王麗榮，陳 雷，孫明杰，陳 靜，谷 巍

（山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東泰安 271000）

兩株芽孢桿菌聯(lián)合發(fā)酵黃芪對育雛蛋雞免疫機能的影響

王麗榮，陳 雷，孫明杰，陳 靜，谷 巍

（山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東泰安 271000）

為優(yōu)化解淀粉芽孢桿菌及地衣芽孢桿菌發(fā)酵黃芪條件，并研究黃芪發(fā)酵制劑對育雛蛋雞免疫機能的影響。本試驗以菌體生物量及黃芪多糖增率為指標(biāo)，通過培養(yǎng)時間、溫度及pH進(jìn)行優(yōu)化，獲得芽孢桿菌發(fā)酵黃芪的最佳條件，再將發(fā)酵制劑以不同的劑量添加至蛋雞飼料中，研究其對育雛蛋雞免疫機能的影響。結(jié)果顯示：最優(yōu)發(fā)酵條件為初始pH 5.0，培養(yǎng)溫度36℃，培養(yǎng)時間28 h，接種黃芪質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%；蛋雞35、42日齡時，3‰發(fā)酵黃芪組的脾臟指數(shù)比對照組分別提高40.7%、36.7%（P＜0.05）；添加未發(fā)酵黃芪組脾臟指數(shù)與對照組差異不顯著（P>0.05），與3‰發(fā)酵黃芪組差異顯著（P＜0.05）；法氏囊指數(shù)在蛋雞35日齡時，3‰發(fā)酵黃芪組比對照組和未發(fā)酵黃芪組分別提高24.8%和22.37%（P＜0.05）；3‰發(fā)酵黃芪組可顯著提高蛋雞血清中免疫球蛋白的含量（P＜0.05）；35、42日齡時，3‰發(fā)酵黃芪組的IgG含量比對照組分別提高12.3%、14.5%（P＜0.05）。研究表明，芽孢桿菌發(fā)酵黃芪制劑，能夠提高育雛蛋雞的免疫機能。

芽孢桿菌；黃芪；發(fā)酵；育雛蛋雞；免疫功能

黃芪屬豆科植物，又名黃耆，味干、性溫，集補氣與食療的藥食兩用功效于一體，是我國傳統(tǒng)的中草藥之一。黃芪含黃芪多糖（APS）、生物堿、黃酮、葉酸以及多種微量元素，具有較強的抗氧化作用（楊五彪等，2005），其中黃芪多糖是近年來研究和開發(fā)的熱點（單體中等，2006）。

研究表明，地衣芽孢桿菌可以通過促進(jìn)腸道優(yōu)勢菌群的生長而提高營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，具有明顯的促生長作用和降低料重比的功能 （郝生宏，2008；Abdulrahim，1999）。 芽孢桿菌發(fā)酵在一定程度上會對中草藥成分進(jìn)行利用和轉(zhuǎn)化，促使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)釋放出來，并能消除中草藥中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，同時中草藥中的某些成分可促進(jìn)或抑制代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，減少對動物消化利用的障礙。研究表明，發(fā)酵黃芪可以提高動物體免疫球蛋白的含量（韓宇，2012；Ducle，2004）。近年來，黃芪以其出眾的免疫調(diào)節(jié)功效贏得越來越多的關(guān)注。

本研究旨在優(yōu)化解淀粉芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌聯(lián)合發(fā)酵黃芪條件及發(fā)酵制劑對蛋雞免疫機能的影響，為黃芪發(fā)酵制劑在蛋雞生產(chǎn)中的應(yīng)用提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 中草藥 黃芪，購于山東省泰安市龍?zhí)洞笏幏俊?/p>

1.1.2 菌株 解淀粉芽孢桿菌BLCC1-0065（水8）、地衣芽孢桿菌 BLCC1-0014（dy7），均由山東寶來利來生物工程股份有限公司生物研究院菌種保藏中心保藏。

1.1.3 培養(yǎng)基 芽孢桿菌液體培養(yǎng)基：葡萄糖0.2%、蛋白胨1%、氯化鈉0.5%、酵母膏0.5%、pH 7.0，121℃高壓蒸汽滅菌 20 min，固體培養(yǎng)基需要加入1.5%瓊脂粉。上述百分?jǐn)?shù)均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.1.4 試驗動物 選用1日齡海蘭褐健康蛋公雞150羽（購自泰安市東岳種禽有限公司），按照常規(guī)程序免疫后進(jìn)行試驗，基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.2 試驗方法

1.2.1 芽孢桿菌發(fā)酵黃芪條件的優(yōu)化 菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化，包括黃芪質(zhì)量濃度、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基溫度、培養(yǎng)pH。

1.2.1.1黃芪質(zhì)量濃度優(yōu)化 在無菌條件下，將芽孢桿菌種子液分別按照體積比2%的接種量，分別接入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 4.0%、6.0%、8.0%、10.0%、12.0%、14.0%、16.0%的黃芪水溶液中，37℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。采用芽孢桿菌活菌數(shù)、黃芪多糖增率進(jìn)行黃芪質(zhì)量濃度的篩選確定。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.2.1.2 培養(yǎng)時間優(yōu)化 在無菌條件下，將芽孢桿菌種子液分別按照體積比2%的接種量，分別接入到由1.2.1.1得出的黃芪質(zhì)量濃度培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min 振蕩培養(yǎng) 20、24、28、32、36、40 h。 采用芽孢桿菌活菌數(shù)、黃芪多糖增率進(jìn)行培養(yǎng)時間的篩選確定。

1.2.1.3 培養(yǎng)溫度優(yōu)化 在無菌條件下，將芽孢桿菌種子液分別按照體積比2%的接種量，分別接入到由1.2.1.1得出的黃芪質(zhì)量濃度培養(yǎng)基中，按照1.2.1.2得出的培養(yǎng)時間，分別置于30、33、37、40、43℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)。采用芽孢桿菌活菌數(shù)、黃芪多糖增率進(jìn)行培養(yǎng)溫度的篩選確定。

1.2.1.4 培養(yǎng)pH優(yōu)化 在無菌條件下，將芽孢桿菌種子液分別按照體積比2%的接種量，分別接入到1.2.1.1得出的黃芪質(zhì)量濃度培養(yǎng)基中，用0.5N NaOH和0.5N HCL將培養(yǎng)基pH分別調(diào)為5、5.5、6、6.5、7， 按照 1.2.1.2 得出的最佳培養(yǎng)時間、1.2.1.3得出的培養(yǎng)溫度，220 r/min振蕩培養(yǎng)。采用芽孢桿菌活菌數(shù)、黃芪多糖增率進(jìn)行培養(yǎng)pH的篩選確定。

1.2.2 發(fā)酵黃芪對育雛蛋雞影響試驗

1.2.2.1 試驗設(shè)計 將150只1日齡海蘭褐蛋雞隨機分成5組，分別為對照組CK（飼喂基礎(chǔ)日糧）、試驗Ⅰ組（基礎(chǔ)日糧添加0.5‰的發(fā)酵黃芪粉劑）、試驗Ⅱ組（基礎(chǔ)日糧添加1‰的發(fā)酵黃芪粉劑）、試驗Ⅲ組（基礎(chǔ)日糧添加3‰的發(fā)酵黃芪粉劑）和試驗Ⅳ組（基礎(chǔ)日糧添加3‰的未發(fā)酵黃芪粉劑），每組3個平行，預(yù)飼1周后，連續(xù)7 d飼喂添加相應(yīng)添加劑的飼料。

1.2.2.2 飼料制備 購買成品蛋雞飼料后磨碎，分別加入相應(yīng)劑量添加劑后重新制粒。

1.2.2.3 免疫器官指數(shù)測定 分別于 28、35、42日齡稱重后處死雞只，立即取出脾臟和法氏囊，用濾紙吸干血液后稱重。

脾臟（法氏囊）指數(shù)/（mg/g）=脾臟（法氏囊）重量/雞體重。

1.2.2.4 免疫因子的檢測 殺雞后取血，將血液靜置離心后，獲得血清，測IgG指標(biāo)，具體按照雞IgG ELISA試劑盒說明書的操作步驟進(jìn)行，試劑盒購于北京鑫方程生物科技有限公司。

1.3 數(shù)據(jù)分析 試驗結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行單因素方差分析和多重比較。

2 試驗結(jié)果

2.1 黃芪濃度對芽孢桿菌活菌數(shù)及多糖增率的影響 由表2可知，當(dāng)芽孢桿菌水8、dy7在黃芪質(zhì)量濃度為8%時，黃芪多糖增率最高 （且為正值），隨著黃芪質(zhì)量濃度的增加，其黏度亦變大，且兩株芽孢菌活菌數(shù)均較高，故確定黃芪質(zhì)量濃度8%為最佳發(fā)酵濃度。

表2 黃芪濃度對芽孢桿菌活菌數(shù)及多糖增率的影響

2.2 培養(yǎng)時間對芽孢桿菌活菌數(shù)及多糖增率的影響 由表3可知，在黃芪質(zhì)量濃度8%條件下，發(fā)酵時間28 h，芽孢桿菌水8、dy7的活菌數(shù)最高，且多糖增率降低較少，故確定發(fā)酵時間28 h為最佳培養(yǎng)時間。

2.3 培養(yǎng)溫度對芽孢桿菌活菌數(shù)及多糖增率的影響 由表4可知，在黃芪質(zhì)量濃度為8%、發(fā)酵時間28 h條件下，培養(yǎng)溫度為36℃時，芽孢桿菌水8、dy7的活菌數(shù)最高且多糖增率較高，故確定培養(yǎng)溫度36℃為最佳培養(yǎng)溫度。

表3 培養(yǎng)時間對芽孢桿菌活菌數(shù)及多糖增率的影響

表4 培養(yǎng)溫度對芽孢桿菌活菌數(shù)及多糖增率的影響

2.4 pH對芽孢桿菌活菌數(shù)及多糖增率的影響由表5可知，在黃芪濃度為8%，發(fā)酵時間28 h，培養(yǎng)溫度36℃條件下，pH為5.0時，芽孢桿菌水8、dy7的活菌數(shù)最高且多糖增率較高，故確定pH 5.0為最佳培養(yǎng)pH。

表5 pH對芽孢桿菌活菌數(shù)及多糖增率的影響

2.5 發(fā)酵黃芪制劑對海蘭褐蛋雞脾臟指數(shù)的影響 從表6可以看出，與對照組CK相比，試驗Ⅲ組脾臟指數(shù)在28、35、42日齡分別提高47.02%、40.7%、36.7%（P＜0.05）；試驗Ⅳ組脾臟指數(shù)在28、35、42日齡分別比對照組提高27.15%、8.94%、4.59%（P＞0.05）；試驗Ⅲ組的脾臟指數(shù)在28、42日齡比試驗Ⅳ組分別提高15.63%和30.70%（P＜0.05），說明發(fā)酵黃芪在提高脾臟指數(shù)方面試驗Ⅲ組效果較好。

表6 發(fā)酵黃芪對蛋雞脾臟指數(shù)的影響mg/g

2.6 發(fā)酵黃芪制劑對海蘭褐蛋雞法氏囊指數(shù)的影響 從表7可以看出，試驗Ⅱ組及試驗Ⅲ組法氏囊指數(shù)在35、42日齡分別比對照組提高12.08%、20.09%和24.83%、37.22%（P＜0.05）。 試驗Ⅳ組法氏囊指數(shù)與對照組相比差異不顯著（P＞0.05），試驗Ⅱ組及試驗Ⅲ組法氏囊指數(shù)在35日齡分別比試驗Ⅳ組高9.87%和22.37%（P＜0.05）。說明發(fā)酵黃芪在提高法氏囊指數(shù)方面較未發(fā)酵黃芪效果較好，其中發(fā)酵黃芪Ⅲ組效果最好。

表7 發(fā)酵黃芪對蛋雞法氏囊指數(shù)的影響mg/g

2.7 發(fā)酵黃芪制劑對海蘭褐蛋雞血清IgG的影響 從表8可以看出，試驗Ⅲ組蛋雞血清中免疫球蛋白的含量顯著提高（P＜0.05），其中35日齡時，試驗Ⅲ組的IgG含量比對照組顯著提高12.3%；42日齡時，試驗Ⅲ組的IgG含量比對照組顯著提高14.5%。試驗Ⅳ組IgG含量與對照組差異不顯著（P＞0.05），略差于發(fā)酵黃芪組，說明在提高免疫球蛋白方面，發(fā)酵黃芪組優(yōu)于未發(fā)酵黃芪組。

表8 發(fā)酵黃芪對蛋雞血清IgG的影響

3 討論

3.1 發(fā)酵黃芪制劑對海蘭褐蛋雞免疫器官指數(shù)的影響 脾臟是雞體內(nèi)最大的外周免疫器官，法氏囊是禽類B淋巴細(xì)胞發(fā)育成熟的器官，兩者參與全身的體液免疫和細(xì)胞免疫，器官指數(shù)的增加表明機體的免疫機能提高。脾臟、法氏囊指數(shù)可以用來評價雛雞的免疫水平和狀況。黃芪多糖能夠增強免疫器官和細(xì)胞的功能，還能刺激細(xì)胞因子的釋放，影響神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)，促進(jìn)相關(guān)基因的合成和表達(dá)（陸新浩等，2008）。研究表明，黃芪多糖能夠作用于多種免疫器官，增加器官質(zhì)量，提高臟器指數(shù)，還能夠促進(jìn)部分臟器的發(fā)育。單俊杰等（2000）研究發(fā)現(xiàn)，補充黃芪多糖能提高小鼠胸腺的質(zhì)量。胡曉燕（2011）在對運動性免疫抑制調(diào)理研究中發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖能拮抗遞增負(fù)荷訓(xùn)練大鼠的胸腺萎縮。安松蘭（2007）用不同劑量的黃芪多糖刺激環(huán)磷酰胺處理的小鼠，結(jié)果表明，脾臟及胸腺指數(shù)均有增加；此外黃芪多糖還能促進(jìn)雞法氏囊和脾臟的發(fā)育。

本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，試驗Ⅲ組（3‰發(fā)酵黃芪組）海蘭褐蛋雞脾臟、法氏囊指數(shù)顯著提高，其中35日齡時，試驗Ⅲ組（3‰發(fā)酵黃芪組）的脾臟指數(shù)比對照組顯著提高40.7%；試驗Ⅲ組（3‰發(fā)酵黃芪組）的法氏囊指數(shù)比對照組顯著提高24.8%。這說明3‰添加量的發(fā)酵黃芪制劑能提高海蘭褐蛋雞的免疫水平。

3.2 發(fā)酵黃芪制劑對海蘭褐蛋雞血清IgG的影響 IgG為體液內(nèi)主要的免疫球蛋白，約占血液中免疫球蛋白總量的70%～75%，在免疫應(yīng)答中可激活補體，中和多種毒素，并且在結(jié)合補體、增強免疫細(xì)胞吞噬病原微生物中和細(xì)菌毒素方面具有重要作用。項杰（2007）研究表明，給感染李斯特菌的小鼠注射黃芪多糖，其血清中IgG濃度顯著提高，說明黃芪多糖可以促進(jìn)B細(xì)胞的活化和增殖，增強宿主的體液免疫和細(xì)胞免疫來保護(hù)宿主抵抗病原菌的感染。另外，黃芪中的多糖成分還可以誘導(dǎo)干擾素的產(chǎn)生和參與免疫調(diào)節(jié) （鄧曼，2007）。王志祥等 （2006）在肉仔雞日糧中添加0.2%或0.3%的黃芪提取物發(fā)現(xiàn)，肉仔雞日增重和飼料轉(zhuǎn)化率、肉仔雞的胸腺指數(shù)、法氏囊指數(shù)和脾臟指數(shù)顯著提高，血清丙二醛含量降低。黃芪中多糖成分可以提高雞傳染性法氏囊、禽流感疫苗的免疫效果，提高抗體水平，增強對病侵襲的抵抗力（陸新浩等，2008；王旭貞等，2007）。楊松等（2012）在禽流感免疫期間給肉雞口服黃芪多糖，以研究黃芪多糖對禽流感疫苗免疫效果的影響，結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)高劑量和低劑量的黃芪多糖均能提高AI血凝抑制試驗抗體的效價，并且可以提高肉雞的免疫器官指數(shù)和生產(chǎn)性能。

本研究中，在蛋雞35、42日齡時，試驗Ⅲ組蛋雞血清中免疫球蛋白與對照組、其他試驗組相比均顯著增加，表明3‰添加量的發(fā)酵黃芪制劑可顯著提高蛋雞的免疫水平，增強動物疾病抵抗力。

4 結(jié)論

4.1 本試驗結(jié)果顯示，在黃芪質(zhì)量濃度為8%、發(fā)酵時間為28 h、溫度36℃、pH為5.0時，解淀粉芽孢桿菌水8（BLCC1-0065）和地衣芽孢桿菌dy7（BLCC1-0014）兩株芽孢桿菌的活菌數(shù)與多糖增率均較高。

4.2 日糧中添加發(fā)酵黃芪制劑飼喂蛋雞后，能夠顯著提高蛋雞的免疫器官重量，對體液免疫也起到了一定的促進(jìn)作用，其中以3‰添加量的發(fā)酵黃芪制劑組效果最優(yōu)。

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This study was to optimize the fermentation conditions of Bacillus amyloliquefaciens and Bacillus licheniformis，to study the effect of Astragalus membranaceus fermentation preparation on immune function of brooding-laying hens.At first，the fermentation conditions for Astragalus membranaceus including incubation time，temperature and pH were explored to determine the optimal fermentation process，and the biomass and the increasing rate of Astragalus polysaccharides were taken as the indexes of evaluation.Then different dosages of fermented preparations were added into layer feed to evaluate the effect of immune function on brooding-laying hens.The results showed that the optimum fermentation conditions were initial pH 5.0，culture temperature 36 ℃，incubation time 28 h，inoculation of Astragalus mongholicus 8%.The spleen index of 3‰fermented Astragalus membranaceus group were 40.7%and 36.7%higher than that of the control group at the age of 35 and 42 days respectively.There was no significant difference in spleen index between the unleavened Astragalus group and the control group （P ＞ 0.05），which was significantly different from that of the 3‰ Astragalus membranaceus fermentation group（P ＜0.05）.The index of bursa of 3‰ fermented Astragalus membranaceus group were increased 24.8%and 22.37%compared with the control group and the unleavened Astragalus group at 35 days old （P ＜ 0.05）.The content of immunoglobulin in serum was significantly increased in 3‰ Astragalus membranaceus group （P ＜ 0.05）.The content of IgG in the 3‰fermented Astragalus membranaceus group were 12.3%and 14.5%higher than that of the control group at 35 and 42 days old，respectively （P ＜ 0.05）.In conclusion that the fermentation of Astragalus membranaceus could improve the immune function of brooding-laying hens.

Bacillus；Astragalus membranaceus；fermentation；brooding-laying hens；immune function

S816.6

A

1004-3314（2017）20-0014-05

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20172004

2013年泰安市科技發(fā)展計劃-社會發(fā)展領(lǐng)域關(guān)鍵技術(shù)研究與示范“飼用黃芪多糖的研制”（201340629）