSporophyteoftheFernAleuritopterisargentea

CHEN Si-Qi JIAN Jin-Jing ZHANG Yan DAI Xi-Ling*

(College of Life and Environment Sciences,Shanghai Normal University,Shanghai 200234)

Aleuritopterisargenteais a small ornamental ferns. We observed the developmental features of gametophyte and sporophyte ofA.argenteacultured in Knop’s medium and humus medium using microscopical techniques, and studied the optimum pH value for the gametophyte development. The results show that: (1)the spores are yellow-brown, tetrahedral, and trilete with reticulate ornamentations. Polar view is triangle circle and the equatorial view is nearly semicircular. The germination is Vittaria-type and the gametophyte development is Ceratopteris-type. The mature gametophytes are cordate. The archegonia and antheridia are leptosporangiate-type. No hairs are formed during gametophyte development. The above features of the gametophytes in the fernA.argenteaare stable. (2)the enhancement the pH value in 7.0-9.0 is beneficial for spore germination and gametophyte development. (3)the spore and gametophytes develop on humus medium produced seedlings after 7-8 weeks. The viability of sporophytes obtain in this medium are strong with developed roots and easy to transplant. Percentage of seedling emergency reaches to 90%. Our investigation is benefit for the artificial propagation and evolution of the resource plantA.argentea.

Aleuritopterisargentea；gametophyte development；young sporophyte；pH

上海市自然科學基金(15ZR1430500)；上海市科學技術委員會課題(14DZ2260400)；上海市綠化市容管理局科學技術攻關項目(G152430)；上海市教育委員會大學生創(chuàng)新項目(A-9103-14-007111)

陳思琦(1995—)，女，本科，主要從事蕨類植物人工培養(yǎng)方面的研究

* 通信作者：E-mail:daixiling2010@shnu.edu.cn

2016-09-09

* Corresponding author：E-mail:daixiling2010@shnu.edu.cn

S682.35

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.01.002