李祥明，李會(huì)榮

（山東省飼料質(zhì)量檢驗(yàn)所，山東濟(jì)南 250022）

飼料中炔雌醚的液相色譜檢測(cè)方法研究

李祥明，李會(huì)榮

（山東省飼料質(zhì)量檢驗(yàn)所，山東濟(jì)南 250022）

本研究建立了飼料中炔雌醚含量的液相色譜檢測(cè)方法。飼料樣品用乙腈提取，經(jīng)離心和C18SPE小柱凈化，以C18柱（250 mm×4.6 mm×5 μm）為分離柱，紫外檢測(cè)器在230 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明：在所選擇的色譜條件下，炔雌醚在0.50～100.00 μg/mL時(shí)線性關(guān)系良好，最低定量限為1 mg/kg；添加回收率為89.5%～99.5%，變異系數(shù)為0.5%～5.20%。本方法樣品前處理簡(jiǎn)便、可靠，可用于各種飼料中炔雌醚的檢測(cè)。

飼料；炔雌醚；測(cè)定；液相色譜法

炔雌醚又名炔諾醚，炔雌醇環(huán)戊醚，3-環(huán)戊醚，17а-乙炔基雌烷二醇等，為白色的結(jié)晶或結(jié)晶性粉末?？稍谝掖肌⒈?、乙酸乙酯或三氯甲烷中溶解，在水中幾乎不溶（中華人民共和國(guó)國(guó)家藥典委員會(huì)，2005）。

炔雌醚在臨床上作為較強(qiáng)的口服長(zhǎng)效雌激素，其活性為炔雌醇的4倍，口服后經(jīng)胃腸道吸收，貯存于脂肪組織內(nèi)，緩慢釋放出炔雌醇，起主要的抗生育作用。農(nóng)業(yè)部第176號(hào)公告明確規(guī)定，禁止在動(dòng)物飼料和飲水中添加炔雌醚。目前鮮見(jiàn)飼料中炔雌醚檢測(cè)方法的研究報(bào)道。因此，本研究建立的炔雌醚檢測(cè)方法，可加強(qiáng)監(jiān)管部門(mén)對(duì)飼料中炔雌醚的監(jiān)督檢測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 分析純乙腈、甲醇，色譜純乙腈。

1.1.2 儀器和設(shè)備 分析天平（感量0.1 mg）；Agilent 1200液相色譜儀 （具有VWD檢測(cè)器）；離心機(jī)（Theremo G16）；氮吹儀；Agilent固相萃取裝置。

1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 炔雌醚標(biāo)準(zhǔn)品純度大于98%。1.1.3.1 炔雌醚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液 精密稱取炔雌醚標(biāo)準(zhǔn)品100 mg，置于10 mL容量瓶中，用色譜純乙腈定容，配成濃度為10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液。2～8℃冷藏保存，有效期為6個(gè)月。

1.1.3.2 炔雌醚標(biāo)準(zhǔn)中間溶液 準(zhǔn)確移取炔雌醚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液1 mL，置于10 mL容量瓶中，用色譜純乙腈定容至刻度。該溶液中炔雌醚的濃度為1 mg/mL。2～8℃冷藏保存，有效期為3個(gè)月。

1.1.3.3 炔雌醚標(biāo)準(zhǔn)工作溶液 準(zhǔn)確移取炔雌醚標(biāo)準(zhǔn)中間溶液適量，用色譜純乙腈稀釋成濃度分別為 0.50、1.00、5.00、10.00、20.00、50.00 μg/mL 和100.00 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2 方法

1.2.1 液相色譜條件的確定 目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)炔雌醚的研究主要在醫(yī)藥和化妝品檢測(cè)領(lǐng)域，檢測(cè)方法包括紫外分光光度法 （中華人民共和國(guó)國(guó)家藥典委員會(huì)，2005）、液相色譜法（劉紅菊等，2010；Tao等，2010）、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（黑龍江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局，2011）和氣相色譜質(zhì)譜法（林奕芝等，2009；林奕芝等，2006），本研究在參照液相色譜檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，對(duì)色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化和改進(jìn)，最終確定的條件為：色譜柱：C18柱長(zhǎng)250 mm，內(nèi)徑4.6 mm，粒徑5 μm，或其他效果等同的C18柱。柱溫：40℃。波長(zhǎng)：230 nm。流動(dòng)相：色譜純乙腈+水=80+20。 流速：1.0 mL/min。 進(jìn)樣量：50 μL。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，該色譜條件均能滿足色譜分析的需要。

圖1 炔雌醚標(biāo)準(zhǔn)工作溶液圖譜

1.2.2 試樣提取條件的確定 由于炔雌醚易在乙醇、丙酮、乙酸乙酯或三氯甲烷中溶解，在水中幾乎不溶的性質(zhì)，提取液只能在有機(jī)溶劑中選擇，考慮到實(shí)驗(yàn)室常用的試劑和每類試劑毒性的大小，選擇了甲醇和乙腈作為提取試劑進(jìn)行了比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相同的飼料樣品，甲醇作為提取液時(shí)，試樣中提取出的雜質(zhì)種類多且含量高，其回收率和乙腈基本相似。因此，選擇乙腈為提取液。甲醇和乙腈提取相同飼料樣品的圖譜見(jiàn)圖2和圖3。

圖2 甲醇提取的飼料樣品圖譜

用乙腈為提取液，分別用振蕩和超聲提取10、15、20 min 和 30 min。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用振蕩器振蕩比超聲波提取的回收率略高。振蕩20 min和30 min回收率基本相同，為了節(jié)約時(shí)間，選用振蕩20 min。最終確定的提取步驟為：稱取試樣5 g（精確至0.001 g）于50 mL離心管中，加入15.0 mL乙腈，充分振蕩20 min，然后靜置沉淀5 min，取4.0 mL上清液于20 mL試管中，加入12 mL水混勻，備用。

圖3 乙腈提取的飼料樣品圖譜

1.2.3 SPE凈化條件的確定 根據(jù)炔雌醚的理化性質(zhì)和極性，首先選擇了C18小柱進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)，選用不同的上樣溶劑、淋洗溶液和洗脫溶液，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同凈化條件結(jié)果比較

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，只有上樣溶劑中乙腈的比例小于30%時(shí)，炔雌醚才能完全吸附于填料上；淋洗溶液中乙腈的比例小于30%時(shí)，炔雌醚不會(huì)被洗脫下來(lái)。因此，吸取4.0 mL乙腈提取液中需加入12 mL水，使乙腈的比例為25%，上樣溶液中的炔雌醚才能充分吸附于填料上。當(dāng)溶液中乙腈的比例為10%時(shí)，回收率和乙腈比例為25%的基本相同，考慮到過(guò)SPE小柱更節(jié)約時(shí)間的情況下，選擇乙腈的比例為25%，即吸取4.0 mL乙腈提取液中加入12 mL水。淋洗溶液選用1+3的乙腈水溶液，保證了淋洗時(shí)目標(biāo)物不會(huì)被洗脫。淋洗液中乙腈比例低于25%時(shí)，洗脫雜質(zhì)的效果降低。洗脫溶液中乙腈和甲醇的回收率相同，為了和流動(dòng)相一致，故選用乙腈為洗脫液。最終確定的凈化條件為：固相萃取C18小柱用3 mL甲醇、3 mL水活化。將提取溶液過(guò)柱（流速＜1 mL/min），用3 mL乙腈溶液（1+3）淋洗，用3 mL乙腈洗脫，收集洗脫液，氮吹儀上（50℃）至干，用1.00 mL乙腈溶解，過(guò)0.22 μm濾膜后上機(jī)測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液線性 將濃度分別為0.50、1.00、5.00、10.00、20.00、50.00 μg/mL 和 100.00 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，每個(gè)濃度連續(xù)進(jìn)樣3次，按平均值計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線線性。線性范圍為0.50～100.00 μg/mL，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線y炔雌醚=62.7x+8.9648，線性相關(guān)系數(shù)R2=1.000。結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 炔雌醚標(biāo)準(zhǔn)曲線線性

2.2 方法線性實(shí)驗(yàn) 用蛋雞配合飼料分別做1、5、10、20 mg/kg和50 mg/kg的添加實(shí)驗(yàn)，其添加濃度和峰面積的線性見(jiàn)圖5。線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9992。

圖5 炔雌醚方法線性

2.3 方法檢出限和定量限實(shí)驗(yàn) 在空白的蛋雞配合飼料、肉牛精料補(bǔ)充料、豬濃縮飼料和豬預(yù)混合飼料中添加不同濃度的炔雌醚。添加回收實(shí)驗(yàn)表明，在添加濃度為0.50 mg/kg時(shí)，由于前處理過(guò)程要稀釋，即上機(jī)試液中炔雌醚的濃度大約為0.60 μg/mL，而配合飼料由于提取出的其他干擾物質(zhì)含量較高，致使信噪比 S/N（Peak to Peak）＜10，炔雌醚的回收率均低于70%。因此本方法的檢出限定為0.5 mk/kg，定量限定為1 mg/kg。0.5 μg/mL炔雌醚標(biāo)樣的圖譜見(jiàn)圖6；蛋雞配合飼料空白和添加圖譜見(jiàn)圖7和圖8；肉牛精料補(bǔ)充料的空白和添加圖譜見(jiàn)圖9和圖10；豬濃縮飼料的空白和添加圖譜見(jiàn)圖11和圖12；豬預(yù)混合飼料空白和添加圖譜見(jiàn)圖13和圖14。

圖6 0.5 μg/mL炔雌醚標(biāo)樣

圖7 空白蛋雞配合飼料圖譜

圖8 蛋雞配合飼料1mg/kg炔雌醚添加圖譜

圖9 空白肉牛精料補(bǔ)充料圖譜

圖10 肉牛精料補(bǔ)充料1 mg/kg炔雌醚添加圖譜

圖11 空白豬濃縮飼料圖譜

圖12 豬濃縮飼料1 mg/kg炔雌醚添加圖譜

表2 不同飼料中添加炔雌醚回收率%

圖13 空白豬預(yù)混合飼料圖譜

圖14 豬預(yù)混合飼料1 mg/kg炔雌醚添加圖譜

2.4 方法準(zhǔn)確度和精密度實(shí)驗(yàn) 選擇空白對(duì)蝦配合飼料、蛋雞配合飼料、肉牛精料補(bǔ)充料、豬濃縮飼料和育肥豬預(yù)混合飼料進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)。在上述飼料中分別加入適宜體積的炔雌醚標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，使其添加濃度均為1、5、10 mg/kg和50 mg/kg，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)表2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法添加回收率為89.5%～99.5%，變異系數(shù)為0.5%～5.20%。方法適用的范圍為畜禽、水產(chǎn)配合飼料、精料補(bǔ)充料、濃縮飼料和預(yù)混合飼料。

3 結(jié)論

本研究建立的飼料中炔雌醚液相色譜檢測(cè)方法，樣品的提取和凈化步驟科學(xué)合理，易于掌握，測(cè)試數(shù)據(jù)重復(fù)性好，添加回收率均可滿足分析實(shí)驗(yàn)要求，可很好的滿足飼料中炔雌醚的測(cè)定要求。

[1]黑龍江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局.飼料中炔雌醚的測(cè)定，液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法[S].DB23/T 1435-2011.

[2]劉紅菊，閆沖，劉宏果.反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定飼料中的10種性激素[J].中國(guó)飼料，2010，18：34 ～ 36.

[3]林奕芝，司徒潮滿，劉奮，等.深圳市市售肥牛、羊肉中雌激素殘留狀況分析[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2009，36（6）：1168 ～ 1169.

[4]林奕芝，張世英，梁偉，等.深圳市肉與肉制品中激素殘留狀況分析[J].中國(guó)衛(wèi)生檢疫雜志，2006，13（3）：271 ～ 272.

[5]中華人民共和國(guó)國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.360.

[6]Tao Tang，Pingliang Li，laixin Luo.Development and validation of a HPLC method for determination of levonorgestrel and quinestrol in rat plasma[J].Chromatography，2010，24：706 ～ 710.■

The study established a liquid phase chromatographic method for determination of quinestrol in feed.Feed samples were firstly extracted by acetonitrile，then purification with C18SPE column，after being isolated by C18（250 mm×4.6 mm×5 μm）column，eventually detected by UV detector at 230 nm，and were quantified by external standard method.The results showed that under the selected chromatographic conditions，quinestrol was linear in the range of 0.50 ～ 100.00 μg/mL，and the lowest determination limit was 1 mg/kg.The relative standard deviation （RSD）was 0.5% ～5.20%when the recovery rate was 89.5% ～ 99.5%.The method was proved to be simple，rapid and resproducible for determination of quinestrol in feed.

feed；quinestrol；determination；liquid phase chromatographic method

S816.17

A

1004-3314（2017）20-0028-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20172007